具体实施方式

本文部分描述了包含氨基酸实体的组合物(例如，活性部分)和通过施用有效量的组合物来减少纤维化的方法。可施用所述组合物以治疗或预防有需要的对象的纤维化病状或病症。已仔细选择氨基酸实体和组合物中的氨基酸实体的相对量，例如，以减少需要许多生物、细胞和分子过程的协调的对象(例如，患有纤维化病状或病症的对象)的纤维化。该组合物允许对组织生理学的多路径有益作用，以优化纤维化反应中涉及的信号路径的调节，并减少纤维化中细胞外基质的沉积(和改善吸收)。特别地，所述组合物已经被特别地定制以降低纤维发生基因/蛋白质表达、降低与纤维化相关的发炎，和抑制与纤维化相关的路径。

在以下详细描述的实施例中，本发明的组合物改善了纤维化并降低了纤维发生基因和蛋白质表达。

定义

除非另有说明，权利要求书和说明书中使用的术语如以下所定义。

必须注意，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”，“一个”和“该(或所述)”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。

如本文所用，术语“氨基酸实体”是指呈游离形式或盐形式(或两者)的左旋(L)-氨基酸，肽中的L-氨基酸残基小于20个氨基酸残基(例如，寡肽，例如二肽或三肽)、氨基酸的衍生物、氨基酸的前驱体或氨基酸的代谢物(参见例如表1)。氨基酸实体包括能够影响游离L-氨基酸的生物学功能的氨基酸衍生物、氨基酸前驱体、氨基酸代谢物或氨基酸的盐形式。氨基酸实体不包括完整或修饰形式(例如水解形式)的大于20个氨基酸残基的天然多肽或蛋白质。

氨基酸盐包括任何可摄入的盐。对于药物组合物，组合物中存在的氨基酸的盐形式(例如，活性部分)应为药学上可接受的盐。在一个具体的例子中，盐形式是氨基酸的盐酸盐(HCl)盐形式。

在一些实施例中，氨基酸实体的衍生物包含氨基酸酯(例如，烷基酯，例如氨基酸实体的乙酯或甲酯)或酮酸。

表1.氨基酸实体包括本文所述组合物的氨基酸、前驱体、代谢物和衍生物。

给定测量的性质或精确度，“大约”和“近似”通常是指所测定数量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值或值范围的15个百分点(％)以内，通常在10％以内，更通常在5％之内。

“氨基酸”是指具有氨基(-NH₂)，羧酸基(-C(＝O)OH)和通过中心碳原子键合的侧链的有机化合物，包括必需的和非必需的氨基酸以及天然、非蛋白质和非天然氨基酸。

如本文所用，术语“活性部分”是指总体上具有如本文所述的生理作用，例如抗纤维化作用的能力的四个或更多个氨基酸实体的组合。例如，活性部分可以在患有疾病或病症的对象中重新平衡代谢功能障碍。本发明的活性部分可以包含其他生物活性成分。在一些实例中，活性部分包括四个或更多个氨基酸实体的确定的组合，如下文详述。在其他实施例中，活性部分由氨基酸实体的确定的组合组成，如下文所详述。

各个氨基酸实体以各种量或比例存在于组合物(例如活性部分)中，其可以表示为重量(例如，以克计)、氨基酸实体彼此之间的重量比、摩尔量、组合物的重量百分比、组合物的摩尔百分比、热量含量、对组合物的热量贡献百分比等。通常，本发明将提供剂型形式的氨基酸实体的克数、氨基酸实体相对于组合物重量(即，组合物中存在的所有氨基酸实体和任何其他生物活性成分的重量)的重量百分比、或比例。在一些实施例中，组合物，例如活性部分作为药学上可接受的制剂(例如药物产品)提供。

如本文所用，术语“有效量”是指本发明的活性物质在本发明的组合物中，特别是本发明的药物组合物中的量，其足以减轻症状和/或改善待治疗的病状(例如，提供所需的临床反应)。用于组合物中的活性物质的有效量将根据所治疗的特定病状、病状的严重度、治疗持续时间、并用疗法(concurrent therapy)的性质、所采用的特定活性物质、特定的药学上可接受的赋形剂和/或使用的载剂，以及主治医师知的识和专长的类似因素而变化。

