一种快速促进雨生红球藻内虾青素积累的方法
阅读说明：本技术 一种快速促进雨生红球藻内虾青素积累的方法 (Method for rapidly promoting accumulation of astaxanthin in haematococcus pluvialis ) 是由 刘建国 于文杰 张立涛 于 2021-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速促进雨生红球藻内虾青素积累的方法,将雨生红球藻细胞培养达到平台期后,将雨生红球藻细胞离心并接至新的培养基中,形成雨生红球藻藻液,向雨生红球藻藻液中添加草酰乙酸钠,在光诱导下促进虾青素的积累。本发明所公开的方法可极显著加快雨生红球藻细胞内积累虾青素,大幅缩短诱导时间和培养周期,有利于提升大规模商业化培养雨生红球藻生产虾青素的产量,明显提升经济效益。(The invention discloses a method for rapidly promoting astaxanthin accumulation in haematococcus pluvialis, which comprises the steps of culturing haematococcus pluvialis cells to a plateau period, centrifuging the haematococcus pluvialis cells and connecting the haematococcus pluvialis cells to a new culture medium to form haematococcus pluvialis algae liquid, adding sodium oxaloacetate into the haematococcus pluvialis algae liquid, and promoting the accumulation of astaxanthin under light induction. The method disclosed by the invention can remarkably accelerate the astaxanthin accumulation in haematococcus pluvialis cells, greatly shorten the induction time and the culture period, is favorable for improving the yield of astaxanthin produced by large-scale commercial culture of haematococcus pluvialis, and obviously improves the economic benefit.)
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一种快速促进雨生红球藻内虾青素积累的方法。
背景技术
虾青素是一种在自然界中广泛存在的类胡萝卜素。作为有效的着色剂和强氧化剂，虾青素在食品营养、医药保健、水产养殖及化妆品等多个行业都具有应用潜力。目前市场上应用的虾青素主要分为人工合成和天然两种来源。随着生活水平的提高，人们对食品安全问题愈发重视，天然来源的虾青素因具有安全、稳定、活性强等特点受到更多的关注。雨生红球藻是一种单细胞绿藻，在逆境条件下能够合成并积累大量虾青素，被认为是最主要的天然虾青素来源。由于天然虾青素的市场需求旺盛，快速、有效地提高雨生红球藻的虾青素产量已成为当下研究的热点。
目前，促进雨生红球藻中虾青素积累最常用的方法是外源施加诱导剂与高光、缺氮等胁迫条件相结合。然而，许多诱导剂虽能促进雨生红球藻中虾青素的合成，但因其成本高、不易获得、安全隐患等问题而不能实现大规模商业化应用。此外，诱导时间也是影响雨生红球藻虾青素生产效率和成本的主要因素。因此，选择安全、经济的诱导剂以快速、高效地提高雨生红球藻中虾青素产量并投入工业化生产对实现虾青素的规模化开发利用具有非常重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速促进雨生红球藻内虾青素积累的方法，以达到快速提高虾青素产量，优化生产效率的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种快速促进雨生红球藻内虾青素积累的方法，将雨生红球藻细胞培养达到平台期后，将雨生红球藻细胞离心并接至新的培养基中，形成雨生红球藻藻液，向雨生红球藻藻液中添加草酰乙酸钠，在光诱导下促进虾青素的积累。
上述方案中，每升雨生红球藻藻液中添加1-20mM的草酰乙酸钠。
上述方案中，所述新的培养基为正常或缺氮的培养基。
优选地，所述培养基为MCM培养基。
上述方案中，所述光诱导的光照强度为50μmol/m2/s以上。
优选地，所述光诱导的光照强度为100μmol/m2/s。
