具体实施方式

以下，对本发明的一个实施方式进行详述。

＜抗菌性组合物＞

本发明涉及一种抗菌性组合物，其含有使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物，且对不动杆菌具有抗菌性。以下，对本发明进行具体说明。

“使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物”是指将溶菌酶与壳聚糖通过例如美拉德反应等而结合的复合物(参照图1)。通过使溶菌酶与水溶性壳聚糖通过美拉德反应而结合，从而使溶菌酶中的大部分或全部的抗原结构被掩盖，因此具有即使人类摄入溶菌酶-壳聚糖复合物也不易引起过敏的特征。除此以外，也可以使用交联剂使溶菌酶与壳聚糖共价结合而得到上述复合物。

这里，“溶菌酶”是水解粘多糖类的酶，可优选使用来自鸡的溶菌酶、来自人类的溶菌酶。

溶菌酶的分子量的上限例如为30000Da以下，更优选为25000Da以下，也可以是20000Da以下、18000Da以下、15000Da以下。另外，溶菌酶的分子量的下限没有特别限定，例如为1000Da以上，优选为5000Da以上，也可以是10000Da以上、12000Da以上。该溶菌酶的分子量的范围可以是上述任一上限值和下限值之间的范围，例如为1000Da～30000Da，优选为5000Da～20000Da，更优选为10000Da～15000Da。

“壳聚糖”为以下的化学式(I)表示的聚-β1→4-氨基葡萄糖((C₆H₁₁NO₄)_n、CAS登录号9012-76-4)。

该壳聚糖为水溶性。壳聚糖的分子量的上限例如为30000Da以下，更优选为20000Da以下，也可以是15000Da以下、10000Da以下、7000Da以下。另外，壳聚糖的分子量的下限没有特别限定，例如为300Da以上，优选为500Da以上，也可以是1000Da以上、3000Da以上。该壳聚糖的分子量的范围可以是上述任一上限值和下限值之间的范围，例如为300Da～30000Da，优选为500Da～15000Da，更优选为1000Da～10000Da，特别优选为3000Da～7000Da。如果着眼于抗菌性，则分子量大的壳聚糖更为有利，如果着眼于制造的容易度，则分子量小的壳聚糖的溶解性和稳定性更良好，低分子量的壳聚糖更为有利。

应予说明，在此所提到的壳聚糖除了上述壳聚糖之外，还包含壳寡糖、氨基葡萄糖。壳寡糖是上述式(I)所示的数个左右的D氨基葡萄糖连接而成的物质，是指低分子的壳聚糖或者用盐酸或酶将狭义的壳聚糖水解而成的物质。

作为上述交联剂，例如可举出胺反应性交联剂(例如烷氧基胺)、羰基反应性交联剂(例如肼化合物)、和巯基反应性交联剂等。

溶菌酶/壳聚糖的质量比例如为99/1～1/99，优选为90/10～10/90，更优选为80/20～20/80，进一步优选为60/40～40/60，特别优选为50/50。

作为具体的使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物的制造方法，例如可举出如下的方法。首先，将上述质量比的溶菌酶与壳聚糖在水中混合溶解，以得到的水溶液中的溶菌酶和壳聚糖的合计质量为5～30质量％的方式进行制备。将得到的水溶液冻干，进行粉末化。使得到的粉末在例如50～80℃、优选为55～65℃的温度和例如50～80％、优选为60～70％的相对湿度的条件下进行例如2～20日、更优选为7～14日的美拉德反应，从而可以制造本发明的使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物。

可以使用各种公知的方法来确认本实施方式的溶菌酶-壳聚糖复合物是否生成，例如，可以通过将SDS(十二烷基硫酸纳)、SDS-PAGE(十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺)聚丙烯酰胺电泳得到的板进行染色处理，来确认作为蛋白质-壳聚糖复合物的高分子物质的生成。

“不动杆菌”(Acinetobacter)是需氧性的革兰氏阴性菌的一种，是革兰氏阴性杆菌的真细菌的一种，是不动杆菌属的菌。对于不动杆菌属的不动杆菌，已知有乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)等，鲍氏不动杆菌(JCM 6841)作为感染症、特别是呼吸系统的感染症的原因菌而被知晓。本发明具有如下特征：特别是对于不动杆菌属菌、不动杆菌、进而未获得耐药性的多重耐药性不动杆菌是有效的。

本发明对“不动杆菌”、“多重耐药性不动杆菌”具有抗菌性。在此，抗菌性广义上包含除菌、杀菌、抗菌等，是指在菌数为同等或其以下的情况下，至少不使菌增殖的所有的状态。应予说明，除菌是指所有除去菌的含义，包含杀菌的含义。杀菌是指至少杀灭一部分菌。因此，本发明中抗菌性组合物是指包含除菌性组合物、杀菌性组合物、除菌剂、杀菌剂和抗菌剂的含义。