本文所述的“药物组合物”包含至少一种“活性部分”和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，药物组合物用作治疗剂。不需要满足药物标准的其他组合物(GMP；药物级组分)可以用作营养保健品，医疗食品或补充剂，它们被称为“消费者健康组合物”。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合与人和动物的组织接触使用的氨基酸、材料、赋形剂、组合物和/或剂型，没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，且具有合理的获益/风险比。在一个具体的实施例中，“药学上可接受的”是指不含可检测的内毒素或内毒素水平低于药物产品中可接受的水平。

在一个具体的实施例中，“药学上可接受的”是指由制药业或监管制药业的机构或实体(例如，政府或贸易机构或实体)使用的标准，以确保一个或多个产品质量参数在药物、药物组合物、治疗或其他治疗剂的可接受范围内。产品质量参数可以是制药业或机构或实体(例如政府或贸易机构或实体)规定的任何参数，包括但不限于组合物；组合物均匀性；剂量；剂量均匀性；污染物或杂质的存在、不存在和/或含量；以及无菌等级(例如，微生物的存在、不存在和/或含量)。政府监管机构的示例包括：联邦药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)、瑞士医药管理局、中国食品药品监督管理局(CFDA)或日本药品医疗器械管理局(PMDA)。

术语“药学上可接受的赋形剂”是指药物配方中除活性剂以外的在生理上相容的成分。药学上可接受的赋形剂可包括但不限于缓冲剂、甜味剂、分散增强剂、调味剂、苦味遮蔽剂、天然色素、人工色素、稳定剂、溶剂或防腐剂。在一个具体的实施例中，药学上可接受的赋形剂包括柠檬酸或卵磷脂中的一种或两种。

如本文所用，术语“非氨基酸实体蛋白质组分”是指肽(例如，多肽或寡肽)，其片段或降解肽。示例性的非氨基酸实体蛋白质组分包括但不限于乳清蛋白、卵白蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、大麻蛋白、豌豆蛋白、糙米蛋白、或其片段或降解肽中的一种或多种。

如本文所用，术语“非蛋白质组分”是指除蛋白质组分以外的组合物的任何组分。示例性非蛋白质组分可包括但不限于糖类(例如单糖(例如右旋糖、葡萄糖或果糖)、二糖、寡糖或多糖)。脂质(例如，含硫脂质(例如，α-硫辛酸)，长链甘油三酸酯，ω3脂肪酸(例如EPA、DHA、STA、DPA或ALA)，ω6脂肪酸(GLA、DGLA或LA)，中链甘油三酸酯或中链脂肪酸)；维生素(例如维生素A、维生素E、维生素C、维生素D、维生素B6、维生素B12、生物素或泛酸)；矿物质(锌、硒、铁、铜、叶酸盐、磷、钾、锰、铬、钙或镁)；或固醇(例如胆固醇)。

如果组合物、配方或产品提供所需的临床效果，则为“治疗性(therapeutic)”。期望的临床效果可以通过减轻疾病的进展和/或缓解疾病的一种或多种症状来显示。

“单位剂量(unit dose或unit dosage)”包括进行市场销售以供使用的形式的一种或多种药物产品，它们具有活性和非活性组分(赋形剂)的特定混合物，具有特定的组态(例如胶囊壳)，并分配为特定剂量(例如多个棒状包)。

如本文所用，纤维化(例如纤维化病状或病症)的术语“治疗(treat,treating ortreatment)”是指改善纤维化(例如减缓、阻止或减少纤维化或其至少一种临床症状的发展)；缓解或改善至少一种物理参数，包括患者可能无法辨别的那些参数；和/或预防或延迟纤维化的发生、发展或进展。

包含氨基酸实体(例如，活性部分)的组合物

本文所述的本发明组合物(例如活性部分)包含氨基酸实体，例如表1所示的氨基酸实体。

在一些实施例中，亮氨酸氨基酸实体选自L-亮氨酸、β-羟基-β-甲基丁酸(HMB)、氧代-亮氨酸(α-酮异己酸(KIC))、异戊酰基-CoA、N-乙酰基-亮氨酸或它们的组合。