上述方案中，所述光诱导时的温度为25±3℃。
通过上述技术方案，本发明提供的一种快速促进雨生红球藻内虾青素积累的方法具有如下有益效果：
本发明在培养雨生红球藻过程中外源添加草酰乙酸钠，其在正常培养及缺氮培养条件下均可通过提高底物(丙酮酸、3-磷酸甘油醛)的水平来促进虾青素前体的合成，进而明显提高雨生红球藻内虾青素的含量；该方法添加物用量少，诱导时间短，成本低，有利于大规模商业化利用雨生红球藻，提高雨生红球藻生产虾青素的经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例1-3以及对比例1-2所述的接种到新的正常MCM培养基后，外源添加终不同浓度的草酰乙酸钠对雨生红球藻虾青素积累的影响。
图2为本发明实施例4-6以及对比例3-4所述的接种到新的缺氮MCM培养基后，外源添加终不同浓度的草酰乙酸钠对雨生红球藻虾青素积累的影响。
图3为本发明实施例2、5以及对比例1、3所述的接种到新的正常或缺氮MCM培养基后，外源添加终浓度为10mM的草酰乙酸钠在第三天时对雨生红球藻内丙酮酸的相对含量的影响。
图4为本发明实施例2、5以及对比例1、3所述的接种到新的正常或缺氮MCM培养基后，外源添加终浓度为10mM的草酰乙酸钠在第三天时对雨生红球藻内3-磷酸甘油醛的相对含量的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中用到的正常的和缺氮的MCM培养基配方如下：
表1正常的MCM培养基配方
表2缺氮的MCM培养基配方
成分
浓度(mg/L)
成分
浓度(μg/L)
KCl
147.48
ZnCl<sub>2</sub>
4.1
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
20
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
61
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
100
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
5.1
CaCl<sub>2</sub>
40.5
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
6.0
Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O
3.36
MnCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
4.1
FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O
2.44
(NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
38
实施例1
首先，用正常的MCM培养基(见表1)将雨生红球藻细胞在温度为25℃、光强为20μmol/m2/s、光暗比为12h/12h的条件下培养至平台期(雨生红球藻细胞的生长速率不再增加)。将平台期的雨生红球藻细胞离心并接至新的正常MCM培养基中(见表1)，得到细胞密度为5.9万个细胞/mL的雨生红球藻藻液。随后，外源添加草酰乙酸钠，使得每升藻液中草酰乙酸钠的含量为1mM，在温度为25℃、光强为100μmol/m2/s、光暗比为12h/12h的条件下诱导虾青素积累。
实施例2
操作同实施例1，区别仅在于每升藻液中草酰乙酸钠的含量为10mM。
实施例3
操作同实施例1，区别仅在于每升藻液中草酰乙酸钠的含量为20mM。
实施例4
首先，用正常的MCM培养基将雨生红球藻细胞在温度为25℃、光强为20μmol/m2/s、光暗比为12h/12h的条件下培养至平台期。将平台期的雨生红球藻细胞离心并接至新的缺氮MCM培养基中(见表2)，得到细胞密度为6.3万个细胞/mL的雨生红球藻藻液。随后，添加草酰乙酸钠，使得每升藻液中草酰乙酸钠的含量为1mM，在温度为25℃、光强为100μmol/m2/s、光暗比为12h/12h的条件下诱导虾青素积累。
实施例5
操作同实施例4，区别仅在于每升藻液中草酰乙酸钠的含量为10mM。
实施例6
操作同实施例4，区别仅在于每升藻液中草酰乙酸钠的含量为20mM。
对比例1
操作同实施例1，区别仅在于不添加草酰乙酸钠，作为对照组。
对比例2
操作同实施例1，区别仅在于每升藻液中草酰乙酸钠的含量为0.1mM。
对比例3
操作同实施例4，区别仅在于不添加草酰乙酸钠，作为对照组。
对比例4
操作同实施例4，区别仅在于每升藻液中草酰乙酸钠的含量为0.1mM。
虾青素含量检测：
对实施例1-3以及对比例1、2在正常MCM培养基中进行光诱导的雨生红球藻分别在培养的第3天和第7天采用紫外分光光度计法进行虾青素含量的检测，检测结果见图1。