本发明进而对“不动杆菌感染症”、“多重耐药性不动杆菌感染症”的治疗和预防有效。这里，“治疗”除了包含将作为本发明对象的炎症完全治愈之外，还包含抑制炎症而使其严重程度降低。“预防”除了包含没有作为本发明对象的炎症的病历的情况，还包含在治愈作为本发明对象的炎症后防止该炎症复发。

本发明的抗菌组合物中，除了上述复合物之外，还可以任意包含1种以上的其它有效成分。作为其它有效成分，除了包含其自身作为有效成分发挥作用的成分之外，还包含其自身不作为有效成分发挥作用但通过与作为本发明有效成分的上述复合物并用来发挥效果的成分(助剂)。作为其它有效成分，例如可举出萜烯醇、脂肪酸、和/或该脂肪酸的盐。通过添加这些萜烯醇、脂肪酸、和/或该脂肪酸的盐，从而可以与本发明的复合物相配合而得到累加效果和协同效果。作为萜烯醇，例如可举出萜品烯-4-醇、桧木醇、牻牛儿醇和薄荷醇等。作为脂肪酸，例如可举出碳原子数8～12的脂肪酸，优选为癸酸(capric acid)或月桂酸。作为脂肪酸的盐，例如可举出钠盐、钾盐、镁盐和钙盐等。除此以外，作为该其它有效成分，还可以添加已知对由中性粒细胞引起的炎症有效果的从柠檬草、留兰香、天竺葵、紫苏等得到的精油、以及氨基葡萄糖。

本发明的抗菌组合物中，除了上述复合物之外，还可以任意包含1种以上的其它成分。作为其它成分，可以添加例如赋形剂、粘合剂、乳化剂、溶剂、粘接剂、崩解剂、增稠剂、润滑剂、着色剂、流动剂、保湿剂等添加剂。

作为保湿剂，例如可举出甘油、丁二醇、胶原蛋白、透明质酸和神经酰胺。

作为粘合剂，例如可举出纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素钠。

作为乳化剂，例如可举出卵磷脂、聚乙二醇(PG)、PG-氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、和Ceteth等。

作为溶剂，例如可举出水、乙醇、1-丁醇、2-丁醇、1-丙醇、2-丙醇、1-戊醇等。

在本发明的抗菌组合物1mL中，例如适当地含有本发明的溶菌酶-壳聚糖复合物10μg/mL～200000μg/mL，优选为100μg/mL～100000μg/mL，更优选为50μg/mL～50000μg/mL，进一步优选为100μg/mL～10000μg/mL，特别优选为200μg/mL～5000μg/mL。另外，本发明的抗菌组合物中，例如适当地含有其它有效成分0.001质量％～5.0质量％，优选含有0.002质量％～0.2质量％，更优选含有0.005质量％～0.1质量％，进一步优选含有0.01质量％～0.05质量％，特别优选含有0.02质量％～0.04质量％。进而，其它成分需要根据各成分而适当调节适当的含量，例如含有0.1质量％～90质量％，优选含有1质量％～70质量％，更优选含有10质量％～50质量％。应予说明，本发明的抗菌组合物可以基本上为水等溶剂，例如在本发明的抗菌组合物中，含有95质量％以上的溶剂，优选含有98质量％以上，更优选含有99质量％以上，进一步优选含有99.5质量％以上。另外，在本发明的抗菌组合物中，例如适当地含有月桂酸和癸酸(capric acid)这样的碳原子数8～12的脂肪酸或该脂肪酸的盐0.001质量％～5质量％，优选含有0.005质量％～1质量％，更优选含有0.01质量％～0.5质量％，特别优选含有0.04质量％～0.2质量％。

＜治疗/预防方法以及所使用的医药组合物＞

本发明可以包含：给予对象含有使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物的医药组合物从而治疗、抑制或预防不动杆菌感染症、优选为多重耐药性不动杆菌感染症的方法，以及所使用的医药组合物。可以认为，该治疗、抑制或预防效果来自于使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物的上述抗菌性，特别对呼吸系统的疾病有效。在此，该医药组合物包含上述抗菌性组合物，在可以包含其它的有效成分等方面、含量、含有率等上，全部与上述的抗菌性组合物同样。

这里，“对象”除人类外，还包含猫、狗、猴、牛、马等哺乳动物。

溶菌酶、壳聚糖等各自的定义、其它有效成分、其它成分、给药量、给药方式、给药方法等如上所述。

[给药量、给药方式、给药方法]

