具体实施方式

定义

在进一步详细讨论本发明之前，将首先定义以下术语和约定：

除非另外指明或通过引用的上下文有明显相反表示，否则对本发明的单数特征或限制的所有引用应包括相应的复数特征或限制，反之亦然。

除非另有说明，否则本文所指的所有百分比均为重量百分比。另外，术语“以干物质的重量计”和“以干物质计”是指相同的概念并且可以互换使用。

例如1％w/w中的术语“w/w”是指包含1重量％的化合物的组合物。

术语“适口的”是指具有足够好的可以食用和/或饮用的味道，即具有人类消费者可接受或满意的味道。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

乳清蛋白溶液：

在本发明的上下文中，“乳清蛋白溶液”中的术语“溶液”包括含有液体和固体化合物或半固体颗粒(例如蛋白质颗粒)的组合的组合物。因此，“溶液”可以是悬浮液或甚至浆液。然而，“乳清蛋白溶液”优选是可泵送的并且乳清蛋白溶液中的液体量优选为70-98％，更优选为80-96％。用于乳清蛋白溶液的液体通常是水。

乳清蛋白溶液通常包含乳清蛋白溶液的2重量％或更多的量的蛋白质。在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液包含乳清蛋白溶液的2-20重量％范围内的蛋白质。优选地，乳清蛋白溶液包含乳清蛋白溶液的5-15重量％的量的蛋白质。

用于水解的乳清蛋白溶液是通过将包含乳清蛋白的组合物分散在液体(如水)中而获得的。优选地，乳清蛋白溶液通过将奶清蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、奶清蛋白分离物和/或乳清蛋白分离物中的任一种与水混合来制备。因此，在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液包含奶清蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、奶清蛋白分离物和/或乳清蛋白分离物。

本发明的乳清蛋白溶液包含以总固体含量计至少50重量％的量的乳清蛋白。如果乳清蛋白的含量低于总固体含量的50％，则总体分子组成(蛋白质、碳水化合物、脂质和矿物质之间的比例)会不同，酶的行为可能不同，因此获得的产品也会不同。

除了乳清蛋白之外，乳清蛋白溶液还可以包含少量的其他蛋白质，例如酪蛋白。

除了蛋白质之外，乳清蛋白溶液通常还包含其他成分。乳清蛋白溶液可包含通常在乳清或奶清中存在的其他成分，例如矿物质、碳水化合物和/或脂质。替代地或另外地，乳清蛋白溶液可包含乳清或奶清中非天然的组分。然而，此类非天然乳组分对于在食品生产中使用应是适合的且安全的。

以总固体含量计，乳清蛋白溶液中蛋白质的含量越低，脂质、碳水化合物(主要是乳糖)和其他蛋白质的含量相较于乳清蛋白就越高。

乳清蛋白溶液可以例如包含碳水化合物，例如乳糖、寡糖和/或乳糖的水解产物(即葡萄糖和半乳糖)。乳清蛋白溶液可以例如包含以总固体含量计0-10重量％范围内的碳水化合物。

乳清蛋白分离物(WPI)和奶清蛋白分离物(SPI)包含非常少量的碳水化合物，例如乳糖。因此，当使用WPI或SPI制备乳清蛋白溶液时，乳清蛋白溶液中碳水化合物的含量在以总固体含量计0-1重量％的范围内。如果使用乳清蛋白浓缩物(WPC)或奶清蛋白浓缩物(SPC)制备乳清蛋白溶液，则乳清蛋白溶液中碳水化合物的量优选在以总固体含量计2-8重量％的范围内。

乳清蛋白溶液还可以包含脂质，例如甘油三酯和/或其他类型的脂质(例如磷脂)的形式。

在本发明的上下文中，术语“脂肪”和“脂质”具有相同的含义并且可以互换使用。

根据本发明所述的乳清蛋白溶液包含以总固体含量计至少50％的量的乳清蛋白。

如果乳清蛋白溶液中的蛋白质含量低于总固体含量的50％，则水解后得到的乳清蛋白水解物可能不具有本发明的乳清蛋白水解物的特征，即在4％的蛋白质溶液中没有令人不快的苦味、水解度在15％以上、游离氨基酸的量为15重量％或更少以及分子量为2500Da或更高的肽占肽总量的25重量％或更少。

乳清蛋白含量以总固体含量计低于50％的乳清蛋白溶液将包含大量矿物质、脂肪和碳水化合物。不希望制备乳清蛋白含量低于固体含量的50重量％和具有大量矿物质、脂肪和碳水化合物的乳清蛋白水解物。不受任何理论的束缚，本发明的发明人相信矿物质可能影响一些酶的活性。这也适用于脂质和碳水化合物。大量的脂质、矿物质和碳水化合物也可能影响获得的乳清蛋白水解物的味道和浊度。

优选地，乳清蛋白溶液包含以总固体含量计的至少60重量％的量的乳清蛋白，例如以总固体含量计的至少70重量％，甚至更优选地，以总固体含量计的至少80重量％。在本发明的更优选的实施方案中，乳清蛋白溶液包含以总固体含量计的至少85重量％的量的乳清蛋白，最优选地，乳清蛋白溶液包含以总固体含量计的至少90重量％的量的乳清蛋白。

乳清蛋白溶液中存在的蛋白质应该主要是乳清蛋白。然而，可能存在少量其他蛋白质，例如酪蛋白。因此，在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液包含以蛋白质的总量计90重量％或更多的乳清蛋白。优选地，乳清蛋白溶液包含以蛋白质的总量计95重量％或更多的乳清蛋白。因此，在本发明的其他实施方案中，乳清蛋白溶液包含以蛋白质的总量计的至多10重量％的酪蛋白或其他非乳清蛋白，优选以蛋白质的总量计的至多5重量％，更优选至多3重量％的酪蛋白或其他非乳清蛋白。

如果乳清蛋白溶液中脂肪含量高，会影响所得蛋白水解物的澄清度和味道。因此，在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液包含以总固体含量计的至多10重量％的量的脂质，例如以总固体含量计的至多8重量％，甚至更优选地，乳清蛋白溶液包含以总固体含量计的至多6重量％的量的脂质。

如果使用乳清蛋白浓缩物制备乳清蛋白溶液，脂质/脂肪含量为总固体含量的大约6-8重量％。相反，如果使用乳清蛋白分离物制备乳清蛋白溶液，则乳清蛋白溶液基本上不含脂肪。

在本发明的优选实施方案中，乳清蛋白溶液基本上不含脂肪。术语“基本上不含脂肪”是指乳清蛋白溶液中的脂质含量以总固体含量计低于1重量％，优选低于以总固体含量计的0.5重量％，甚至更优选低于0.1重量％。

如果乳清蛋白溶液中的脂肪含量低，例如以总固体含量计的至多0.5％，则根据本发明方法制备的乳清蛋白水解物外观澄清。优选地，乳清蛋白溶液中的脂质含量小于总固体含量的0.3重量％，更优选小于以总固体含量计的0.2重量％的脂质。

在本发明的优选实施方案中，乳清蛋白水解物是通过使用乳清蛋白分离物和/或奶清蛋白分离物的乳清蛋白溶液获得的。当使用乳清蛋白分离物和/或奶清蛋白分离物进行水解时，脂肪含量会很低(低于0.5％)。这使得制备的乳清蛋白水解物不仅具有高水解度(DH>15％)和良好的口感，而且外观澄清，而无需任何超滤步骤。优选地，乳清蛋白溶液是混合在水中的乳清蛋白分离物或奶清蛋白分离物。

乳清蛋白：

在本发明的一个方面，乳清蛋白水解物通过水解包含乳清蛋白的溶液获得。

在本发明的上下文中，术语“乳清蛋白”涉及存在于乳清或奶清中的蛋白质。乳清蛋白溶液的乳清蛋白可以是在乳清或奶清中发现的蛋白质种类的子集，或者它可以是在乳清和/或奶清中发现的蛋白质种类的完整集合。乳清蛋白是从乳清中分离的球状蛋白的混合物，乳清是作为奶酪生产的副产品产生的液体物质。乳清蛋白是存在于牛乳或凝乳的乳清相中的蛋白质。牛乳清相中除乳清蛋白外的蛋白质有时也被称为牛乳清蛋白质。

术语“奶清”涉及从牛奶中例如通过微滤或大孔超滤去除酪蛋白和乳脂肪球后剩余的液体。奶清也可称为“理想乳清”。

术语“奶清蛋白”或“清蛋白”涉及存在于奶清中的蛋白质。

术语“乳清”涉及牛奶中的酪蛋白沉淀和去除后留下的液体上清液。酪蛋白沉淀可以例如通过牛奶的酸化和/或通过使用凝乳酶来完成。

存在多种类型的乳清，例如甜乳清、酸乳清和酪蛋白乳清。

本发明的乳清蛋白溶液中存在的乳清蛋白可以来自不同来源的乳清，例如酪蛋白乳清、酸乳清或甜乳清。

在本发明的一个优选实施方案中，乳清蛋白溶液中的乳清蛋白来自甜乳清。甜乳清主要包含蛋白质β-乳球蛋白(BLG)、α-乳白蛋白(ALA)和酪蛋白巨肽(CMP)。然而，甜乳清可能包含其他蛋白质，例如免疫球蛋白、骨桥蛋白、乳铁蛋白和脂肪球膜蛋白。酪蛋白乳清或酸乳清中不存在CMP。在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液中的乳清蛋白来自已完全或部分去除CMP的甜乳清。这可以称为改性甜乳清。从甜乳清中去除CMP会产生苏氨酸和色氨酸含量接近人乳的蛋白质材料。

在本发明的上下文中，术语“β-乳球蛋白”也可称为“BLG”。这些术语可以互换使用并且涉及来自哺乳动物物种的BLG。此外，术语“α-乳白蛋白”在本发明的上下文中可被称为“ALA”并且涉及来自哺乳动物物种的α-乳白蛋白。

如本文所用，术语“甜乳清”是指在制造凝乳型奶酪的过程中将牛奶凝结并过滤后残留的液体。“甜乳清”是在诸如切达乳酪或瑞士乳酪的凝乳型硬乳酪生产过程中获得的。甜乳清是通过向牛奶组合物中添加凝乳酶而获得的，该酶将κ-酪蛋白裂解为副κ-酪蛋白和肽酪蛋白巨肽(CMP)，从而使酪蛋白胶束不稳定并导致酪蛋白沉淀。凝乳酶沉淀的酪蛋白周围的液体称为甜乳清。甜乳清的pH值可以是5.2-6.7。

甜乳清是一种来自奶酪生产的产品，其包含约10-15重量％的蛋白质和约75-80％的乳糖。甜乳清中的蛋白质主要是乳清蛋白，但也可能存在少量酪蛋白。乳清蛋白包括β-乳球蛋白(约55-65％)、α-乳白蛋白(约18-25％)、牛血清白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白巨肽(CMP)、骨桥蛋白、乳铁蛋白和乳脂肪球膜蛋白。