在一些实施例中，精氨酸氨基酸实体选自L-精氨酸、肌酸、精氨基丁二酸(argininosuccinate)、天冬氨酸、谷氨酸、胍丁胺、N-乙酰基-精氨酸或其组合。

在一些实施例中，谷氨酰胺氨基酸实体选自L-谷氨酰胺、谷氨酸盐、氨甲酰基-P、谷氨酸盐、N-乙酰谷氨酰胺或其组合。

在一些实施例中，NAC-氨基酸实体选自NAC、乙酰基丝氨酸(acetylserine)、胱硫醚、胱硫醚、高半胱氨酸(homocysterine)、谷胱甘肽或其组合。

在一些实施例中，异亮氨酸氨基酸实体选自L-异亮氨酸、2-氧代-3-甲基-戊酸(α-酮-β-甲基戊酸(KMV))、甲基丁酰基-CoA、N-乙酰基-异亮氨酸或它们的组合。

在一些实施例中，缬氨酸氨基酸实体选自L-缬氨酸、2-氧代-戊酸(α-酮异戊酸(KIV))、异丁酰基-CoA、N-乙酰基-缬氨酸或其组合。

在某些实施例中，丝氨酸氨基酸实体选自L-丝氨酸、磷酸丝氨酸、P-羟基丙酮酸、甘氨酸、乙酰基丝氨酸、胱硫醚、磷脂酰丝氨酸或其组合。在一些实施例中，丝氨酸氨基酸实体选自L-丝氨酸或L-甘氨酸。在一个实施例中，丝氨酸氨基酸实体是L-丝氨酸。在另一个实施例中，丝氨酸氨基酸实体是L-甘氨酸。在另一个实施例中，丝氨酸氨基酸实体是L-甘氨酸和L-丝氨酸(例如，重量比为1:1的L-甘氨酸和L-丝氨酸)。

本文所述的组合物还可包含L-丝氨酸、L-甘氨酸、肌酸或谷胱甘肽中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)或更多种。

在一些实施例中，所述组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)、NAC实体和L-丝氨酸。

在一些实施例中，所述组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)、NAC实体和L-甘氨酸。

在一些实施例中，所述组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)、NAC实体、L-甘氨酸和L-丝氨酸。

在一些实施例中，组合物包含亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体(例如，L-谷氨酰胺或其盐)和NAC实体。在一些实施例中，(a)-(f)中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个(例如，全部)在组合物中呈游离氨基酸形式，例如至少：氨基酸实体组分或总组分的总重量的42重量％、75重量％、90重量％或更多是所述组合物中的游离氨基酸形式(例如，呈干燥形式)的(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)。

在一些实施例中，(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)在组合物中呈盐形式，例如至少：氨基酸实体组分或总组分的总重量的0.01重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、5重量％或10重量％或更多是所述组合物中呈盐形式的(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)。

在一些实施例中，(a)-(f)中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如全部)作为二肽或三肽的一部分提供，例如以至少以下的量提供：所述组合物的氨基酸实体组分或总组分的0.01重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、5重量％或10重量％或更多。

在一些实施例中，所述组合物包含以下物质，基本上由以下物质组成，或由以下物质组成：

a)亮氨酸氨基酸实体，

b)精氨酸氨基酸实体，

c)谷氨酰胺氨基酸实体；以及

d)N-乙酰半胱氨酸(NAC)实体。

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包含以下物质、基本上由以下物质组成或由以下物质组成：

a)亮氨酸氨基酸实体，其选自：i)L-亮氨酸或其盐，ii)包含L-亮氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐，或iii)β-羟基-β-甲基丁酸(HMB)或其盐；

b)精氨酸氨基酸实体，其选自：i)L-精氨酸或其盐，ii)包含L-精氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐，iii)肌酸或其盐，或v)包含肌酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；

c)所述谷氨酰胺氨基酸实体为L-谷氨酰胺或其盐、或包括L-谷氨酰胺的二肽或其盐、或三肽或其盐；以及

d)所述NAC实体是NAC或其盐或者包含NAC的二肽或其盐。

在一些实施例中，所述组合物(例如，活性部分)还包含以下一种或两种，基本上由以下一种或两种组成，或由以下一种或两种组成：e)L-异亮氨酸或其盐，或包含L-异亮氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐；或f)L-缬氨酸或其盐，或包含L-缬氨酸的二肽或其盐、或三肽或其盐。

在一些实施例中，所述组合物(例如，活性部分)包含以下物质、基本上由以下物质组成或由以下物质组成：a)L-亮氨酸或其盐；b)L-精氨酸或其盐；c)L-谷氨酰胺或其盐；和d)NAC或其盐。