本发明的抗菌性组合物和医药组合物根据其剂型、给药对象、给药途径、目标疾病、症状等而不同，例如，在为对人体皮肤进行喷雾的喷雾剂方式的情况下，一日给药量例如为0.1～20mg/kg体重，优选为0.2～10mg/kg体重，进一步优选为0.5～10mg/kg体重，优选将该量以1日1次～数次(例如2次、3次、4次或8次)进行给药。该给药量除了可以适用于喷雾剂以外，还可以适用于以下说明的乳膏等其它的制剂中。

本发明的抗菌性组合物和医药组合物可以是口服给药，也可以是非口服给药，它们的制剂化不需要特别的技术，可以使用通用的技术来进行制剂化。作为给药剂型，可举出乳膏、软膏、糊剂、液体剂、喷雾剂、凝胶剂、注射剂、片剂、栓剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、滴眼剂、眼软膏等，特别优选乳膏、软膏、糊剂、液体剂、喷雾剂。

本发明的抗菌性组合物和医药组合物可以结合上述给药方式来选择适当的给药方法。给药方法可以是公知的给药方法，例如在乳膏的情况下，可以在炎症处以上述给药量涂布本发明的医药组合物。

＜用途＞

另外，本发明可以包含：使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物在制造治疗或预防多重耐药性不动杆菌感染症的医药组合物中的应用。

在制造治疗或预防不动杆菌感染症、优选为多重耐药性不动杆菌感染症的医药组合物中，使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物可以与复合物以外的该医药组合物的成分一并混合，成为该医药组合物。作为该混合方法，可以使用公知的方法，例如在液体剂的情况下，可以在水等溶剂中加入使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物和上述任意的其它成分，进行混合，根据需要加入乳化剂并混合，制成分散剂或乳液，由此制备液体剂。

该抗菌性组合物可以制成用于喷雾器的清洗水。由此，通过将抗菌性组合物直接喷雾到感染部位，从而可以抑制感染菌的增殖。

另外，本实施方式的抗菌性组合物和医药组合物例如对不动杆菌、优选多重耐药性不动杆菌具有抗菌效果、菌的增殖抑制效果，以及对由它们引起的感染症具有治疗、抑制、预防效果而且还具有防止获得耐药性的效果。

以下，列举实施例对本发明进行进一步的详细说明，但是本发明不仅仅限定于这些实施例。应予说明，本说明书和图例中，使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物是指溶菌酶-壳聚糖复合物、或LYZOX(Wako Filter Technology Co.,Ltd.的注册商标)。

实施例

[试样的制备]

·溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液

作为使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物(溶菌酶-壳聚糖复合物)的溶液，使用市售的LYZOX(注册商标，Wako Filter Technology Co.,Ltd.制)。市售的LYZOX(注册商标)是以1:1的质量比包含来自鸡的溶菌酶(约14000Da)和约5000Da的水溶性壳聚糖(壳寡糖)的粉末。具体来说，将上述溶菌酶与水溶性壳聚糖在水中混合溶解，之后，利用冻干制成粉末状，进一步在对于美拉德反应完全结束充分的温度、湿度和天数的条件下，通过美拉德反应，得到本发明中使用的溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))。将该溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))以各实验例中该溶菌酶-壳聚糖复合物成为期望的浓度的方式与规定的溶剂混合，制成目标溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液。

·溶菌酶单体的溶液

关于溶菌酶单体的溶液，将溶菌酶(Japan Biocon Co.,Ltd.制、爱知县)以各实验例中该溶菌酶成为期望的浓度的方式与规定的溶剂混合，制成目标溶菌酶单体的溶液。

·壳聚糖单体的溶液

关于壳聚糖单体的溶液，将壳寡糖(Kimika Co.,Ltd.制Kimika壳寡糖COS-A)用作壳聚糖，以各实验例中该壳寡糖成为期望的浓度的方式与规定的溶剂混合，制成目标壳聚糖单体的溶液。

·溶菌酶和壳聚糖的混合物的溶液

关于溶菌酶和壳聚糖的混合物，以上述溶菌酶单体:壳聚糖单体的质量比为1:1的方式将两者混合，进而以该混合物、溶菌酶和壳聚糖成为期望的浓度的方式混合规定的溶剂，进行制备。

·不动杆菌细菌悬浮液

只要没有特别说明，将鲍氏不动杆菌(JCM 6841)在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中于37℃增殖一晩，在对数增殖期进行离心分离，进行集菌。将得到的细菌与各试验中规定量的各种溶剂混合，得到不动杆菌细菌悬浮液。

·铜绿假单胞菌细菌悬浮液

使用铜绿假单胞菌(NBRC 13275或PAO1)代替鲍氏不动杆菌(JCM 6841)，除此以外，只要没有特别说明，与上述的不动杆菌细菌悬浮液同样地制备细菌悬浮液。