术语“酪蛋白乳清”(有时也被称为酸乳清或酸性乳清)涉及从酪蛋白/酪蛋白酸盐生产获得的乳清。在本发明的上下文中，酪蛋白乳清与酸性乳清不同。酪蛋白乳清是通过微滤分离酪蛋白/酪蛋白酸盐后获得的乳清部分。酪蛋白乳清不包含CMP。

术语酸性乳清用于在酸型乳酪(如白软乳酪和夸克)生产过程中获得的乳清。在酸型奶酪的制备中，酪蛋白通过酸沉淀从牛奶中去除，即，将牛奶的pH值降低到pH 4.6以下，这是酪蛋白的等电点，并引起酪蛋白胶束分解和沉淀。pH值通常降低到3.8-4.6的范围内。酸性沉淀酪蛋白周围的液体通常称为酸性乳清，并且不含CMP。

在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液中使用的乳清蛋白不是酸性乳清或酪蛋白乳清。

本发明的乳清蛋白溶液中使用的乳清蛋白可以是乳清蛋白浓缩物(WPC)、奶清蛋白浓缩物(SPC)、乳清蛋白分离物(WPI)或奶清蛋白分离物(SPI)。乳清蛋白浓缩物和乳清蛋白分离物之间的区别是产物的组成，特别是蛋白质含量。乳清蛋白分离物比浓缩物更纯净，并且其他非蛋白质成分已被部分去除以“分离”乳清蛋白。因此，乳清蛋白分离物具有更高百分比的蛋白质，并且可以足够纯净以几乎不含乳糖、不含碳水化合物、不含脂肪和不含胆固醇。

在本上下文中，术语“乳清蛋白浓缩物(WPC)”和“清蛋白浓缩物(SPC)”包括乳清蛋白的干燥和液体组合物。本发明使用的WPC和SPC中的蛋白质含量不低于以总固体含量计的50重量％。然而，乳清蛋白浓缩物可以包含更高含量的乳清蛋白，例如以干物质含量计为80重量％的乳清蛋白。液体乳清的干燥部分是通过从乳清中除去足够的非蛋白质成分而获得的，使得干燥产物包含不少于50重量％的乳清蛋白。

本发明中使用的WPC或SPC通常包括：

相对于总固体含量的50-89重量％的蛋白质

相对于总蛋白质含量的15-80重量％的BLG

相对于总蛋白质含量的8-50重量％的ALA

相对于总蛋白质含量的0-25重量％的CMP。

替代地，但也优选的是包含以下的WPC或SPC：

相对于总固体含量的50-89重量％的蛋白质

相对于总蛋白质含量的15-80重量％的BLG

相对于总蛋白质含量的4-50重量％的ALA

相对于总蛋白质含量的0-25重量％的CMP。

优选地，WPC或SPC包括：

相对于总固体含量的50-89重量％的蛋白质

相对于总蛋白质含量的15-80重量％的BLG

相对于总蛋白质含量的4-50重量％的ALA

相对于总蛋白质含量的0-25重量％的CMP。

更优选地，WPC或SPC包括：

相对于总固体含量的70-89重量％的蛋白质

相对于总蛋白质含量的30-80重量％的BLG

相对于总蛋白质含量的4-35重量％的ALA

相对于总蛋白质含量的0-25重量％的CMP。

术语“乳清蛋白分离物”和“清蛋白分离物”涉及干燥或液体组合物，其通常被认为几乎不含乳糖和胆固醇并且具有以总固体含量计的至少90重量％的乳清蛋白含量。乳清蛋白分离物可以例如包含以总固体含量计的92重量％或更高的乳清蛋白。优选地，WPI和SPI包含以总固体含量计的90-100重量％的蛋白质，例如以总固体含量计的92-99重量％的蛋白质。

WPI或SPI可以优选包括：

相对于总固体含量的90-100重量％的蛋白质

相对于总蛋白质含量的15-80重量％的BLG

相对于总蛋白质含量的8-50重量％的ALA

相对于总蛋白质含量的0-25重量％的CMP。

替代地，并且优选的，WPI或SPI可以包含：

相对于总固体含量的90-100重量％的蛋白质

相对于总蛋白质含量的30-80重量％的BLG

相对于总蛋白质含量的4-35重量％的ALA

相对于总蛋白质含量的0-25重量％的CMP。

优选地，WPI可以优选包括：

相对于总固体含量的90-100重量％的蛋白质

相对于总蛋白质含量的60-80重量％的BLG

相对于总蛋白质含量的10-20重量％的ALA

相对于总蛋白质含量的10-20重量％的CMP。

在本发明的实施方案中，用于制备根据本发明所述的乳清蛋白水解物的乳清蛋白溶液包含干物质的50-95重量％的乳清蛋白总量，例如70-97重量％，优选72-95重量％，甚至更优选干物质的75-95重量％。

可以使用任何合适的乳清蛋白源来制备根据本发明所述的乳清蛋白溶液。根据本发明所述的乳清蛋白溶液中使用的乳清蛋白优选为来自哺乳动物乳汁的乳清蛋白，例如来自牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、雌马、马和/或鹿的乳。在本发明的一些优选的实施方案中，所述乳清蛋白来自牛(奶牛)乳。

优选地，乳清蛋白溶液是脱矿质乳清蛋白溶液。优选地，乳清蛋白溶液中矿物质的含量低，因为从营养和健康的角度来看，蛋白质水解物中优选低浓度的矿物质，如钠、钙、钾、镁和磷酸盐。此外，包括钠和钙在内的矿物质可能与乳清蛋白相互作用并影响乳清蛋白水解物的产品浊度、聚集行为和耐热性。在高浓度下，包括尤其是钠、钙和锌的一些矿物质可能会抑制或促进一些蛋白酶的蛋白水解活性，因此高浓度的这些离子的存在可能会改变蛋白酶的协同裂解模式。因此，在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液中矿物质的含量以总固体含量计为10％或更少，更优选为8％或更少。在本发明的上下文中，术语“矿物质”是指灰分含量。术语“矿物质”和“灰分”可以互换使用并且指代相同。因此，关于乳清蛋白溶液的矿物质含量，应理解为乳清蛋白溶液的灰分含量。

在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液包含总蛋白质含量的30重量％或更多的BLG，例如40重量％或更多的BLG。更优选地，乳清蛋白溶液包含以总蛋白质含量计的50重量％或更多的BLG，甚至更优选地，乳清蛋白溶液包含以总蛋白质含量计的55重量％或更多的BLG。在本发明的另一实施方案中，乳清蛋白溶液包含以总蛋白质含量计的30-95重量％的BLG，例如以总蛋白质含量计的40-90重量％的BLG，甚至更优选地，以总蛋白质含量计的45-80重量％的BLG。

在本发明的上下文中，术语“乳清”涉及当从牛奶中除去酪蛋白时剩下的液体组合物。酪蛋白可例如通过微滤除去，以提供不含或基本不含胶束酪蛋白但含有天然乳清蛋白的液体渗透物。这种液体渗透物有时被称为理想乳清、清或奶清。

乳清蛋白溶液的蛋白质优选尽可能接近其天然状态，并且优选仅经受温和的热处理(如果有的话)。

酶促水解：

根据本发明所述的方法中的步骤b)涉及对乳清蛋白溶液进行酶促水解，其中酶促水解是使用以下酶组合的任意一种进行的：

i.包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种胰蛋白酶样蛋白酶的酶组合

ii.包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的酶组合

iii.包含至少一种来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶、至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶和至少菠萝蛋白酶的酶组合。

本发明的发明人惊奇地发现，通过添加上述三种酶组合中的任何一种对乳清蛋白溶液进行酶促水解，将产生具备以下特征的乳清蛋白水解物：水解度高于15％，游离氨基酸含量为15％或更低，并且其中乳清蛋白水解物具有可接受的味道和低含量的苦味肽。本发明人已经发现，通过用上述酶组合i至iii水解制备的乳清蛋白水解物在4％w/w蛋白溶液中没有苦味。

在本发明的步骤c)中，当水解度(DH)为15％或更高时，通过使酶失活来停止酶促水解以获得乳清蛋白水解物。水解度(DH)定义为原始蛋白质中已被水解所裂解的肽键的百分比。

在本发明的实施方案中，来自曲霉的丝氨酸内肽酶是来自米曲霉(Aspergillusoryzae)和/或黄曲霉(Aspergillus flavus)的丝氨酸内肽酶。来自曲霉的丝氨酸内肽酶优选是枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)。

在本发明的实施方案中，酶组合i)还包含来自芽孢杆菌属的金属内肽酶，例如杆菌蛋白酶。因此，在一个实施方案中，酶组合i)包括：

-至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种胰蛋白酶样蛋白酶

在本发明的其他实施方案中，酶组合ii)可能包含来自芽孢杆菌属的金属内肽酶，例如杆菌蛋白酶。因此，在一个实施方案中，酶组合ii)包括：

-至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶

在本发明的实施方案中，来自曲霉的亮氨酰氨肽酶来自米曲霉。

在一个实施方案中，来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶是枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶优选来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

在本发明的另一个实施方案中，金属内肽酶是杆菌蛋白酶。杆菌蛋白酶优选来自芽孢杆菌，更优选来自解淀粉芽孢杆菌。在本发明的优选实施方案中，杆菌蛋白酶不是来自枯草芽孢杆菌。

在本发明的上下文中，术语“胰蛋白酶样蛋白酶”是微生物来源的蛋白酶。优选地，微生物来源的胰蛋白酶样蛋白酶来自镰刀菌属物种，特别是尖孢镰刀菌(Fusariumoxsporum)。因此，例如，术语“胰蛋白酶样蛋白酶”不包括非微生物来源的胰酶。相反，胰酶是源自胰腺的酶的混合物，其例如包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。此外，术语“胰蛋白酶样蛋白酶”不应与“胰蛋白酶”混淆。

在另一个实施方案中，菠萝蛋白酶来自菠萝(Ananas comosus)。菠萝蛋白酶是一种半胱氨酸内肽酶。

在本发明的实施方案中，步骤b)中的酶促水解使用以下酶组合中的任一种进行：

i)包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种胰蛋白酶样蛋白酶的酶组合，

ii)包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的酶组合，

iii)包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶和金属内肽酶的组合、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的酶组合，

iv)包含至少一种来自解淀粉芽孢杆的杆菌蛋白酶、至少菠萝蛋白酶和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的酶组合。