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)能够减少或预防纤维化。例如，减少或抑制纤维化中的一种或两种包括降低胶原蛋白，例如I型和III型胶原蛋白或α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)中的一种或两种的水平。

在某些实施例中，所述组合物(例如，活性部分)能够使纤维化减少或降低至少5％、10％或15％，如使用羟脯氨酸测定，例如基于抗体的检测测定(antibody-baseddetection assay)，例如ELISA，例如，如实施例1中所述，例如，相对于参考组合物(例如，载体对照)所检测的。

在某些实施例中，组合物(例如，活性部分)能够使肝纤维化或肝损伤减少或降低至少20％、50％或65％，如使用LX-2细胞所检测的，例如，如使用核酸扩增方法，例如PCR或qRT-PCR所评估的，例如，如在实施例3中所描述的，例如，相对于参考组合物(例如，载体对照、单氨基酸实体或氨基酸实体的组合)，LX-2细胞中的Col1a1和/或TIMP2的水平。

在一些实施例中，组合物(例如活性部分)能够减少或降低一种或多种肝细胞类型(例如肝细胞、星状细胞(stellate cells)或巨噬细胞中的一种、两种或三种，例如在肝细胞、星状细胞和巨噬细胞的三培养物中)的纤维化，例如，通过纤维化标记物水平的变化(例如降低)所检测的，所述纤维化标记物例如原胶原Iα1、MCP-1、YKL40或GROα(CXCL1)的一种、两种、三种或更多种(例如，全部)的变化例如至少20％、30％、40％或50％，例如，如使用基于抗体的检测测定(例如ELISA)所评估的，例如，如实施例9中所述，例如，相对于参照组合物(例如较低浓度的组合物、载体对照、单氨基酸实体或氨基酸实体的组合)。在某些实施例中，所述组合物导致以下各项中的一项、两项、三项或更多项(例如，全部)的降低：

(i)原胶原Iα1的水平(例如，原胶原Iα1水平降低至少20％、30％、40％或50％)；

(ii)MCP-1水平(例如MCP-1水平降低至少50％、60％、70％、80％或90％)；

(iii)YKL40水平(例如，YKL40水平降低至少70％、80％、90％或95％)；或

(iv)GROα(CXCL1)的水平(例如，GROα(CXCL1)水平降低至少15％、20％、25％或30％)。

在一些实施例中，通过在实施例9中所述的条件下使培养物中的一种或多种肝细胞类型(例如，肝细胞、星状细胞或巨噬细胞中的一种、两种或三种)，例如由膜(例如，渗透膜，例如，Transwell)分离的肝细胞类型(例如，由膜与星状细胞或巨噬细胞中的一种或两种分离的肝细胞)与所述组合物接触来评估所述组合物(例如，所述活性部分)的活性。

在某些实施例中，组合物(例如，活性部分)能够降低或减少肝纤维化或肝损伤，如通过星状细胞的增殖所检测的，例如，星状细胞中DNA合成的水平，例如，降低或减少至少50％、60％、70％或80％，例如，如使用核染色所评估的，例如EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)，例如，如实施例10中所述，例如，相对于参照组合物(例如，载体对照(PBS)、单个氨基酸实体或氨基酸实体的组合)。

i.量

组合物(例如，活性部分)可包括0.5g+/-20％至10g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体，1g+/-20％至15g+/-20％的精氨酸氨基酸实体，0.5g+/-20％至20g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体，和0.1g+/-20％至5g+/-20％的NAC实体。

示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、1.5g或1.81g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体(例如，如表2所示的g/封包(packet))。

表2.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、1.5g或1.81g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体。

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、1.5g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、1.5g或1.81g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g NAC实体。

示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体(例如，如表3所示的g/封包)。

表3.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.15g NAC实体。

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.5+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、2g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g+/-5％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.5g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、2g谷氨酰胺氨基酸实体和0.3g NAC实体。

示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.25g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、1g谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g NAC实体(例如，如表4所示的g/封包)。

表4.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)包括1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-20％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-15％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-10％的NAC实体。在一些实施例中，组合物包括1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体和0.225g+/-5％的NAC实体。示例性组合物可包括1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.25g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、1g谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g NAC实体和1.5g丝氨酸氨基酸实体(例如，如表5所示的g/封包)。