具体的各实验例的详细内容如下所述。

·吸光度测定

只要没有特别说明，在本实施例的吸光度的测定中使用AS ONE株式会社制的分光光度计ASV11D。实际的吸光度的测定中，考虑能用该分光光度计测定的吸光度，根据需要将试样稀释进行测定，算出吸光度。

实验例1(杀菌试验)

在与溶菌酶和壳聚糖的混合物等的比较中，测定溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))对不动杆菌等的杀菌性。

具体来说，对于上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液(2000μg/mL、使用生理盐水作为溶剂)、以及溶菌酶和壳聚糖的混合物的溶液(溶菌酶单体的溶液[1000μg/mL]和壳聚糖单体的溶液[1000μg/mL]、使用生理盐水作为溶剂)，在每1.0mL的溶液中加入30μL的1.0M磷酸缓冲液(pH7.2)，调节至中性pH(7.0～7.3)，准备各溶液。作为对照，使用生理盐水(0.9％NaCl溶液)。不动杆菌细菌悬浮液或铜绿假单胞菌细菌悬浮液如下制备：将铜绿假单胞菌(NBRC 13275或PAO1)或鲍氏不动杆菌(JCM 6841)在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中于37℃增殖一晚，在对数增殖期进行离心分离，进行集菌，用生理盐水(0.9％NaCl)将细菌再悬浮，使最终悬浮液浓度成为在600nm下吸光度为1.0(10⁸～10⁹CFU/mL)。

在上述溶菌酶-壳聚糖复合物等的各溶液10mL中，分别加入0.1mL的上述不动杆菌细菌悬浮液或铜绿假单胞菌细菌悬浮液(1×10⁷-10⁸CFU)，使用水浴，在37℃进行孵育。在从孵育开始经过0分钟、30分钟、60分钟和120分钟时，将各溶液每次0.1mL加入到固体培养基(Mueller-Hinton培养基)，增殖一晩后，进行菌数测定。各细菌悬浮液相对于各溶液的试验各实施3次，进行测定。结果示于图2A～C。

其结果是，在不动杆菌中(图2C)，溶菌酶-壳聚糖复合物在60分钟、120分钟时，相比于对照，菌数显著地减少。

实验例2(杀菌试验)

测定对于各浓度的溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))的、铜绿假单胞菌(NBRC 13275)的杀菌效果。具体来说，作为上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液，将生理盐水(0.9％NaCl溶液)用作溶剂，准备浓度不同的溶液(200μg/mL、2000μg/mL和10000μg/mL)，与上述实验例1同样地重复实验，进行铜绿假单胞菌(NBRC 13275)的菌数测定。结果示于图2D。如图2D所示那样，溶菌酶-壳聚糖复合物显示出浓度依赖性的杀菌活性。

实验例3(增殖抑制效果试验)

在与溶菌酶单体、壳聚糖单体、以及溶菌酶和壳聚糖的混合物的比较中，测定溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))对不动杆菌等的增殖抑制效果。

具体来说，使用胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)溶液(Japan Becton Dickinson Co.,Ltd.制)作为溶剂，制备上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液(2000μg/mL)、溶菌酶单体的溶液(1000μg/mL)、壳聚糖单体的溶液(1000μg/mL)、以及溶菌酶和壳聚糖的混合物的溶液(溶菌酶单体的溶液[1000μg/mL]和壳聚糖单体的溶液[1000μg/mL])，在各溶液中每1.0mL的溶液加入10μL的1.0M磷酸缓冲液(pH7.2)，调节至中性pH(6.8～7.3)，准备各溶液。作为对照，使用无添加的TSB培养基。不动杆菌细菌悬浮液或铜绿假单胞菌细菌悬浮液与上述实验例1同样地制备。在上述溶菌酶-壳聚糖复合物等的10mL各溶液中，分别加入进一步稀释2000倍的上述不动杆菌细菌悬浮液或铜绿假单胞菌细菌悬浮液50μL(2.5×10³～10⁴CFU)，在37℃孵育6小时。在6小时后，将各溶液0.1mL分别加入到固体培养基(Mueller-Hinton培养基)增殖一晩后，进行菌数测定。各细菌悬浮液相对于各溶液的试验，通过铜绿假单胞菌(NBRC 13275)为18次、铜绿假单胞菌(PAO1)和不动杆菌为各8次的独立实验，以重复形式(3次测定的平均和SEM(样本平均值的标准差))进行测定。结果示于图3A～C。应予说明，为了使质量浓度与各构成成分(溶菌酶、壳聚糖)一致，将溶菌酶单体和壳聚糖单体与该溶菌酶单体和壳聚糖单体的2倍浓度的溶菌酶-壳聚糖复合物进行对比来比较抗菌作用。