在本发明的优选实施方案中，步骤b)优选的促水解使用以下酶组合中的任一种进行：

i)包含至少一种来自芽孢杆菌物种的丝氨酸内肽酶、至少一种来自米曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种微生物来源的胰蛋白酶样蛋白酶的酶组合，

ii)包含至少一种来自芽孢杆菌物种的枯草杆菌蛋白酶、至少一种来自米曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自米曲霉的亮氨酰氨肽酶的酶组合，

iii)包含至少一种来自芽孢杆菌物种的杆菌蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的组合、至少一种来自米曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自米曲霉的亮氨酰氨肽酶的酶组合，

iv)包含至少一种来自解淀粉芽孢杆的杆菌蛋白酶、至少来自菠萝的菠萝蛋白酶和至少一种来自米曲霉的亮氨酰氨肽酶的酶组合。

在本发明的优选实施方案中，酶组合：

i)包含至少一种来自EC 3.4.21.62组的酶、至少一种EC 3.4.21组的其他的酶和至少一种EC 3.4.21.4组的其他的酶的酶组合，

ii)包含至少一种来自EC 3.4.21.62组的酶、至少一种EC 3.4.21组的其他的酶和至少一种EC 3.4.11组的其他的酶的酶组合，

iii)包含至少一种来自EC 3.4.21.62组的酶、一种来自EC 3.4.24.28组的其他的酶、至少一种EC 3.4.21组的其他的酶和至少一种EC 3.4.11组的其他的酶的酶组合，

iv)包含至少一种来自EC 3.4.24.28组的酶、至少一种来自EC 3.4.22.32组的其他的酶和至少一种EC 3.4.11组的其他的酶的酶组合。

在本发明的另一优选实施方案中，酶组合：

i)包含至少一种来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自米曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自尖孢镰刀菌的胰蛋白酶样蛋白酶，任选地还有来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶，

ii)包含至少一种来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、至少一种来自米曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自米曲霉的亮氨酰氨肽酶，

iii)包含至少一种来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶、至少一种来自米曲霉的丝氨酸内肽酶和至少一种来自米曲霉的亮氨酰氨肽酶，

iv)包含至少一种来自解淀粉芽孢杆的杆菌蛋白酶、至少来自菠萝的菠萝蛋白酶和至少一种来自米曲霉的亮氨酰氨肽酶。

来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶优选为枯草杆菌蛋白酶。

在本发明的另一优选实施方案中，酶组合：

i)包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21.62)、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)和至少一种胰蛋白酶样蛋白酶(EC 3.4.21.4)，

ii)包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21.62)、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶(EC 3.4.11)，

iii)包含至少一种来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21.62)、杆菌蛋白酶(EC 3.4.24.28)、至少一种来自曲霉的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21.63)和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶(EC 3.4.11)，

iv)包含至少一种来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶(EC 3.4.24.28)、至少菠萝蛋白酶[EC 3.4.22.32)和至少一种来自曲霉的亮氨酰氨肽酶(EC 3.4.11)。

在本制备乳清蛋白水解物的方法中使用的酶组合i)至iv)可以包含除提及的主酶之外的其他酶。术语“主酶”是指制剂中含量最高的酶。在下面的列表中，括号中给出了Uniprot登录号，以标识注释了特定命名的蛋白酶。例如，酶组合可包含一种或多种与选自以下组成的组的酶具有高序列同一性(95-100％)的酶：肽水解酶(A0A364MDR7)、枯草杆菌酶家族蛋白(I8A6W5)、真菌溶素金属肽酶M36(A0A2P2H013)、中性蛋白酶2(A0A364MH70)、曲霉蛋白酶(aspergillopepsin)-1(B8NLY9)、亮氨酰氨肽酶A(Q2U1F3)、亮氨酰氨肽酶2(Q2ULM2)、二肽基肽酶4(Q2UH35)、二肽基肽酶5(Q9Y8E3)、中性蛋白酶1(Q2U1G7)、中性蛋白酶2(P46076)、碱性蛋白酶1(P12547)和脯氨酰寡肽酶家族蛋白(B8NBM3)。

在本发明的一个方面，酶组合i)的主酶是来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和胰蛋白酶样蛋白酶。来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶优选为枯草杆菌蛋白酶，来自曲霉的丝氨酸内肽酶优选为枯草杆菌酶家族蛋白。在本发明的实施方案中，酶组合i)还可以包含以下的一种或多种：氨肽酶(如肽水解酶和亮氨酰氨肽酶)、金属内肽酶(如杆菌蛋白酶和真菌溶素金属肽酶、中性蛋白酶)、脯氨酰寡肽酶家族蛋白以及曲霉蛋白酶-1(天冬氨酸内肽酶)。预计酶组合i)中存在的酶的至少80％是来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和胰蛋白酶样蛋白酶。包含来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶的制剂的实例是Protamex(Novozymes A/S)。Protamex还包含杆菌蛋白酶。包含来自曲霉的丝氨酸内肽酶的制剂的实例是Promod 782(Biocatalysts Ltd)和Protease A Amano 2SD(Amano Enzyme Ltd)，其中主酶是来自米曲霉的丝氨酸内肽酶。Promod 782和Protease AAmano 2SD还包括酶肽水解酶、亮氨酰氨肽酶、真菌溶素金属肽酶M36、脯氨酰寡肽酶家族蛋白、中性蛋白酶2和曲霉蛋白酶-1，并且主酶是丝氨酸内肽酶。胰蛋白酶样蛋白酶可以例如由Formea TL 1200BG(Novozymes A/S)提供。

在本发明的一个方面，酶组合ii)包含来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶作为主酶。来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶优选为枯草杆菌蛋白酶，来自曲霉的丝氨酸内肽酶优选为枯草杆菌酶家族蛋白和碱性蛋白酶。来自曲霉的亮氨酰氨肽酶可以是例如肽水解酶、亮氨酰氨肽酶A和亮氨酰氨肽酶2中的一种或多种。在本发明的实施方案中，酶组合ii)还可包含金属内肽酶；真菌溶素金属肽酶M36、中性蛋白酶1和中性蛋白酶2的一种或多种。酶组合ii)还可以包含曲霉蛋白酶-1(天冬氨酸内肽酶)、二肽基肽酶4和二肽基肽酶5。预计酶组合i)中存在的酶的至少80％是来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶。包含来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶的制剂的实例是Alcalase(Novozymes A/S)，其包含枯草杆菌蛋白酶。包含来自曲霉的丝氨酸内肽酶的制剂的实例是Protease A Amano 2SD和Promod 782，其中主酶是来自米曲霉的丝氨酸内肽酶。Promod782和Protease AAmano 2SD还包括酶肽水解酶、亮氨酰氨肽酶、真菌溶素金属肽酶M36、脯氨酰寡肽酶家族蛋白、中性蛋白酶2、曲霉蛋白酶-1，并且主酶是丝氨酸内肽酶。包含来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的制剂的实例是FlavourzymeConc BG(Novozymes A/S)，其中主酶是亮氨酰氨肽酶。Flavourzyme Conc BG还包含亮氨酰氨肽酶A、亮氨酰氨肽酶2、二肽基肽酶4、二肽基肽酶5、中性蛋白酶1、中性蛋白酶2、碱性蛋白酶1，并且其中主酶是亮氨酰氨肽酶。

在本发明的一个方面中，酶组合iii)包含来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自芽孢杆菌的金属内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶作为主酶。来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶优选为枯草杆菌蛋白酶，来自芽孢杆菌的金属内肽酶优选是杆菌蛋白酶，并且来自曲霉的丝氨酸内肽酶优选为枯草杆菌酶家族蛋白和碱性蛋白酶。来自曲霉的亮氨酰氨肽酶可以是例如肽水解酶、亮氨酰氨肽酶A和亮氨酰氨肽酶2中的一种或多种。在本发明的实施方案中，酶组合iii)还可包含金属内肽酶；真菌溶素金属肽酶M36、中性蛋白酶1和中性蛋白酶2的一种或多种。酶组合ii)还可以包含曲霉蛋白酶-1(天冬氨酸内肽酶)、二肽基肽酶4和二肽基肽酶5。酶组合iii)中存在的酶的至少80％是来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、杆菌蛋白酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶。同时包含来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶(枯草杆菌蛋白酶)和杆菌蛋白酶两者的制剂的实例是Promod 950L(Biocatalysts Ltd)和Protamex。包含来自曲霉的丝氨酸内肽酶的制剂的实例是Protease A Amano 2SD和Promod 782。Promod 782和Protease AAmano 2SD还包括酶肽水解酶、亮氨酰氨肽酶、真菌溶素金属肽酶M36、脯氨酰寡肽酶家族蛋白、中性蛋白酶2和曲霉蛋白酶-1，并且主酶是丝氨酸内肽酶。包含来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的制剂的实例是Flavourzyme conc BG，其中主酶是亮氨酰氨肽酶。Flavourzyme Conc BG还包含下列酶：亮氨酰氨肽酶A、亮氨酰氨肽酶2、二肽基肽酶4、二肽基肽酶5、中性蛋白酶1、中性蛋白酶2以及碱性蛋白酶1，并且其中主酶是亮氨酰氨肽酶。

在本发明的一个方面，酶组合iv)包含来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶作为主酶。来自曲霉的亮氨酰氨肽酶可以是例如肽水解酶、亮氨酰氨肽酶A和亮氨酰氨肽酶2中的一种或多种。在本发明的实施方案中，酶组合iv)还可包含金属内肽酶；真菌溶素金属肽酶M36、中性蛋白酶1和中性蛋白酶2的一种或多种。酶组合ii)还可包含二肽基肽酶4、二肽基肽酶5和碱性蛋白酶(来自曲霉的丝氨酸蛋白酶)。预计酶组合iv)中存在的酶的至少80％是来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶。包含来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶的制剂的实例是Neutrase。菠萝蛋白酶的实例是Promod 523MDP，而来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的实例是Flavourzyme conc BG。

本发明的制备乳清蛋白水解物的方法不应限于在水解步骤下添加的酶量，因为添加的酶量取决于酶的类型和酶的活性。然而，作为指导，酶促水解用酶的组合进行，其中酶的总量为0.05-10g酶/100g蛋白质，例如0.1-7.5g酶/100g蛋白质。优选地，酶量为0.2-5.0g/100g蛋白质的量。

组合i至iii中三种不同酶之间的比率可以例如在1-10:1-10:1-10的范围内，例如在1-8:1-8:1-8的范围内。然而，本发明不应限于添加的酶量，因为这将取决于所用酶的活性。

本发明的步骤b)中进行的酶促水解优选在40℃-75℃范围内，例如40℃-70℃的温度下进行。酶促水解应在酶具有最佳活性的温度下进行。在优选的实施方案中，酶促水解在45℃-65℃范围内的温度下进行。

在步骤c)中水解停止之前酶水解的时间段取决于所用酶的量和活性。水解一直持续到水解度为15％或更高为止。步骤b)中的酶促水解优选在3小时-20小时范围内的时间段内进行，例如3.5小时-15小时，优选4小时-10小时，甚至更优选4小时-7小时。

乳清蛋白溶液在酶促水解期间应优选具有6-9范围内的pH。在优选的实施方案中，步骤b)中酶促水解期间的pH为6.5-8.0。

在此pH值范围内，酶的活性最高，因此可以最有效地将蛋白质切割成肽和游离氨基酸。此外，在此pH范围内避免了在水解过程中以及在使酶失活的热处理过程中发生聚集。

在根据本发明所述的制备乳清蛋白水解物的方法的步骤c)中，酶促水解通过使酶失活而停止。在本发明的上下文中，术语“失活”是指酶的不可逆失活。酶的失活必须是不可逆的从而酶在其他条件下不会变得有活性。

当水解度为至少15％，例如至少18％，优选至少20％时，水解停止。在本发明的实施方案中，当水解度在15％-35％，优选17％-30％，甚至更优选18％-28％的范围内时，在步骤c)中停止水解。