表5.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物

在一些实施例中，组合物包含1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-20％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-20％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-15％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-15％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-10％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-10％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-5％的NAC-氨基酸实体和1.5g+/-5％的丝氨酸氨基酸实体。

示例性组合物可包含1g亮氨酸氨基酸实体、0.5g异亮氨酸氨基酸实体、0.25g缬氨酸氨基酸实体、0.75g或0.905g精氨酸氨基酸实体、1g谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g NAC实体和1.667g丝氨酸氨基酸实体(例如，如表6所示的g/封包)。

表6.包括L-精氨酸(R)或L-精氨酸盐酸盐(R HCl)形式的示例性组合物

在一些实施例中，组合物包含1g+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-20％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-20％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-20％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-20％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-20％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-20％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-15％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-15％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-15％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-10％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-10％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-10％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-10％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-10％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-10％的丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1g+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、0.5g+/-5％的异亮氨酸氨基酸实体、0.25g+/-5％的缬氨酸氨基酸实体、0.75g+/-5％的精氨酸氨基酸实体、1g+/-5％的谷氨酰胺氨基酸实体、0.225g+/-5％的NAC-氨基酸实体和1.667g+/-5％的丝氨酸氨基酸实体。

ii.比例

示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.5+/-15％：2+/-15％：0.15+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.81+/-15％：2+/-15％：0.15±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.5+/-10％：2+/-10％：0.15+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.81+/-10％：2+/-10％：0.15±10％。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.5+/-5％：2+/-5％：0.15+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.81+/-5％：2+/-5％：0.15±5％。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：1.5：2：0.15或1：0.5：0.5：1.81：2：0.15的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。

示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：1.5+/-20％：2+/-20％：0.3+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：1.81+/-20％：2+/-20％：0.3±20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.5+/-15％：2+/-15％：0.3+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：1.81+/-15％：2+/-15％：0.3±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.5+/-10％：2+/-10％：0.3+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：1.81+/-10％：2+/-10％：0.3±10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.5+/-5％：2+/-5％：0.3+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：1.81+/-5％：2+/-5％：0.3±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：1.5：2：0.3或1：0.5：0.5：1.81：2：0.3的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。

示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.75+/-20％：2+/-20％：0.15+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.905+/-20％：2+/-20％：0.15±20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.75+/-15％：2+/-15％：0.15+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.905+/-15％：2+/-15％：0.15±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.75+/-10％：2+/-10％：0.15+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.905+/-10％：2+/-10％：0.15±10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.75+/-5％：2+/-5％：0.15+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.905+/-5％：2+/-5％：0.15±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：0.75：2：0.15或1：0.5：0.5：0.905：2：0.15的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。

示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.75+/-20％：2+/-20％：0.3+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.5+/-20％：0.905+/-20％：2+/-20％：0.3±20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.75+/-15％：2+/-15％：0.3+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.5+/-15％：0.905+/-15％：2+/-15％：0.3±15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.75+/-10％：2+/-10％：0.3+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.5+/-10％：0.905+/-10％：2+/-10％：0.3±10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.75+/-5％：2+/-5％：0.3+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.5+/-5％：0.905+/-5％：2+/-5％：0.3±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.5：0.75：2：0.3或1：0.5：0.5：0.905：2：0.3的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。

示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.75+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.905+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.75+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.905+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.75+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.905+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.75+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.905+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.25：0.75：1：0.225或1：0.5：0.25：0.905：1：0.225的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC-氨基酸实体。

包含氨基酸实体的示例性组合物可以包括重量比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.75+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.5+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.905+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.5+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.75+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.5+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.905+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.5+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.75+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.5+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.905+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.5+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.75+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.5+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.905+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.5+/-5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.25：0.75：1：0.225：1.5或1：0.5：0.25：0.905：1：0.225：1.5的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。