其结果是，在不动杆菌中(图3C)，溶菌酶-壳聚糖复合物相比于对照，菌数显著地减少。

实验例4(增殖抑制效果试验)

测定对于各浓度的溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))的、铜绿假单胞菌(NBRC 13275)的增殖抑制效果试验。具体来说，作为上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液，将TSB用作溶剂，准备浓度不同的溶液(2000μg/mL、5000μg/mL和10000μg/mL)，与上述实验例3同样地重复实验，进行铜绿假单胞菌(NBRC 13275)的菌数测定。结果示于图3D。如图3D所示那样，溶菌酶-壳聚糖复合物显示出浓度依赖性的增殖抑制效果。

实验例5(细胞膜的完整性试验)

通过在260nm(A_260nm)下的吸光度的测定，推测从细胞质释放的核酸的量，评价细胞膜的完整性。如果细菌的细胞膜因抗菌剂而受损，则细胞内成分会释放到细胞外。在260nm下的吸光度的测定可用于推测从细胞质释放的DNA和RNA的量。

具体来说，对于是否从细菌内释放在260nm有吸收的物质，使用Thermo FisherScience Co.,Ltd.制ND-1000测定260nm的吸收，从而进行评价。作为上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液，使用0.5％NaCl溶液作为溶剂，准备浓度不同的溶液(4000μg/mL、10000μg/mL、和20000μg/mL(与细菌悬浮液混合后的最终浓度为2000μg/mL、5000μg/mL和10000μg/mL))，进而在每1.0mL的溶液中加入60μL的1.0M磷酸缓冲液(pH7.2)，调节至中性pH(6.6～7.1)，准备各溶液。作为对照，使用0.5％NaCl溶液。使与实验例1同样制备的铜绿假单胞菌细菌悬浮液和不动杆菌细菌悬浮液在0.5％NaCl溶液中再悬浮，以使最终悬浮液浓度成为在420nm下的吸光度为0.7的方式进行制备。在上述溶菌酶-壳聚糖复合物等的10mL各溶液中，加入上述不动杆菌细菌悬浮液或铜绿假单胞菌细菌悬浮液，使用水浴，在37℃进行孵育。在从孵育开始经过20分钟、40分钟、60分钟、80分钟、100分钟和120分钟时，对于各溶液，使用0.22μm针筒过滤器除去细菌，测定260nm(A_260nm)下的吸光度。吸光度表示为3次测定的平均值和SEM(样本平均值的标准差)，其结果示于图4A和B。

其结果是，吸光度260nm显示出浓度依赖性的增加(图4)。在用各浓度的使溶菌酶与壳聚糖结合而得到的复合物处理各细菌悬浮液的情况下，吸光度260nm在最初的20分钟急剧增加，之后到120分钟为止上升率减少。因此，溶菌酶-壳聚糖复合物与对照相比可知：在不动杆菌中显示出更高的吸光度。

实验例6(NPN测试试验)

通过NPN测试(1-N-苯基萘胺(NPN)摄入测定)来确定细胞外膜透过性。1-N-苯基萘胺在磷脂环境下会强烈地发出荧光，在水性环境下会微弱地发出荧光。该性质可用于评价细菌的细胞外膜的透过性、即膜损伤。

具体来说，对于试样，用荧光分光光度计(岛津制作所株式会社制、RF-6000)测定激发波长350nm和发光波长420nm下的荧光强度，进行评价。作为上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液，使用0.5％NaCl溶液作为溶剂，准备浓度不同的溶液(20μg/mL和40μg/mL(与细菌悬浮液混合后的最终浓度为10μg/mL和20μg/mL))，进而在每1.0mL的溶液中加入60μL的1.0M磷酸缓冲液(pH7.2)，调节至中性pH(7.2～7.3)，准备各溶液。作为对照，使用0.5％NaCl溶液。在这些溶液中加入30μL的1.0mM NPN溶液。使与实验例1同样制备的铜绿假单胞菌细菌悬浮液和不动杆菌细菌悬浮液在0.5％NaCl溶液中再悬浮，以使最终悬浮液浓度成为在420nm下的吸光度为1.0的方式进行制备。向在上述溶菌酶-壳聚糖复合物等中加入了NPN溶液而得到的各溶液中加入上述不动杆菌细菌悬浮液或铜绿假单胞菌细菌悬浮液，在室内气氛下孵育，对于各溶液，使用上述荧光分光光度计，测定10分钟激发波长350nm和发光波长420nm下的荧光强度。测定进行3次，从包含细菌的溶液的荧光强度中减去不含细菌的溶液的荧光强度，作为相对荧光单位(RFU)而得到结果。结果示于图5A和B。