步骤c)中酶的失活和因此停止的水解可以通过本领域已知的任何方法进行。例如，通过将温度修正到酶失活和变性的温度来使酶失活。酶的失活和变性也可以通过将溶液的pH值修正到酶失活的pH值来实现。

因此，在本发明的实施方案中，步骤c)中酶的失活是通过将添加了酶的乳清蛋白溶液加热至至少80℃的温度来进行。酶的失活优选通过加热至80℃-130℃的温度进行，例如85℃-125℃，甚至更优选地90℃-120℃。步骤c)中通过加热将酶失活可以例如通过加热至高温持续一段短时间，例如加热至110℃-130℃的温度持续10-30秒。替代地，步骤c)中酶的失活可以通过加热至相对低的温度但持续较长时间进行。这可能涉及加热到80℃-90℃持续5-10分钟。

在本发明的另一个实施方案中，步骤c)中酶的不可逆失活包括升高或降低加有酶的乳清蛋白溶液(即乳清蛋白水解物)的pH值至酶失活的pH值。在本发明的实施方案中，将pH值增加到10或更高的pH值。在另一个实施方案中，将pH值降低到4或更低的pH值。

在本发明的优选实施方案中，该方法不包括对步骤c)中获得的乳清蛋白水解物进行超滤的任何步骤。令本发明的发明人惊讶的是，使用指定的酶组合对具有少量脂质(即WPI或SPI)的乳清蛋白溶液，进行的酶促水解导致乳清蛋白水解物具有适口的味道并且其外观也是澄清的，而无需涉及任何超滤步骤。

本领域已知的乳清蛋白水解物可分为超滤和非超滤水解物。已知的非超滤蛋白水解物会具有不澄清的或混浊的外观，其中超滤蛋白水解物在外观上通常是澄清的。

在本发明的上下文中，术语“超滤”是指用具有1500Da-50000Da，优选2000Da-20000Da范围内的截断值的膜进行的膜过滤。

在蛋白质水解物的超滤过程中，脂肪、完整蛋白质以及一些较大的肽被超滤膜截留并保留在渗余物中，而游离氨基酸、较小的肽和矿物质则在超滤渗透物中。

在本发明的实施方案中，乳清蛋白溶液被制备为具有低脂质含量的WPI和SPI溶液。令本发明的发明人惊奇的是，用本发明的酶组合制备乳清蛋白水解物，得到具有高水解度、苦味低的好味道且外观澄清的乳清蛋白水解物。

然而，低脂质含量并不是为什么本发明的发明人能够制备澄清的蛋白质水解物的唯一解释。本发明的发明人惊奇地发现，当使用上述酶组合中的任何一种对低脂质含量的乳清蛋白溶液进行酶促水解时，可以制备水解度在15％以上，在4％蛋白溶液中没有苦味且外观澄清的乳清蛋白水解物。为了外观澄清，必须使用低脂含量的乳清蛋白溶液。然而，低脂质含量并不是获得澄清水解物的唯一原因。本发明的发明人惊奇地发现，使用特定酶组合的水解产生澄清的水解产物。在对比试验中，观察到具有低脂质含量但用除本发明方法中使用的酶以外的其他酶进行水解的其他乳清蛋白水解物不会产生具有澄清外观和低苦味的乳清蛋白水解物。

通过本发明的方法获得的乳清蛋白水解物可以优选地被浓缩和/或干燥。因此，在本发明的实施方案中，所述方法包括将步骤c)中获得的乳清蛋白水解物进行浓缩和/或干燥的步骤d)。浓缩可以例如通过单元操作纳米过滤、反渗透过滤和蒸发中的一种或多种进行。

在本发明的另一个实施方案中，干燥步骤包括单元操作喷雾干燥、冷冻干燥和旋转闪蒸干燥的一种或多种，也可以使用旋转干燥和/或流化床干燥。

乳清蛋白水解物

在一个方面，本发明涉及乳清蛋白水解物，其包含：

-游离氨基酸和肽，以及

-具有至少15％的水解度，以及

-分子量为2500Da或更高的肽，其量为肽总量的25重量％或更少，以及

-游离氨基酸的量为水解产物中总氨基酸含量的15重量％或更少，以及其中4％蛋白质溶液中的乳清蛋白水解物具有对应于0.08％w/v或更少咖啡因的溶液的苦味评分。

在本发明的一个方面，本发明的乳清蛋白水解物的水解度至少为15％。本发明的一个目的是制备一种高度水解的乳清蛋白水解物，其无需任何超滤步骤就没有令人不快的苦味。众所周知，肽是造成许多水解产物苦味的原因。一般地，提供具有高水解度的水解产物的深度水解预计会导致具有苦味的水解产物。为了减少深度水解的蛋白质水解物的苦味，可以用活性炭处理水解物，活性炭可以与苦味肽一起再次去除。深度水解的蛋白质可能是理想的，因为这些肽具有除完整蛋白质之外的其他功能。例如，所述肽可能比完整的乳清蛋白更能承受热处理。

然而，本发明的发明人惊奇地发现，一种制备具有高水解度的乳清蛋白水解物的方法，即使该乳清蛋白水解物没有经过任何额外的去除苦味肽的处理，也没有令人不快的苦味。

在本发明的优选实施方案中，乳清蛋白水解物的水解度至少为18％，甚至更优选乳清蛋白水解物的水解度至少为20％。

在本发明的另一实施方案中，根据本发明所述的乳清蛋白水解物具有15-35％，例如18-30％，优选18-28％，甚至更优选20-25％的水解度。

乳清蛋白水解物可包含游离氨基酸，并且如果存在游离氨基酸，则它们以水解物中总氨基酸含量的15重量％或更少的量存在。优选地，游离氨基酸含量为总氨基酸含量的12重量％或更少。术语“总氨基酸含量”在本发明的上下文中是指存在的氨基酸的总量，包括游离氨基酸和结合在肽和蛋白质中的氨基酸。

在本发明的一些实施方案中，乳清蛋白水解物中游离氨基酸的含量不超过总氨基酸含量的15重量％，例如不超过总氨基酸含量的13重量％，优选不超过总氨基酸含量的10重量％，甚至更优选地，游离氨基酸的含量不超过总氨基酸含量的8重量％。

在本发明的其他实施方案中，乳清蛋白水解物包含的游离氨基酸的量为水解物中总氨基酸含量的2-105重量％，优选地，游离氨基酸的量为水解物中总氨基酸含量的4-13重量％。

本发明的发明人已经发现，本发明的乳清蛋白水解物中的肽包含的肽的分子量为2500Da或更高，其量为肽总量的25重量％或更少。优选地，乳清蛋白水解物包含的肽的分子量为2500Da或更高，其量在8-25重量％的范围内，甚至更优选地为10-20重量％。

在本发明的实施方案中，本发明的乳清蛋白水解物包含的肽的分子量为375Da或更小，其量为至少10重量％。具有375Da或更小的分子量的肽可以例如以10-25重量％范围内的量存在于乳清蛋白水解物中。

本发明的发明人发现，与已知的具有高水解度的乳清蛋白水解物相比，本发明的乳清蛋白水解物具有降低的苦味，如果所述已知的具有高水解度的乳清蛋白水解物已经经超滤膜进行膜过滤和/或经过活性炭处理也是如此。

将乳清蛋白水解物的苦味与咖啡因的苦味进行了比较，4％w/w蛋白溶液中的乳清蛋白水解物的苦味低于0.08％w/v咖啡因溶液的苦味。因此，在4％w/w蛋白质溶液中的乳清蛋白水解物的苦味评分对应于0.08％w/v咖啡因或更低的苦味评分。优选地，本发明的4％w/w蛋白质溶液中的乳清蛋白水解物的苦味评分对应于0.07％w/v咖啡因或以下的苦味评分，甚至更优选对应于0.065％w/v咖啡因或以下的苦味评分。最优选地，本发明的4％w/w蛋白质溶液中的乳清蛋白水解物的苦味评分对应于0.060％w/v的苦味评分。

在本发明的其他实施方案中，乳清蛋白水解物在4％w/w蛋白质溶液中的散射浊度(NTU)为100或更低。本发明的其他实施方案是获得一种乳清蛋白水解物，其除了具有高水解度和可接受的味道外，在外观上也是澄清的。需要澄清且味道良好的乳清蛋白水解物，因为它可用于例如饮料、凝胶和奶昔中并提高消费者的吸引力。

如果在4％w/w蛋白质溶液中测得的散射浊度低于100NTU，则样品被认为是透明的。如果在4％蛋白质溶液中的散射浊度高于100NTU，则认为所测量的乳清蛋白水解物不透明。如果散射浊度低于40NTU，则认为溶液是澄清的。然而，浊度在40到100NTU之间的乳清蛋白水解物可能是透明的(但不澄清或混浊)。在本发明的上下文中，术语“透明”是指允许一些光穿过的溶液，从而可以看到溶液后面的物体，即可以透过溶液可见。术语“澄清”是指无色的溶液，因此可以看穿溶液，而没有任何东西限制看穿。因此，解决方案可能是透明的，但并不是澄清的。

在本发明的其他实施方案中，乳清蛋白水解物在4％w/w蛋白溶液中的散射浊度(NTU)为80或更低，例如在4％w/w蛋白质溶液中的散射浊度(NTU)为60或更低，优选在4％w/w蛋白质溶液中的散射浊度(NTU)为50或更低，甚至更优选在4％w/w蛋白质溶液中的散射浊度(NTU)为40或更低。

在本发明的另一个实施方案中，乳清蛋白水解物具有抗氧化活性。优选地，乳清蛋白水解物的抗氧化活性被测量为在1.5重量％的蛋白质溶液中具有54-60的清除百分比。

乳清蛋白水解物可以包含除蛋白质之外的其他成分，例如碳水化合物、脂质和矿物质。

在本发明的实施方案中，乳清蛋白水解物包含以总固体含量计为8重量％或更少，例如以总固体含量计为6重量％或更少的脂质。在另一实施方案中，乳清蛋白水解物包含以总固体含量计的1重量％或更少的脂质，例如总固体含量的0.5重量％或更少的脂质含量。

乳清蛋白水解物还可包含矿物质，例如钾、钠和钙。

在本发明的实施方案中，乳清蛋白水解物包含3.0重量％或以下的钾。

在本发明的另一个实施方案中，乳清蛋白水解物包含2重量％或以下的钠。

在本发明的另一个实施方案中，乳清蛋白水解物包含的柠檬酸的量为4-10g/kg乳清蛋白水解物固体含量。

在本发明的实施方案中，乳清蛋白水解物包含完整或未降解的牛血清白蛋白(BSA)，其含量为以总蛋白质含量计的0.5-2重量％。

在本发明的优选实施方案中，乳清蛋白水解物呈干燥组合物的形式，例如粉末或颗粒。

在另一个实施方案中，乳清蛋白水解物是液体组合物。

食品产品：

在一方面，本发明涉及提供包含根据本发明所述的乳清蛋白水解物的食品产品。

食品产品可以是例如选自乳制品组中的任何一种，包括饮料、奶昔、凝胶、食物棒、浓缩物或液体浓缩剂(liquid shot)。

在优选的实施方案中，食品产品选自蛋白质饮料、蛋白质浓缩剂、蛋白质奶昔、蛋白质凝胶或蛋白质棒的组。食品产品也可以是婴儿配方奶粉食品或其他婴儿营养产品。

如果食品产品是液体形式，例如饮料、奶昔、凝胶或浓缩剂，则食品产品可以包含根据本发明所述的乳清蛋白水解物。乳清蛋白水解物优选以对应于2-25重量％的水解乳清蛋白的量存在于饮料中，优选3-20重量％的水解乳清蛋白，例如3-15重量％的水解乳清蛋白，甚至更优选3-10重量％的水解乳清蛋白。