示例性组合物可以包括重量(wt.)比为1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.75+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.667+/-20％或1+/-20％：0.5+/-20％：0.25+/-20％：0.905+/-20％：1+/-20％：0.225+/-20％：1.667+/-20％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.75+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.667+/-15％或1+/-15％：0.5+/-15％：0.25+/-15％：0.905+/-15％：1+/-15％：0.225+/-15％：1.667+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包括重量比为1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.75+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.667+/-10％或1+/-10％：0.5+/-10％：0.25+/-10％：0.905+/-10％：1+/-10％：0.225+/-10％：1.667+/-10％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.75+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.667+/-5％或1+/-5％：0.5+/-5％：0.25+/-5％：0.905+/-5％：1+/-5％：0.225+/-5％：1.667±5％的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括重量比为1：0.5：0.25：0.75：1：0.225：1.667或1：0.5：0.25：0.905：1：0.225：1.667的亮氨酸氨基酸实体、异亮氨酸氨基酸实体、缬氨酸氨基酸实体、精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体、NAC-氨基酸实体和丝氨酸氨基酸实体。

在一些实施例中，所述组合物包含10重量％+/-15％至30重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、15重量％+/-15％至40重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体、20重量％+/-15％至50重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和1重量％+/-15％至8重量％+/-15％的NAC实体。

在一些实施例中，组合物包含10重量％+/-15％至30重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包含5重量％+/-15％至15重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含15重量％+/-15％至40重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含20重量％+/-15％至50重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1％重量+/-15％至8％重量+/-15％的NAC实体。

在一些实施例中，所述组合物包含16重量％+/-15％至18重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、28重量％+/-15％至32重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体、31重量％+/-15％至34重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和1重量％+/-15％至5重量％+/-15％的NAC实体。

在一些实施例中，组合物包含16重量％+/-15％至18重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包括7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，所述组合物包含7重量％+/-15％至9重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含28重量％+/-15％至32重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含31重量％+/-15％至34重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体。在一些实施例中，组合物包含1重量％+/-15％至5重量％+/-15％的NAC实体。

在一些实施例中，组合物包括16.8重量％+/-15％的亮氨酸氨基酸实体、8.4重量％+/-15％的异亮氨酸氨基酸实体、8.4重量％+/-15％的缬氨酸氨基酸实体、30.4重量％+/-15％的精氨酸氨基酸实体、33.6重量％+/-15％的谷氨酰胺氨基酸实体和2.5重量％+/-15％的NAC实体。

iii.氨基酸实体的关系

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)具有一种或多种以下性质：

a)所述组合物中的Q-氨基酸实体的重量％大于所述R-氨基酸实体的重量％；

b)所述组合物中的Q-氨基酸实体的重量％大于L-氨基酸实体的重量％；

c)所述组合物中的所述R-氨基酸实体的重量％大于所述L-氨基酸实体的重量％；或

d)(a)-(c)中的两种或三种的组合。

在一些实施例中，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％大于精氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比精氨酸氨基酸实体的重量％大至少5％，例如，谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比精氨酸氨基酸实体的重量％大至少10％或25％。

在一些实施例中，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％大于亮氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少20％，例如，组合物中谷氨酰胺氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少25％或50％。

在一些实施例中，组合物中精氨酸氨基酸实体的重量％大于亮氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中精氨酸氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少10％，例如，组合物中精氨酸氨基酸实体的重量％比亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少15％或30％。

在一些实施例中，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％大于组合物中异亮氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％比组合物中异亮氨酸氨基酸实体的重量％大至少25重量％。

在一些实施例中，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％大于组合物中缬氨酸氨基酸实体的重量％，例如，组合物中亮氨酸氨基酸实体的重量％比组合物中缬氨酸氨基酸实体的重量％大至少25重量％。

在一些实施例中，精氨酸氨基酸实体、谷氨酰胺氨基酸实体和NAC实体的重量％为所述组合物中氨基酸实体的至少50重量％或70重量％，但不超过所述组合物中氨基酸实体的90重量％。

在一些实施例中，NAC实体的重量％为所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的至少1重量％或2重量％，但不超过所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的10重量％或更多。

在一些实施例中，异亮氨酸氨基酸实体和缬氨酸氨基酸实体的组合为所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的至少15重量％或20重量％，但不超过所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的50重量％；

在一些实施例中，所述谷氨酰胺氨基酸实体和NAC实体为所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的至少40重量％或50重量％，但不超过所述组合物中的所述氨基酸实体组分或全部组分的90重量％。