由图1可见，培养至第7天时，与对比例1(未添加草酰乙酸钠)相比，实施例1外源添加1mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中，单位藻细胞虾青素含量提高了约1.56倍，表明在正常的MCM培养基中，添加1mM草酰乙酸钠可以明显促进正常培养条件下雨生红球藻细胞内虾青素的积累，缩短培养时间。
与对比例1(未添加草酰乙酸钠)相比，培养至第3天时，实施例2外源添加10mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中，单位藻细胞虾青素含量提高了约0.96倍，培养至第7天时，外源添加10mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中，单位藻细胞虾青素含量提高了约2.5倍，表明在正常的MCM培养基中，添加10mM草酰乙酸钠可以明显促进正常培养条件下雨生红球藻虾青素的积累，缩短培养时间。
与对比例1(未添加草酰乙酸钠)相比，培养至第3天时，实施例3外源添加20mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中单位藻细胞虾青素含量提高了约1.8倍，培养至第7天时，外源添加20mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中单位藻细胞虾青素含量提高了约2.3倍，表明在正常的MCM培养基中，添加20mM草酰乙酸钠可以明显促进正常培养条件下雨生红球藻虾青素的积累，缩短培养时间。
培养至第7天时，对比例2中添加了0.1mM草酰乙酸钠的藻细胞内虾青素含量与未添加草酰乙酸钠的藻细胞内虾青素含量之间无显著差异，表明在正常的MCM培养基中，添加的草酰乙酸钠量太少时，对虾青素的积累不会起到促进作用。
对实施例4-6以及对比例3、4在缺氮的MCM培养基中进行光诱导的雨生红球藻分别在培养的第3天和第7天采用紫外分光光度计法进行虾青素含量的检测，检测结果见图2。
由图2可见，与对比例3(未添加草酰乙酸钠)相比，培养至第3天时，实施例4外源添加1mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中，单位藻细胞虾青素含量提高了约0.93倍，培养至第7天时，外源添加1mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中，单位藻细胞虾青素含量提高了约3.7倍，表明在缺氮的MCM培养基中，添加1mM草酰乙酸钠可以明显促进正常培养条件下雨生红球藻虾青素的积累，缩短培养时间。
与对比例3(未添加草酰乙酸钠)相比，培养至第3天时，实施例5外源添加10mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中单位藻细胞虾青素含量提高了约4.3倍，培养至第7天时，外源添加10mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中单位藻细胞虾青素含量提高了约7.2倍，表明在缺氮的MCM培养基中，添加10mM草酰乙酸钠可以明显促进正常培养条件下雨生红球藻虾青素的积累，缩短培养时间。
与对比例3(未添加草酰乙酸钠)相比，培养至第3天时，实施例6外源添加20mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中单位藻细胞虾青素含量提高了约4.4倍，培养至第7天时，外源添加20mM草酰乙酸钠的雨生红球藻中单位藻细胞虾青素含量提高了约4.0倍，表明在缺氮的MCM培养基中，添加20mM草酰乙酸钠可以明显促进正常培养条件下雨生红球藻虾青素的积累，缩短培养时间。
培养至第7天时，对比例4添加了0.1mM草酰乙酸钠的藻细胞内虾青素含量与未添加草酰乙酸钠的藻细胞内虾青素含量之间无显著差异，表明在缺氮的MCM培养基中，添加的草酰乙酸钠量太少时，对虾青素的积累不会起到促进作用。
在雨生红球藻中，虾青素的合成前体异戊烯焦磷酸(IPP)是以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为底物通过甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径合成的。基于超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)平台，检测了实施例2、5以及对比例1、3在培养至第3天时，雨生红球藻细胞内丙酮酸和3-磷酸甘油醛的相对含量。由图3和图4可见，与对照组相比，无论在正常或缺氮培养条件下，外源添加草酰乙酸钠的雨生红球藻中丙酮酸和3-磷酸甘油醛含量均显著增加，表明草酰乙酸钠明显提高了雨生红球藻中虾青素合成所需底物的水平，因此，在合适的浓度范围内，草酰乙酸钠可快速促进虾青素的合成。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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