如果食品产品是棒，例如蛋白棒，则该食品产品包含相当于2-30重量％水解乳清蛋白的量的根据本发明所述的乳清蛋白水解物。优选地，根据本发明所述的乳清蛋白水解物的量以对应于3-20重量％的水解乳清蛋白，例如4-15重量％的量存在于棒中。如果根据本发明所述的乳清蛋白水解物用于食品棒，例如蛋白棒，则乳清蛋白水解物可用作软化剂。众所周知，增加蛋白质棒中蛋白质水解物的浓度具有软化作用并在长期储存期间防止棒变硬。

在另一方面，本发明涉及提供一种饮料，其包含相当于2-20重量％水解乳清蛋白的量的根据本发明所述的乳清蛋白水解物。饮料例如可以是蛋白质饮料，其除了蛋白质之外还包括碳水化合物、维生素和矿物质。

在本发明的优选实施方案中，饮料具有中性pH，即在22℃下在4％蛋白质溶液中的pH在6.5-8.0的范围内。

在本发明的实施方案中，根据本发明所述的乳清蛋白水解物可用作制备碳酸饮料的成分。因此，包含根据本发明所述的乳清蛋白水解物的本发明的食品产品是碳酸饮料。

本发明的其他实施方案涉及包含本发明的乳清蛋白水解物的碳酸饮料。

在一个实施方案中，碳酸饮料包含对应于2-10重量％的量的乳清蛋白水解物。碳酸饮料还可以包含碳水化合物，如果存在碳水化合物，则其含量为5重量％或以下。碳酸饮料优选不含脂肪。

在一个实施方案中，包含本发明的乳清蛋白水解物的碳酸饮料中的碳酸化量为0.1体积碳酸化(每体积饮料中存在的液体)至4体积碳酸化。更典型地，碳酸化的量在约1.6体积至约3.5体积的范围内，最典型的浓度在约1.7体积至约3.0体积的范围内，并且碳酸化的量最优选地在2.0至3.0体积的范围内。在本发明的上下文中，碳酸化是指以足以获得碳酸化蛋白质饮料的量向饮料的成分混合物中加入二氧化碳，其中饮料中存在的碳酸化量为每体积液体混合物0.1体积至4体积。在该方法的一些实施方案中，二氧化碳以无菌碳酸水的形式加入。在其他实施方案中，将无菌二氧化碳鼓泡通过液体混合物直到存在所需量的二氧化碳。

碳酸化会增加饮料的酸度。添加到饮料中的二氧化碳越多，饮料的pH值就越低。然而，本发明的发明人已经发现，在5℃的温度下，二氧化碳的加入会将饮料的pH值降低至最低pH 5.5-6.0。每体积饮料添加约2.5-3.0体积二氧化碳导致饮料的pH在5℃的温度下降低至约pH 6.0，而每体积饮料添加约4体积二氧化碳导致饮料的pH在5℃的温度下降低至约pH5.5。

因此，在本发明的实施方案中，包含本发明的乳清蛋白水解物的碳酸饮料在5℃的温度下具有至少5.5的pH。pH通常在5.5-8.25的范围内，例如在5.5-7.0的范围内，优选在5.8-6.5的范围内。优选pH值高于5.5的碳酸饮料。

包含本发明的乳清蛋白水解物的碳酸饮料可以例如被热处理，例如巴氏杀菌或高压灭菌。本发明的发明人已经发现，包含本发明的乳清蛋白水解物的碳酸饮料的浊度在高达120℃的温度下长时间(例如20分钟)热处理后不改变。

在本发明的其他实施方案中，碳酸饮料可包含根据本发明所述的乳清蛋白水解物与未水解的乳清蛋白分离物的组合。

本发明的乳清蛋白水解物也可用于制备蛋白浓缩剂、蛋白奶昔或蛋白凝胶。蛋白浓缩剂、奶昔或凝胶除了2-20重量％的量的水解乳清蛋白之外，还可包含碳水化合物、维生素和矿物质。蛋白浓缩剂、蛋白奶昔或蛋白凝胶的pH优选为中性，即pH在6.5-8.0的范围内。

在另一方面，本发明涉及根据本发明所述的乳清蛋白水解物作为食品成分的用途。乳清蛋白水解物可以作为食品成分添加到任何类型的食品中。优选地，本发明的乳清蛋白水解物用作制备冷饮或热饮的食品成分。

在本发明的实施方案中，乳清蛋白水解物用作制备具有6.5-8.5范围内pH值的UHT稳定饮料的食品成分。

在本发明的另一实施方案中，乳清蛋白水解物用作制备用于运动营养的饮料的食品成分。在本发明的上下文中，术语“运动营养”是指适合与锻炼或训练相关的营养，即用于增强肌肉质量。

在本发明的另一实施方案中，乳清蛋白水解物用作制备临床饮料的食品成分。在本发明的上下文中，术语“临床饮料”是指具有临床或医学适应症的饮料。例如，临床饮料可能具有与健康相关的效果。临床饮料通常由住院或有营养困难的老年人或需要预先消化的蛋白质以从医疗状况中恢复的个体使用。例如。临床饮料可以是用于患有营养不良或吸收不良的个体的饮料。临床饮料也可用于患有胃肠疾病的个体。在本文的上下文中，术语“临床饮料”和“医用饮料”具有相同的含义。

临床饮料可以例如包含本发明的乳清蛋白水解物，其量对应于包含2-20重量％水解乳清蛋白的饮料。临床饮料可以包含饮料的5-50重量％的量的碳水化合物。碳水化合物的量可以例如在10-40重量％，例如15-35重量％的范围内。临床饮料还可包含脂肪。例如，临床饮料中的脂肪含量可以在2-30重量％的范围内，例如3-20重量％，更优选3-18重量％。

在一个实例中，临床饮料包含的根据本发明所述的水解乳清蛋白的量对应于4-10重量％、3-15重量％的脂肪和10-35重量％的碳水化合物。

临床饮料优选具有中性pH值，即6.5-8.0范围内的pH。

临床饮料可以是澄清饮料、乳状饮料、管饲的形式或者是待在液体中重构的粉末形式。

在一个实施方案中，本发明的乳清蛋白水解物还可用于制备果汁型饮料。果汁型饮料优选地包含对应于4-10重量％蛋白质、0-1重量％脂肪和15-35重量％碳水化合物的量的根据本发明所述的水解乳清蛋白。

如果临床饮料是管饲形式，它可以包含4-15重量％的根据本发明所述的水解乳清蛋白、约5-35重量％的碳水化合物和约3-15重量％的脂肪。

本发明的乳清蛋白水解物还可用于婴儿营养品，例如婴儿配方奶粉。在本发明的上下文中，术语“婴儿配方奶粉”是指任何类型的婴儿配方奶粉，包括后续配方、成长配方和早产配方。

如果将根据本发明所述的乳清蛋白水解物用于婴儿配方奶粉中，婴儿配方奶粉中的蛋白质含量在1.6-5.0g/100kcal的范围内。除了乳清蛋白水解物之外，婴儿配方奶粉还可以包含碳水化合物，例如乳糖、寡糖、脂质、维生素和矿物质。

根据本发明所述的乳清蛋白水解物还可用于制备除婴儿配方奶粉之外的其他婴儿营养品，例如用于奶昔、粥等。

本发明的乳清蛋白水解物也可用于制备乳液。通常通过在液体(例如水或牛奶)和脂肪中重构乳清蛋白水解物的粉末来制备乳液。乳清蛋白水解物会对水和脂肪产生乳化作用。粉末通常包含相当于5-15重量％蛋白质的量的乳清蛋白水解物。重构后，乳液包含2-4重量％的量的蛋白质。

蛋白质水解引起蛋白质的变化，如带电基团数量增加、平均分子量降低、反应基团暴露等。这是影响蛋白质水解物形成乳液和稳定乳液能力的因素。本发明的乳清蛋白水解物可用作乳化剂、稳定剂等，通过将它们与其他成分组合。

本发明的乳清蛋白水解物还可用于烘焙产品，例如用于饼干、曲奇和薄脆饼干。

在其他方面，本发明涉及根据本发明所述的乳清蛋白水解物作为抗氧化剂的用途。本发明的发明人惊奇地发现本发明的乳清蛋白水解物具有抗氧化作用。因此，乳清蛋白水解物可用于营养组合物中作为抗氧化肽的来源。

因此，本发明涉及具有抗氧化作用的本发明的乳清蛋白水解物。更具体地，本发明涉及具有抗氧化作用的乳清蛋白水解物，其定义为在包含1.5重量％蛋白质的溶液中的清除百分比为54-60。清除百分比通过DPPH(2,2-二苯基-1-苦基-肼基-水合物)测定法测量。清除百分比计算为100x(A₀-A_S)/A₀，其中A₀是没有样品时的吸光度，而A_S是有样品时的吸光度。

应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用的方式全文并入本文。

现在将在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明。

实施例

实施例1：分析方法

实施例1.1：水解度(DH)的测定

水解度(DH)定义为通过水解裂解的肽键的百分比，参见下面的等式(1)。DH值提供有关形成的肽数量的信息，这与可用肽键的数量有关。

如下列文献中中所述测量乳清蛋白水解物的DH：Adler-Nissen,J.Determinationof the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates bytrinitrobenzenesulfonic acid.J.Agric.Food Chem.27,1256-1262(1979).和Nielsen,P.M.,Petersen,D.&Dambmann,C.Improved method for determining food proteindegree of hydrolysis.J.Food Sci.66,642-646(2001)。在等式(1)中，h表示裂解的肽键数，h_total表示可用肽键的总数。因此，DH给出了裂解的肽键的百分比。

等式(1)：DH＝(游离氨基末端数)/(可用肽键总数)·100％＝h/h_total·100％

水解后形成的游离α-氨基与邻苯二甲醛(OPA)反应并形成黄色络合物，该络合物吸收340nm的光，因此可以通过分光光度法进行测量。根据颜色的形成，可以计算出DH。

将水解物以适当的浓度(0.03-0.08％蛋白质)重新悬浮在水中，并在25℃将2体积与15体积的OPA试剂(100mM Na₂B₄O₇、0.1％十二烷基硫酸钠、6mM DL-二硫苏糖醇、6mM邻苯二甲醛和2％乙醇)反应2分钟。进行了类似的反应以产生L-丝氨酸的浓度系列。接下来，测量340nm(A340)处的吸光度，并减去来自OPA与水反应的A340信号。为了找到真正的DH，对上清液中测量的丝氨酸当量进行校正，如Adler-Nissen对三硝基苯磺酸方法的建议[Adler-Nissen J；Agricultural and Food Chemistry,1979 27(6)1256]，其给出与所描述的OPA方法相同的响应。用于乳清蛋白水解物的因子为a＝1，b＝0.4，h_total＝8.8。