在一些实施例中，组合物(例如，活性部分)还包含丝氨酸氨基酸实体，例如，丝氨酸氨基酸实体以比组合物中的任何其它氨基酸实体组分更高的量存在。在一些实施例中，丝氨酸氨基酸实体的重量％为组合物中氨基酸实体或全部组分的至少20重量％或更多。

iv.从组合物中排除或限制的氨基酸分子

在一些实施例中，所述组合物不包含长度超过20个氨基酸残基的肽(例如，蛋白质补充剂)，所述肽选自或衍生自卵白蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、大麻蛋白、豌豆蛋白或糙米蛋白中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)，或者如果所述肽存在，则所述肽以小于以下量存在：所述组合物中的非氨基酸实体蛋白质组分或全部组分的总重量(例如，呈干燥形式)的10重量(wt)％、5重量％、1重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％。

在一些实施例中，组合物包含3至19、3至15或3至10种不同氨基酸实体的组合；例如，所述组合包含：所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的总重量％(例如，呈干燥形式)的至少42重量％、75重量％、或90重量％。

在一些实施例中，二肽或其盐或三肽或其盐以小于以下存在：所述组合物中的氨基酸实体组分或全部组分的总重量(例如，呈干燥形式)的10重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，组合物中氨基酸实体组分(例如，呈干燥形式)的总克数的至少50％、60％、70％或更多来自(a)-(j)中的一种、两种、三种、四种、五种、七种、八种、九种或更多种(例如，全部)。

在一些实施例中，来自组合物中氨基酸实体组分或全部组分(例如，呈干燥形式)的至少50％、60％、70％或更多的热量来自(a)-(j)中的一种、两种、三种、四种、五种、七种、八种、九种或更多种(例如，全部)。

在一些实施例中，组合物中不存在碳水化合物(例如，右旋糖、麦芽右旋糖、蔗糖、糊精、果糖、半乳糖、葡萄糖、糖原、高果糖玉米糖浆、蜂蜜、肌醇、转化糖、乳糖、左旋糖、麦芽糖、糖蜜、甘蔗或木糖中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，组合物中不存在维生素(例如，维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B12、维生素C或维生素D中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，硝酸盐或亚硝酸盐中的一种或两种不存在于组合物中，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，4-羟基异亮氨酸不存在于组合物中，或如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，益生菌(例如，芽孢杆菌益生菌)不存在于组合物中，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，组合物中不存在乙酸苯酯(phenylacetate)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，组合物中不存在明胶(例如明胶胶囊)，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

在一些实施例中，S-烯丙基半胱氨酸、S-烯丙基巯基半胱氨酸或果糖基-精氨酸中的一种、两种或三种不存在于组合物中，或者如果存在，则以小于以下量存在：例如，所述组合物(呈干燥形式)的总重量的10重量％、5重量％、1重量％、0.5重量％、0.1重量％、0.05重量％、0.01重量％、0.001重量％或更少。

用途，例如治疗方法

如本文所述的本发明的组合物(例如，活性部分)可以被施用以改善或减少纤维化，例如，治疗或预防对象的纤维化病状或病症。该方法包括以足以减少或抑制对象的纤维化的量向有需要的对象施用本文所述的组合物。可施用所述组合物以改善组织修复，例如在患有纤维化病状或病症的患者中。

在一些实施例中，对象患有纤维化或已经被诊断患有纤维化病状或病症。在一些实施例中，患有纤维化病状或病症的对象是人。在一些实施例中，对象未接受过使用组合物的预先治疗(例如，初次治疗的对象( subject))。

本公开内容的特征在于用于改善或减少纤维化的方法，所述方法包括向有需要的对象施用有效量的本文公开的组合物(例如，活性部分)。组合物可以根据本文所述的剂量方案施用以治疗患有纤维化病状或病症的对象。

在一些实施例中，本文所述的组合物(例如，活性部分)用作治疗(例如，逆转、减少、改善或预防)对象(例如，患有纤维化病状或病症的对象)中的纤维化的药物的用途。在一些实施例中，本文所述的组合物(例如，活性部分)用于制造用于治疗(例如，逆转、减少、改善或预防)对象(例如，患有纤维化病状或病症的对象)中的纤维化的药物的用途。

在某些实施例中，减少或治疗纤维化包括减少以下一种、两种、三种、四种、五种或更多种(例如，全部)：组织纤维化的形成或沉积；纤维化损伤的大小、细胞性(例如，成纤维细胞或免疫细胞数目)、组成或细胞含量；纤维化损伤的胶原蛋白或羟脯氨酸含量；纤维发生蛋白的表达或活性；与炎性反应相关的纤维化；或与纤维化相关的体重减轻。在一些实施例中，减少纤维化增加对象的存活。