在各种细菌中，荧光强度在1分钟后增加，之后停留在相同水平。溶菌酶-壳聚糖复合物显示出浓度依赖性的增殖抑制效果。溶菌酶-壳聚糖复合物显示出从与不动杆菌接触的1分钟以内，使细胞外膜透过性增加。由此可知，溶菌酶-壳聚糖复合物从与不动杆菌接触的1分钟以内，使细胞外膜透过性增加。

实验例7(ONPG测试试验)

通过ONPG测试(邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)测试)来确定细胞内膜透过性。如果细胞膜受到损伤，则包含β-半乳糖苷酶的细胞内酶会泄露到细胞外。ONPG通常为无色，但会被β-半乳糖苷酶水解为半乳糖和邻硝基苯酚，在420nm下的吸光度会上升。细菌的细胞内膜透过性可以通过以ONPG为底物、测定从细菌释放的细胞质β-半乳糖苷酶的活性而确定。

具体来说，对于是否释放在420nm有吸收的物质，使用分光光度计ASV11D测定420nm的吸收，从而进行评价。作为上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液，使用0.5％NaCl溶液作为溶剂，准备浓度不同的溶液(400μg/mL、4000μg/mL和10000μg/mL(与细菌悬浮液混合后的最终浓度为200μg/mL、2000μg/mL和5000μg/mL))，进而在每1.0mL的溶液中加入60μL的1.0M磷酸缓冲液(pH7.2)，调节至中性pH(6.8～7.3)，准备各溶液。作为对照，使用0.5％NaCl溶液。使与实验例1同样制备的铜绿假单胞菌细菌悬浮液和不动杆菌细菌悬浮液在0.5％NaCl溶液中再悬浮，以使最终悬浮液浓度成为在420nm下的吸光度为1.2的方式进行制备。将上述溶菌酶-壳聚糖复合物等的各溶液1.6mL、150μL的30mM ONPG溶液、和上述不动杆菌细菌悬浮液或铜绿假单胞菌细菌悬浮液1.6mL混合，在室内气氛下孵育，在开始后到100分钟为止，每10分钟测定吸光度。420nm(A_420nm)下的吸光度的增加通过3次测定而评价。结果示于图6A和B。

对于不动杆菌，在使用溶菌酶-壳聚糖复合物(2000μg/mL和5000μg/mL)的情况下的吸光度420nm在最初急剧增加，之后直到100分钟为止缓慢增加。用溶菌酶-壳聚糖复合物(200μg/mL)处理的不动杆菌中，吸光度420nm在最初的10分钟增加，之后为恒定。在各种细菌中，吸光度420nm为浓度依赖地增加。细胞内酶在接触后10分钟以内浓度依赖地漏出到细胞外。可知，溶菌酶-壳聚糖复合物破坏了不动杆菌的内膜。

实验例8(共聚焦激光扫描显微镜观察)

为了将用溶菌酶-壳聚糖复合物处理后的细菌的细胞膜的损伤可视化，用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行观察(图7中比例尺＝25μm)。

具体来说，将生理盐水(0.9％NaCl溶液)用作溶剂，准备上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))的2000μg/mL溶液(与细菌悬浮液混合后的最终浓度为1000μg/mL)，进而在每1.0mL的溶液中加入60μL的1.0M磷酸缓冲液(pH7.2)，调节pH为中性(pH 7.0～7.1)，准备溶菌酶-壳聚糖复合物溶液。作为对照，使用生理盐水(0.9％NaCl溶液)。在这些溶液500μL中，加入与上述实验例1同样地制备的铜绿假单胞菌细菌悬浮液和不动杆菌细菌悬浮液500μL，在37℃孵育2小时。之后，加入3μL的LIVE/DEAD BacLight试剂(染色核酸的SYTO 9与碘化丙啶(PI)的混合物)，进一步在室温孵育15分钟。具有绿色荧光的SYTO 9会标记所有的细菌，但具有红色荧光的PI仅会渗透到具有损伤的细胞质膜的细菌里，如果存在两种色素，则SYTO 9的荧光会减弱。激发波长/发光波长在SYTO 9中以488/495～515nm进行观察，在PI中以488/635～700nm进行观察(图7A和B)。

对照中，几乎所有的细菌为无伤(绿色荧光)，少数的细菌具有损伤的膜(红色荧光)。在用溶菌酶-壳聚糖复合物处理的各试样中，与相对应的对照相比，具有损伤的膜的细菌细胞更多(红色荧光占多数的状态)。用溶菌酶-壳聚糖复合物处理的铜绿假单胞菌中，无伤的细菌细胞和具有损伤的膜的细菌细胞会凝集，形成簇。形成对照的是，在用溶菌酶-壳聚糖复合物处理的不动杆菌中，与铜绿假单胞菌相比较，细菌细胞的凝集较少。CLSM的观察结果与到此为止的膜损伤测试的结果一致。