实施例1.2：浊度的测定

乳清蛋白水解物的散射浊度用作澄清度和透明度的量度。如果在4％w/w蛋白质溶液中测得的散射浊度低于100NTU，则样品被认为是透明的。此外，如果在4％w/w蛋白质溶液中测得的散射浊度低于40NTU，则样品被认为是澄清的。

测量散射浊度时，将样品稀释为5种不同的蛋白质浓度，分别为1.8％、3.2％、4.8％、6.4％和8％，并且用默克公司的Turbiquant 3000IR测量散射浊度。

实施例1.3：总蛋白质的测定

样品的总蛋白质含量(蛋白质当量)通过以下方法测定：

1)按照ISO 8968-1/2IIDF 020-1/2-乳–氮含量的测定–172部分来测定样品的总氮：使用凯氏定氮法测定氮含量。

2)计算蛋白质的总量为：Nx6.38

实施例1.4：总氨基酸含量的测定

氨基酸组成分析提供了关于作为氨基酸补充来源的蛋白质水解物的详细信息。

通过ISO 13903:2005、EU 152/2009的方法测量总氨基酸含量。在盐酸水溶液中将样品水解以破坏样品中的肽键。水解后，调整样品的pH值，定容并过滤。在氨基酸分析仪中分离氨基酸，使用茚三酮试剂柱后衍生进行检测，并在440和570nm处测量。对于定量，使用1点校准。为保证质量，每次运行都对内部标准进行分析。

在氨基酸分析仪上进行分析之前，半胱氨酸和甲硫氨酸必须被氧化。将样品在低温下用过氧化氢和甲酸氧化，然后用盐酸水溶液进行酸水解。氧化过程氧化甲硫氨酸和半胱氨酸，从而防止水解过程中损失。水解后，按上述方法分析样品。

总色氨酸的定量：色氨酸使用另一种方法进行分析，因为色氨酸不能以与其他氨基酸相同的方式进行定量，因为它在蛋白质的酸水解过程中会被破坏。作为替代，将样品通过碱处理水解并通过HPLC分析定量。

每个氨基酸的结果都归一化至存在的氨基酸总量：[g/100g氨基酸]。

实施例1.5：游离氨基酸含量的测定

乳清蛋白水解物中的游离氨基酸通过以下方法测定：R.Schuster,"Determination of Amino Acids in Biological,Pharmaceutical,Plant and FoodSamples by Automated Precolumn Derivatization and HPLC",Journal ofChromatography,431:271-284(1988)和Henderson,J.W.,Ricker,R.D.Bidlingmeyer,B.A.,Woodward,C.,"Rapid,Accurate,Sensitive,and Reproducible HPLC Analysis ofAmino Acids,Amino Acid Analysis Us-ing Zorbax Eclipse-AAA columns and theAgilent 1100HPLC,"Agilent Publication,2000。

游离氨基酸是通过将氨基酸提取到水溶液或酸性溶液中来测定的。样品可以通过分子量过滤脱蛋白。在进样前衍生(pre-injection derivatisation)后将样品通过HPLC进行分析。进样前用邻苯二甲醛衍生出一级氨基酸，用芴甲基氯甲酸酯衍生出二级氨基酸。结果如下：

[mg游离氨基酸/100g乳清蛋白水解物粉]

实施例1.6：确定乳清蛋白水解物中肽分布的方法

使用尺寸排阻色谱(SEC)分析乳清蛋白水解物中肽的分子量分布。使用SEC按尺寸分离聚合物类型的分子。不同尺寸的组分的混合物，本文中是肽，可以通过SEC分离。洗脱时间取决于尺寸的大小。分子越小，洗脱时间越长。

将样品溶解在流动相中至浓度为0.5％w/v。进样前，样品通过0.45μm过滤器过滤。在三个串联的TSK G2000 SWXL(5μm,7.5mm x300mm)色谱柱上进行色谱分离。使用由0.0375M磷酸盐缓冲液、0.375M氯化铵、0.1％三氟乙酸(TFA)和25％乙腈(CH₃CN)组成的缓冲液作为流动相，流速为0.7mL/分钟。使用在214nm处测量的UV检测器进行肽的检测。

基于保留时间，根据大小划分肽段分布，根据分子量给出相对量。

实施例2：酶组合的筛选

总共测试了55种不同的酶组合，用于乳清蛋白的酶促水解。分析获得的乳清蛋白水解物的澄清度、苦味、水解度和肽组成。水解试验以0.5升的规模进行。

用于测试不同酶组合的酶是来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21.62)、来自曲霉的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、微生物来源的胰蛋白酶样蛋白酶(EC 3.4.21.4)、来自曲霉的氨肽酶(EC 3.4.11)、来自解淀粉芽孢杆菌的金属内肽酶(EC 3.4.24.28)、来自菠萝的内切蛋白酶(菠萝蛋白酶)(EC 3.4.22.32)、来自黑曲霉的脯氨酸特异性内肽酶(EC:3.4.21.26)、来自米曲霉的氨肽酶制剂(EC 3.4.11、来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的金属内肽酶制剂(EC 3.4.24)以及来自解淀粉芽孢杆菌的内肽酶制剂(EC 3.4)。

用于实验的酶制剂为：

Protamex(Novozymes A/S)，其包含来自芽孢杆菌物种的丝氨酸内肽酶(枯草杆菌蛋白酶)和杆菌蛋白酶。

Protease A Amano 2SD(Amano Enzymes Ltd.)，其包含来自米曲霉的丝氨酸内肽酶。

Promod 782MDP(Biocatalysts Ltd.)，其包含来自曲霉物种的丝氨酸内肽酶。

Formea TL 1200BG(Novozymes A/S)，其包含微生物来源的胰蛋白酶样蛋白酶。

Promod 950L(Biocatalysts Ltd.)，其包含来自芽孢杆菌物种的丝氨酸内肽酶(枯草杆菌蛋白酶)和杆菌蛋白酶。

Flavourzyme conc BG(Novozymes A/S)，其包含来自米曲霉的亮氨酰氨肽酶。

Alcalase AF 2.4L(Novozymes A/S)，其包含来自地衣芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶(枯草杆菌蛋白酶)。

Neutrase conc BG(Novozymes A/S)，其包含来自解淀粉芽孢杆菌的金属内肽酶(杆菌蛋白酶)。

Promod 523MDP(Bromelain)(Biocatalysts Ltd.)，其包含来自菠萝的半胱氨酸内肽酶。

Maxipro PSP(DSM)，来自黑曲霉的脯氨酸特异性内肽酶。

Flavorpro 766(Biocatalyst Ltd.)，其包含来自米曲霉的氨肽酶。

Thermoase PC10F(Amano Enzymes Ltd.)，其包含来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的金属内肽酶。

Protin NY100(Amano Enzymes Ltd.)，其包含来自解淀粉芽孢杆菌的内肽酶。

将55种酶的组合用于水解乳清蛋白。作为水解的底物，使用乳清蛋白分离物(WPI)的溶液(Lacprodan DI-9224，来自Arla Food Ingredients)。用于所有实验的WPI溶液的蛋白质浓度为8重量％。水解反应在50℃下进行，其中pH-stat为pH＝7，并且自加入第一种酶后的反应时间为6小时。水解6小时后，通过加热至99℃并保持90秒的时间以使酶失活来停止水解。所用酶的量在表1中提及，为每100克蛋白质中的酶的量(克)。来自每个水解试验的产物被冷冻干燥并用于进一步分析，包括澄清度(以浊度测量的形式)、水解度和味道评价和评分。结果汇总于下表1中：

NEU：指Neutrase

FZ：指Flavourzyme conc BG

Alca：指Alcalase AF 2.4L

PA：指Protease AAmano 2SD

FTL：指Formea TL 1200BG

PM782：指Promod 782MDP

FP766：指Flavourpro 766

MP PSP：指Maxipro PSP

THER：指Thermoase PC10F

PRO：指Protin NY100

PM950：指Promod 950L

PTM：指Protamex

用于表1中所示试验的酶是根据96孔规模的试验从大量酶中选择的。这些试验包括用不同的酶组合进行水解，并对表观澄清度和热稳定性和水解(SDS-PAGE)进行目视评分。为了允许pH稳定水解和更大量的材料用于分析，表1中给出的组合如上所述以500毫升规模进行。因此，表1中列出的酶不是随机选择的。表1中的一些酶组合以不同剂量重复(例如组合1-3)。

表1中的术语“Visual a inact”是指“失活后可见”

表1

评估每种乳清蛋白水解物的数据。对于正面评价，应满足以下条件：

-酶失活后外观澄清

-具有15％以上，优选20％以上的高水解度

-在4％w/w的蛋白质溶液中没有苦味

-25重量％或更少的肽应具有高于2500Da的分子量

样品在99℃下90秒后应该是澄清的，因为这表明UHT稳定性(4％溶液在143℃处理6秒后稳定澄清)。

因此，从上表可以看出，55种酶组合中的4种，即记为样品4、10、11和30的样品，满足条件。

样品4是通过使用来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和胰蛋白酶样蛋白酶的组合水解获得的。

样品10是通过使用来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自芽孢杆菌的金属内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的组合水解获得的。

样品11是通过使用来自芽孢杆菌的丝氨酸内肽酶、来自曲霉的丝氨酸内肽酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶的组合水解获得的。

样品30是通过用来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶和来自曲霉的亮氨酰氨肽酶水解获得的。

实施例3：根据本发明所述的乳清蛋白水解物的进一步分析。

对满足澄清度、味道、水解度和肽分布条件的实施例2的四种乳清蛋白水解物进行进一步分析，并在下表中称为样品1-4(S1-S4)。

样品5-12(S5-S12)是来自使用其他酶组合的水解的乳清蛋白水解物。

样品13(S13)是喷雾干燥的WPI水解产物，其通过以下方法获得：使用来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(Alcalase)和来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶(Neutrase)的组合进行水解，然后进行超滤、活性炭处理并且进行微滤以去除活性炭(如WO 1993/024020A1中所述)。水解度约为25％。

样品14(S14)通过使用与样品4相同的酶组合(本发明的酶组合)来制备，但其中使用WPC作为水解的底物。

样品15和16(S15-S16)是样品4的复制品。样品15和16基于WPI的水解产物制备，其中使用与样品4相同的条件制备但没有进行UF过滤。

再次分析使用不同酶组合进行酶促水解得到的乳清蛋白水解物的澄清度、水解度和分子量大于2500Da的肽的含量和分子量小于375Da的肽的含量。

样品的澄清度(浊度)通过根据实施例1.2的测量确定，并且对于被认为是澄清的样品，散射浊度应低于40NTU，而对于被认为是透明的样品应低于100NTU。

如果在4％或更低的蛋白质中感觉到苦味，则将样品评分为苦味。

水解度通过实施例1.1中描述的方法测量，而苦味通过品尝不同浓度(2％、4％、8％蛋白质浓度)的样品来测量。如实施例1.5中所述测量肽的分布。结果如表2所示：

表2：

因此，从表2可以看出，使用根据本发明所述的特定酶组合可以产生具有以下特征的乳清蛋白水解物：1)水解度大于20％，2)小于25％的肽具有2500Da或更高的分子量，和3)在4％或更低的蛋白质浓度下没有苦味。

此外，表2显示如果WPI用于蛋白质水解，使用本发明的特定酶组合产生外观澄清的乳清蛋白水解物。表2还显示，在使用WPC作为底物的乳清蛋白水解物的制备中使用特定酶组合产生的乳清蛋白水解物的水解度高于20％，少于25％的肽具有2500Da或以上的分子量，并且在4％或以下的蛋白质浓度下无苦味。然而，使用WPC作为底物制备的乳清蛋白水解物在外观上并不澄清(因为WPC中存在脂质)。

在本发明的优选实施方案中，将WPI用作蛋白质水解的底物以获得澄清的水解产物。

实施例4：浊度分析

进一步分析了来自实施例3的样品1-16在不同蛋白质浓度下的散射浊度。浊度小于100NTU的样品被认为是透明的，浊度低于40的样品被认为是澄清的。下表3显示了在不同蛋白质浓度下测量的实施例3中称为样品1-12的水解物的浊度。蛋白质浓度为1.8％蛋白质、3.2％蛋白质、4.8％蛋白质、6.4％蛋白质和8％蛋白质。所述蛋白质浓度是重量百分比。

在测量浊度之前，将乳清蛋白水解物粉末以指定浓度水合至少30分钟(n＝3)。

表3：1.8、3.2、4.8、6.4和8％蛋白质的试验样品的浊度(NTU)

因此，表3显示根据本发明所述的特定酶组合在8％蛋白质浓度下具有小于100NTU的浊度。

在图1A-C中，显示了测量的样品13、14和16的浊度。图1A显示了样品13、14和16的乳清蛋白水解物的浊度并显示了浊度的差异。从图1A中可以看出，经过超滤的乳清蛋白水解物(非本发明，样品13)具有非常低的浊度(低于1NTU)并且是最澄清的水解物。根据本发明所述的方法使用特定酶组合之一制备的水解产物(样品16)在8％蛋白质浓度下具有低于100NTU的浊度，因此是透明的。此外，本发明的水解物在4％蛋白质浓度下具有低于40NTU的浊度，因此在4％蛋白质浓度下被认为是澄清的。相反，根据本发明所述通过使用WPC作为底物制备的乳清蛋白水解物(样品14)具有1000NTU以上的浊度，因此被认为是不澄清的。

图1B更清楚地表明，在5％或更低的蛋白质浓度下，样品16的浊度小于40NTU。

图1C显示了样品14的浊度。结果表明，即使在非常低的浓度(约2％)下，浊度也高于2000NTU。样品14被认为非常不澄清且不透明。

图2A-C包括样品13、14和16的图片，以直观地显示澄清样品与不澄清样品的对比。样品从左到右分别制备为8％、6.4％、4.8％、3.2％和1.8％蛋白质。

图2A显示样品16在8％、6.4％、4.8％、3.2％和1.8％的蛋白质下在视觉上澄清透明。

图2B显示了样品14，并且显示样品14即使在1.8％的最低蛋白质浓度下也不澄清且不透明。

图2C显示了样品13，并且显示样品13在所有浓度下都是视觉上澄清透明的。

实施例5：相对于咖啡因的苦味评估

在实施例5中，将根据本发明所述的乳清蛋白水解物的苦味与通过用本发明之外的其他酶对WPI进行酶促水解(用来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(Alcalase)和来自解淀粉芽孢杆菌的杆菌蛋白酶(Neutrase)水解)制备的UF过滤和活性炭处理的乳清蛋白水解物进行比较。

进行感官评价以比较实施例3的样品13、15和16的味道。

使用咖啡因溶液作为参照训练感官小组来检测和量化苦味。训练包括首先为小组成员提供参照样品，其包括由浓度增加的咖啡因组成的溶液。训练小组成员基于15cm标度为未知溶液分配苦味分数。参照样品由分别含有0.025％、0.05％和0.1％咖啡因的3种咖啡因溶液组成。在对参照样品进行评估后，小组成员以随机顺序品尝4重量％的蛋白质溶液中水解产物样品3次，并根据参照溶液的苦味对测试溶液的苦味强度进行排序。包含0.025％咖啡因的参照溶液被认为没有苦味，而包含0.1％咖啡因的参照溶液被认为是苦味的(在15cm的苦味量表上得分为13)。感官小组包含7名小组成员参与评价。

此外，感官分析是使用小组根据国际标准Quantitative Descriptive ProfileISO 13299:2016第二版5.5,Annex F1-F6&H3进行的。7名经过训练的评估员参加了评估。评估以3次重复进行。所用的响应量表是一个连续的线量表(15cm)。在环境温度下提供大约2ml的样品。评估过程中使用红光。

感官小组参考咖啡因的苦味的对苦味进行的评分如图3所示，其中将测试样品的苦味评分相对与咖啡因浓度作图。3种不同浓度咖啡因的苦味和来自实施例3的样品13、15和16的苦味评分如图3所示。

图3显示样品13(WPI的水解产物，但没有使用本发明的酶组合，但是水解产物被超滤并用活性炭处理)具有0.095％的最高相对苦味。样品15(WPI的水解产物，使用本发明的酶组合，无超滤及活性炭处理)在3个产品样品中具有最低的相对苦味0.054％，但非常接近样品16中的水解产物(类似于样品15)，其相对于咖啡因具有0.061％的相对苦味。

因此，根据本发明所述制备的适口的乳清蛋白水解物(样品15和样品16)的味道被认为苦味低于0.08％的咖啡因且苦味低于样品13。

实施例6：味道分析

进行了一个实施例来评估样品13、15和16中乳清蛋白水解物的味道特征。味道分析由经过训练的小组进行，并使用5种属性来识别样品之间的差异，重点是气味、口感和味道。

分析数据以识别样本之间每个属性的显著差异。数据的统计评价如表4所示。此外，已使用多范围测试来识别样本之间的差异。表4中，字母相同的样本差异不显著。

表4：感官评分

***p<0.001Duncan测试：标记不同字母的样本在95％的水平上有显著差异(p<0.05)。

因此，样品15和16的苦味评分小于样品13的苦味评分。

表4中提到的数据可以用蛛网表示，参见图4。蛛网显示气味(O)、口感(MF)和味道(T)的属性。在图的外围显示了每个感官属性的“高”强度，“小”强度位于图的中心。每个产品都有如下图所示的不同的标签。例如，请参见“苦味_T”的数据，其中***表示样本13与样本15和16的数据显著不同(p<0.001)。

从味道特征的蛛网图可以看出，样品13在味道特征方面与样品15和16有很大不同，最重要的是，样品15和16具有低苦味。

实施例7：通过LC-MS/MS和肽裂解模式进行分析

液体样品中的肽可以通过质谱肽分析和数据库搜索来鉴定。通过LC-MS/MS分析样品1、2、3、13、15和16，以鉴定肽序列及其来源的蛋白质。将各个样品中存在的肽溶解在水中并进样到Dionex nano-LC系统上，以便在Bruker Maxis Impact QTOF质谱仪上进行MS/MS分析。针对包含牛源蛋白质序列的定制数据库，使用获得的MS/MS谱进行搜索。分析的总体结果如表5所示。

表5：LC-MS/MS鉴定的蛋白质

*糖基化依赖性细胞粘附分子1

**牛血清白蛋白

表5中的数据表明，该分析为样品中最普遍的蛋白质(包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和β-酪蛋白)提供了高序列覆盖率。此外，还标明了从每个样品中鉴定出的肽的数量。由于数据集具有LC-MS/MS分析的预期质量，因此它们可用于更详细的分析(实施例9)。

实施例8：苦味肽的LS-MS/MS分析

首先通过比较肽分布证实来自实施例7的LC-MS/MS数据对应于通过SEC分析(尺寸排阻色谱)获得的数据。本文中SEC数据被转换为百分比(给定分子量的肽的数量)，并针对每个水解产物与基于LC-MS/MS计算的相同数据一起绘制(见图5)。LC-MS/MS数据仅包括来自β-乳球蛋白的肽，而SEC分析考虑了样品中的所有蛋白质。

从图5可以看出，使用LC-MS/MS和SEC时，7-19个氨基酸的β-乳球蛋白衍生肽的7-10个氨基酸的和11-19个氨基酸的β-乳球蛋白衍生肽的百分比相似。

因此，图5所示的数据表明，LC-MS/MS数据集中不同氨基酸长度范围内的肽的数量可用于提取有关肽相对分布的定量信息，因为数据与SEC数据相当，并且SEC方法是定量的。此外，图5显示样品13(不属于本发明)比根据本发明所述的水解产物具有更多的具有更小肽尺寸的肽。

样品1、2、3、13、15和16中包含苯丙氨酸的可检测肽的量占肽总数的百分比通过MS-LC/MS鉴定和分析。结果如图6所示。

不受任何理论的束缚，本发明的发明人认为，肽中苯丙氨酸的存在与苦味相关，当苯丙氨酸的氨基或羧基末端被与另一个氨基酸残基的肽键封闭时，苯丙氨酸的苦味可能会增强。例如，在苦味乳清蛋白水解物中鉴定的苦味肽YPFPGPIPN中的苯丙氨酸残基被认为是主要的苦味决定因素(Liu.X..Jiang.D..和Peterson.D.G.Identification of BitterPeptides in whey protein hydrolysate.J.Agric.Food Chem.2014.62:5719-5725)。

图6显示了肽中苯丙氨酸含量占源自β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和β-酪蛋白的肽总数的百分比。对于肽尺寸小于9个氨基酸残基的较少苦味的水解产物，包含苯丙氨酸的肽的百分比较低。因此，对于样品1和3中的根据本发明所述的乳清蛋白水解物，苯丙氨酸存在于具有较大肽尺寸的肽中。由样品2、15和16代表的根据本发明所述的乳清蛋白水解物也具有低百分比的含苯丙氨酸的肽，但此外，样品2、15和16还表现出总体上较低百分比的结合在肽中的苯丙氨酸。这表明，与样品1、3和13相比，样品2、15和16中可能存在更多以游离氨基酸形式存在的苯丙氨酸。因此，非苦味的根据本发明所述的乳清蛋白水解物的指示是大百分比的苯丙氨酸存在于较大的肽中或作为游离氨基酸存在。

在图7中，显示了来自β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和β-酪蛋白的5-19个氨基酸的肽的百分比。

从图7可以看出，样品13(在本发明之外)包含比其他五种乳清蛋白水解物更多的小肽(5-9个氨基酸)。不受任何理论的束缚，本发明的发明人认为，样品13的水解物中肽大小较小的含苯丙氨酸的肽的含量较高可能是样品13中苦味高于作为根据本发明所述的水解物的样品1、2、3、15和16的原因。