实验例9(扫描电子显微镜观察)

通过扫描电子显微镜(SEM)来观察铜绿假单胞菌和不动杆菌的由溶菌酶-壳聚糖复合物引起的形态变化(以2万倍的倍率进行照片拍摄，图8中比例尺＝1.5μm)。

具体来说，将生理盐水(0.9％NaCl溶液)用作溶剂，准备上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液(1000μg/mL)、溶菌酶单体的溶液(500μg/mL)、壳聚糖单体的溶液(500μg/mL)、以及溶菌酶和壳聚糖的混合物的溶液(溶菌酶单体的溶液[500μg/mL]和壳聚糖单体的溶液[500μg/mL])。作为对照，使用生理盐水(0.9％NaCl溶液)。将除了使吸光度为2.0以外与上述实验例1同样制备的铜绿假单胞菌细菌悬浮液和不动杆菌细菌悬浮液的上清液全部除去，在所得的物质中加入上述溶菌酶-壳聚糖复合物等的各溶液1mL，在37℃孵育2小时。之后，进行离心分离，用生理盐水(0.9％NaCl)清洗得到的颗粒，用固定液(0.1M磷酸缓冲液中2.5％缓冲戊二醛)于4℃固定2小时。之后，在0.1M磷酸缓冲液中孵育一晩。

之后，将各细菌在0.1M磷酸缓冲液中的1.0％缓冲化四氧化锇中固定1小时，接下来用乙醇脱水，之后使用临界点干燥装置(HCP-2)进行干燥。在涂布约20nm的铂/钯后，用扫描型电子显微镜(S-4500)观察试样(图8A和B)。

未处理的铜绿假单胞菌(NBRC 13275)(图8A)和鲍氏不动杆菌(图8B)的SEM的观察结果显示出光滑的表面(图8A的(a)和图8B的(f))。在用溶菌酶单体处理后，铜绿假单胞菌和不动杆菌部分地形成球状细胞即原生质球(图8A的(c)和图8B的(h))。在铜绿假单胞菌和不动杆菌的两者中，与用壳聚糖单体和混合物处理过的样品((图8A的(d)和(e)、图8B的(i)和(j))相比较，用溶菌酶-壳聚糖复合物处理的样品(图8A的(b)和图8B的(g))能观察到大量的囊泡。用溶菌酶-壳聚糖复合物和混合物处理过的铜绿假单胞菌和不动杆菌失去了它们的表面结构的完整性，部分地成为了球形(图8A的(b)和(e)、图8B的(g)和(j))。在用各溶液处理过后，特别是用溶菌酶-壳聚糖复合物处理后，在细胞的周围出现细胞外丝状结构(图8A的(b)～(e)、图8B的(g)～(j))。

实验例10(透射电子显微镜观察)

通过透射电子显微镜(TEM)来观察铜绿假单胞菌和不动杆菌的由溶菌酶-壳聚糖复合物引起的形态变化(以50000倍的倍率进行照片拍摄，图9中比例尺＝0.2μm)。

具体来说，将生理盐水(0.9％NaCl溶液)用作溶剂，准备上述溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液(1000μg/mL)、溶菌酶单体的溶液(500μg/mL)、壳聚糖单体的溶液(500μg/mL)、以及溶菌酶和壳聚糖的混合物的溶液(溶菌酶单体的溶液[500μg/mL]和壳聚糖单体的溶液[500μg/mL])。作为对照，使用生理盐水(0.9％NaCl溶液)。

在这些溶液1mL中，准备将与上述实验例1同样制备的铜绿假单胞菌细菌悬浮液和不动杆菌细菌悬浮液用生理盐水(0.9％NaCl)稀释、以最终悬浮液浓度成为在600nm下吸光度4.0的方式进行制备、并除去全部上清液的物质，在其中加入上述溶菌酶-壳聚糖复合物等的各溶液1mL，在37℃孵育2小时。之后进行离心分离，用生理盐水(0.9％NaCl)清洗得到的颗粒，在0.1M磷酸缓冲液中1.0％缓冲化四氧化锇缓冲液中固定1小时，包埋在2.0％琼脂中，用乙醇进行脱水，接下来包埋在Epon 812(TAAB Laboratories Equipment Ltd.)中。在铜网上收集70nm的超薄切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行二重染色，使用透射型电子显微镜(H-7100)在75kV进行观察。