实施例9：SEC尺寸分布数据

通过尺寸排阻色谱(SEC)分析样品1、2、3、13、15和16中肽的尺寸。

结果如下表6所示：

表6：样品1、2、3、13、15和16中乳清蛋白水解物的SEC尺寸分布数据、DH和游离氨基酸(FAA)含量

尺寸排阻色谱数据不能准确说明游离氨基酸，因为数据是通过在主要预计肽键吸收的214nm处测量获得的。

因此，游离氨基酸的含量是通过不同的方法测量的(参见实施例10)。与样品13中的参照乳清蛋白水解物相比，根据本发明所述的乳清蛋白水解物具有更高的游离氨基酸含量。然而，参照乳清蛋白水解产物(样品13)中小肽的含量高于本发明的乳清蛋白水解产物。例如，样品13中750Da以下的肽含量超过50％。相反，本发明的乳清蛋白水解物中750Da或更小的肽含量低于40％。此外，样品13包含比本发明的乳清蛋白水解物更少的2500Da或以上的肽。

当将这些数据与实施例8的数据进行比较时，很明显样品2、15和16的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和β-酪蛋白衍生肽中苯丙氨酸的总含量较低，这是因为这些苯丙氨酸残基从肽中被释放到游离氨基酸部分中。因此，一种减少水解产物苦味的方法可以是鉴定特异地将苯丙氨酸浓缩在总水解产物的游离氨基酸部分中的酶组合。

实施例10：测定游离氨基酸含量

测量本发明的乳清蛋白水解物中的游离氨基酸含量并与参照乳清蛋白水解物(本发明之外)进行比较。结果如下表7所示。

表7：游离氨基酸含量(mg/100g蛋白质(Nx6.38))

由表7可知，本发明的乳清蛋白水解物中的游离氨基酸含量为总蛋白含量的4重量％-14重量％。相反，参照水解产物(样品13)中的游离氨基酸含量约为总蛋白质含量的0.4重量％。

此外，表7显示本发明的乳清蛋白水解物中游离亮氨酸的含量远高于样品13中的游离亮氨酸。本发明的乳清蛋白水解物中游离亮氨酸的含量为总蛋白含量的1-4重量％。相反，样品13中游离亮氨酸的含量为总蛋白质含量的约0.15重量％。

更重要的是，如实施例8和9所示，样品2、15和16中游离苯丙氨酸的浓度高于样品1、3和13。在表8中显示了以总氨基酸含量计的游离氨基酸百分比。

表8：总氨基酸的游离氨基酸(％)

特别值得注意的是，本发明的乳清蛋白水解物中游离亮氨酸占总亮氨酸含量的百分比远高于参照水解物(样品13)。

重要的是，表8显示，对于样品2、15和16中的根据本发明所述的乳清蛋白水解物，6-12％的苯丙氨酸呈游离苯丙氨酸形式。对于样品1和3中的根据本发明所述的乳清蛋白水解物，未发现其游离形式的苯丙氨酸。

实施例11：本发明的乳清蛋白水解物中矿物质的含量

测量样品15和16中矿物质的量。结果如下表9所示。

表9：矿物质的含量

表9显示了样品15和16的矿物质含量和浊度，作为乳清蛋白水解物矿物质含量的一个例子。表9中的产品在22℃的4％蛋白质溶液中的pH值为7.8。

实施例12：水解物中未降解的BSA

在本发明的乳清蛋白水解物(样品1、2、3、4、15和16)中测量未降解的牛血清白蛋白(BSA)的量。BSA的含量通过使用SDS-PAGE和来自Sigma Aldrich的BSA标准品(产品代码为A2153)进行估计(图9A)。加载到20％孔中的BSA量对应于10μg纯BSA。添加到图9B所示的SDS-PAGE凝胶每个孔中的蛋白质总量对应于50μg蛋白质。将蛋白质样品以10mg/ml与Laemmli样品缓冲液和2-巯基乙醇混合至最终浓度为3％蛋白质，然后在95℃下孵育5分钟，然后上样到凝胶中。

图9A中的SDS-PAGE凝胶是一个滴定系列，显示了BSA的预期强度，如果它代表图9B中乳清蛋白总量的20％、10％、5％、2.5％、1.25％或0.63％。将不同浓度标准品的SDS-PAGE凝胶与图9B中显示的具有不同乳清蛋白水解物样品的SDS-PAGE凝胶进行比较，从左至右为：分子量标准品、样品2、样品1、样品3、样品4、样品15和样品16。

从图9A和9B可以得出结论，本发明的乳清蛋白水解物中的未降解BSA(图9B)在0.5-2重量％的范围内，因为图9B中条带的强度对应于图9A中0.63％和1.25％的样品强度。BSA对根据本发明所述使用的酶的蛋白水解具有抗性。

实施例13：用于运动营养的UHT处理饮料

实施例13显示了根据本发明所述的乳清蛋白水解物在制备适用于运动营养的饮料中的用途的实例。该饮料旨在供运动员或其他运动或锻炼相关应用使用。

将样品16的粉末在水中重构并添加糖和调味剂以制备饮料。成分的量显示在下表10中。

表10显示了一种中性味道的饮料，没有令人不快的苦味，可以通过直接和间接UHT处理以及巴氏杀菌进行热处理，而不会产生进一步的混浊。

表10：运动饮料

对表10中所示的运动饮料进行1)直接UHT、2)间接UHT和3)巴氏杀菌。直接UHT处理通过在143℃下注射6秒进行。间接UHT处理在管式换热器上在143℃下进行6秒。巴氏杀菌是在90℃下进行6.5分钟。在5℃下将饮料倒入烧瓶中。所有溶液在22℃下的pH值约为7.7。4.9g/100g本发明的乳清蛋白水解物的含量对应于4.0重量％的蛋白质。

图8是从左到右显示未处理饮料、直接UHT处理饮料、间接UHT处理饮料和巴氏杀菌饮料的图片。饮料在室温下。图8显示所有样品都澄清透明，可以看到瓶子后面的背景。

测定4种饮料的散射浊度，结果见表11。

表11：测量的饮料浊度，单位为NTU

因此，从表11可以看出，热处理样品的浊度均低于100NTU。因此，热处理不会影响饮料的浊度，其外观仍然澄清或透明。

这些饮料不被认为是苦味的。

实施例14：临床/医用饮料

实施例14是根据本发明所述的乳清蛋白水解物在制备适用于医疗或临床营养的饮料中的用途的实例。除了本发明的乳清蛋白水解物之外，临床饮料还包含大量碳水化合物。

将样品16的粉末在水中重构并添加碳水化合物和调味剂以制备饮料。成分的量显示在下表12中。

表12显示了没有令人不快的苦味的中性味道的药用饮料。

表12：医用饮料

实施例15：碳酸饮料

实施例15显示了根据本发明所述的乳清蛋白水解物在制备碳酸饮料中的用途的实例。

将样品16的粉末在水中重构并添加糖和调味剂以制备饮料。成分的量显示在下表13中。通过向饮料中添加二氧化碳直到饮料包含每体积饮料2.5体积的二氧化碳来使饮料碳酸化。

表13：碳酸饮料

实施例16：碳酸化——碳酸化量如何影响pH值

将样品16重新悬浮在水中以制备8％的蛋白质溶液。在5℃下强制使溶液碳酸化。

随着更多CO₂的引入，随着时间的推移测量溶液的质量增加和pH值。当容器中的平衡压力达到约1巴时，不再吸收CO₂(强制碳酸化下使用的压力为5℃时为3巴)。

图10显示了测量的pH值，该pH值取决于添加到碳酸溶液中的CO₂量。图10显示，当包含样品16的乳清蛋白水解物的溶液被碳酸化至每体积溶液的CO₂含量为0-4体积时，导致pH在5.5-8.25之间。非碳酸化溶液的pH值为8.25，而pH值随着碳酸化量的增加而降低。

图10显示，添加CO₂至约2.5体积(4.9g/L)/体积溶液导致pH在5℃下从8.25降至约6.0。

图10还显示pH值达到最小值，约为5.5-6.0。因此，可以得出结论，每体积溶液添加超过2.5体积的CO₂不会将pH值降低至低于约5.5-6.0。

碳酸化对溶液或饮料的pH值的影响还通过测量以下溶液/饮料的pH值进行分析，这些溶液/饮料被碳酸化至每体积溶液/饮料2.5体积CO₂：

-通过将样品16重新悬浮在水中制备的4％蛋白质溶液

-通过将样品16重新悬浮在水中制备的8％蛋白质溶液

-包含8％样品16的饮料

结果如图11所示。

包含8％样品16的饮料包含以下成分：

图11显示当碳酸化至CO₂含量为每体积溶液2.5体积CO₂时，样品16的4％和8％溶液以及由样品16制备的饮料都具有约6.0的pH。

实施例17：碳酸化溶液的热处理分析

如实施例16中公开的，用每体积溶液2.5体积CO₂使样品16的8％蛋白质溶液碳酸化。

在带有数据记录的密闭容器中将溶液加热至95℃。在不同加热时间测量温度、pH和浊度，结果如图12所示。

如图12所示，碳酸化产品在加热过程中和在95℃下5分钟后保持澄清，如测量的浊度和目视检查所示。通过加热，pH值保持在6.2。这些数据表明，碳酸化产品可能适用于诸如巴氏杀菌和高压灭菌之类的处理，主要是在高至120℃的温度下进行长时间的处理，例如20分钟。

实施例18：蛋白棒

实施例17显示了根据本发明所述的乳清蛋白水解物在制备蛋白棒中的用途的实例。

表14是蛋白棒的实例，其具有的本发明的乳清蛋白水解物(粉末)的含量为5g/100g。

表14：蛋白棒

表15中显示了蛋白棒的另一个实例，但该实例中乳清蛋白水解物(粉末)的含量为13g/100g。

表15：蛋白棒

实施例19：使用DPPH测定分析抗氧化活性

本发明的乳清蛋白水解物的抗氧化作用通过使用DPPH测定，即自由基清除试验进行分析。该测定通过使用DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼基水合物)测量抗氧化作用，因为DPPH的颜色在与抗氧化肽反应后会从紫色变为黄色。

将DPPH溶于甲醇中至浓度为0.2mM。将本发明的乳清蛋白水解物(样品16)分散在MilliQ水中至不同蛋白质含量(0、0.8、1.5、2.5、3.0、4.0、5.0和6.0％蛋白质)并与等体积的DPPH混合(比例1:1)。将混合物在22℃下温育2小时以允许由于抗氧化活性而产生黄色。测量525nm处的吸光度并将清除百分比计算为100x(A₀-A_S)/A₀，其中A₀是没有样品时的吸光度，而A_S是有样品时的吸光度。

表16显示了不同浓度的本发明的乳清蛋白水解物(样品16)的清除百分比。

表16：

从表16中可以看出，当在DPPH测定中以0.8-6％的蛋白质浓度被包含在内时，样品16的乳清蛋白水解物具有抗氧化活性。如表16所示，抗氧化活性随着蛋白质浓度的增加而增加。