在未处理的铜绿假单胞菌和不动杆菌的TEM观察结果中，显示出细菌的正常的表面结构，可以看到光滑且为层状(图9A的(a)、图9B的(f))。如果用溶菌酶单体处理，则铜绿假单胞菌和不动杆菌两者会形成原生质球(图9A的(c)、图9B的(h))，如果用壳聚糖单体处理，则这些细菌会在它们的表面形成大量的囊泡(图9A的(d)、图9B的(i))。囊泡从外膜生成，它们与各细菌的以SEM观察的囊泡一致。在用溶菌酶-壳聚糖复合物或混合物处理后，在铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌的TEM观察结果中，显示出具有外膜囊泡的球状细胞，明确了由溶菌酶单体和壳聚糖单体的处理这两者产生的形态学的变化(图9A的(b)和(e)、图9B的(g)和(j))。进而，细菌的细胞壁被破坏，细胞内的内容物从细胞释放。

实验例11(耐药性获得试验)

为了评价耐药性的获得，将铜绿假单胞菌(NBRC 13275和PAO 1)和鲍氏不动杆菌在包含溶菌酶-壳聚糖复合物的LB培养基中重复传代培养，评价对于溶菌酶-壳聚糖复合物的敏感性的变化。

具体来说，对于溶菌酶-壳聚糖复合物的MIC(最小发育阻止浓度：用于阻止细菌的增殖所必需的药剂的最小量)，将生理盐水(NaCl 0.9％)用作溶剂、以600nm下的吸光度为1.0的方式调节铜绿假单胞菌(NBRC 13275和PAO 1)或鲍氏不动杆菌，将调节的细菌混浊液60μL加入到96孔微孔板内的LB培养基140μL中，最终制备为1孔内的细菌浓度为10⁴，在35℃进行孵育。在18小时、24小时后进行评价，将目视无法看到混浊的试剂的最小浓度定义为MIC。以该MIC的一半即1/2MIC的溶菌酶-壳聚糖复合物浓度，将细菌重复传代培养(10次)，对各自的MIC进行评价(图10A和B中的LYZOX、传代)。作为比较，使用上述溶菌酶和壳聚糖的混合物(图10A和B中的对照)，进行与对溶菌酶-壳聚糖复合物的试验同样的试验(图10A和B中的对照、传代)。将没有传代培养的各细菌作为对照进行评价(图10A和B中的CTL)。重复10次MIC的测定，评价这些细菌中的耐药性的表达。

将得到的耐药性试验示于图10。在10次传代培养后，铜绿假单胞菌和不动杆菌没有获得对于溶菌酶-壳聚糖复合物和其混合物的耐药性。

实验例12(溶血毒性试验)

为了确认溶菌酶-壳聚糖复合物的安全性，进行溶血毒性试验。

具体来说，使用磷酸缓冲液(PBS)作为溶剂，稀释400μL的兔的脱纤维血液(从Cosmo Bio Co.，Ltd.得到)，制作20μ妙mL、200μg/mL、2000μg/mL和20000μg/mL(如表1所示，溶血毒性评价试验时的浓度分别为10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL和10000μg/mL(表1))的溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液。进一步制备用上述PBS稀释的上述兔的脱纤维血液500μL，加入500μL的各溶菌酶-壳聚糖复合物(LYZOX(注册商标))溶液、PBS(阴性对照)、和0.1％的Triton-X 100溶液(阳性对照)。将得到的各混合液在37℃孵育1小时，以1500rpm离心分离10分钟，采取上清液。将各上清液750μL添加到750μL的上述PBS中，将750μL的对照(阴性对照或阳性对照)添加到750μL的各对应浓度的溶菌酶-壳聚糖复合物中。为了通过使用下述式来计算溶血率，在545nm测定各吸光度(OD)。该545nm下的吸光值作为3次测定的平均值和SEM(样本平均值的标准差)而表示。

溶血率(HR)(％)＝(试样的吸光度[AS]-对应的浓度的阴性对照吸光度[AN])/(与溶菌酶-壳聚糖复合物浓度对应的阳性对照吸光度[AP]-[AN])×100。

表1

表1溶血毒性试验

如表1所示那样，溶菌酶-壳聚糖复合物在37℃、1小时的孵育后，兔红血球几乎不溶血。溶菌酶-壳聚糖复合物的溶血率在10μg/mL至10000μ妙mL的范围的浓度中为小于5％。应予说明，报告称5％以下的溶血率在临床用的活体材料中是被允许的，是安全的[DcngJD，He B，He DH，Chen ZF.A potential biopreservative：Chemical composition，antibacterial and hemolytic activities of leaves essential oil from Alpiniaguinanensis.Ind Crop Prod.2016；94:281-7.]。

产业上的可利用性

根据本发明，可以对不动杆菌提供新的抗菌性组合物和医药组合物等。