示例性纤维化疾病包括但不限于多系统性(例如，系统性硬化症、多灶性纤维硬化、骨髓移植接受者中的硬皮病样移植物抗宿主病、肾源性系统性纤维化或硬皮病)和器官特异性病症(例如，肺、心脏、肾、胰腺、皮肤、脑和其它器官的纤维化)。在某些实施例中，所述纤维化病状是肺的纤维化病状、心脏或脉管系统的纤维化病状、肾的纤维化病状、皮肤的纤维化病状、胃肠道的纤维化病状、骨髓或造血组织的纤维化病状、神经系统的纤维化病状、眼睛的纤维化病状或其组合。

在某些实施例中，纤维化病状是原发性纤维化。在一个实施例中，纤维化疾病是特发性的。在其它实施例中，纤维化病状与以下相关(例如，继发于以下)：疾病(例如，传染病、炎性疾病、自体免疫疾病和/或结缔疾病)；毒素；损伤(例如，环境危害(例如，石棉、煤尘、和/或多环芳烃)、吸烟或伤口)；医学治疗(例如，手术切口、化疗或放射)；或其组合。

在某些实施例中，所述纤维化病状是肺的纤维化病状。在某些实施例中，肺的纤维化病状选自以下的一种或多种：肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、常见间质性肺炎(UIP)、间质性肺病、隐源性纤维化肺泡炎(CFA)、支气管扩张和硬皮病肺病。在一个实施例中，肺的纤维化继发于疾病、毒素、损伤、医学治疗或其组合。

例如，肺的纤维化可以与以下一种或多种相关(例如继发于以下一种或多种)：疾病过程，例如石棉肺和矽肺；职业危害；环境污染物；吸烟；自身免疫性结缔组织病(例如类风湿关节炎、硬皮病和系统性红斑狼疮(SLE))；结缔组织病(例如结节病)；或感染性疾病(例如，感染，特别是慢性感染)。在一个实施例中，肺的纤维化病状与自身免疫性结缔组织病(例如硬皮病或狼疮，例如SLE)有关。

在其它实施例中，肺纤维化包括但不限于与慢性阻塞性肺病(COPD)相关的肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、硬皮病、胸膜纤维化、慢性哮喘、急性肺综合征、淀粉样变性、支气管肺发育不良、卡普兰综合征、Dressler综合征、组织细胞增多症X、特发性肺含铁血黄素沉着症、淋巴管肌瘤病、二尖瓣狭窄、多发性肌炎、肺水肿、肺动脉高压(例如特发性肺动脉高压(IPH))、肺尘病、放射疗法(例如辐射诱导的纤维化)、类风湿病、谢弗氏病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、热带肺嗜酸性粒细胞增多、结节性硬化、韦-克二氏病(Weber-Christiandisease)、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、惠普尔氏病(Whipple’sdisease)、或暴露于毒素或刺激物(例如，药物，如胺碘酮、博来霉素、白消安、卡莫司汀、氯霉素、六甲铵、氨甲蝶呤(methotrexate)、二甲麦角新碱、丝裂霉素C、硝基呋喃妥因、青霉胺、培洛霉素或普拉洛尔、或吸入滑石或粉尘，例如煤尘、二氧化硅)。在某些实施例中，肺纤维化与肺的炎性病症例如哮喘或COPD中的一者或两者相关。

在某些实施例中，所述纤维化病状是肾的纤维化病状。在某些实施例中，肾脏的纤维化病状选自以下的一种或多种：肾纤维化(例如慢性肾纤维化)、与损伤或纤维化中的一种或两种相关的肾病(例如与糖尿病相关的慢性肾病(例如糖尿病肾病))、狼疮、肾的硬皮病、肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球硬化、与人慢性肾病(CKD)相关的IgA肾脏病纤维化、慢性进行性肾病(CPN)、肾小管间质纤维化、输尿管梗阻、慢性尿毒症、慢性间质性肾炎、放射性肾病、肾小球硬化、进行性肾小球肾病(PGN)、内皮/血栓性微血管病损伤、HIV相关肾病、或与暴露于毒素、刺激物或化疗剂相关的纤维化。在一个实施例中，肾的纤维化病状是肾的硬皮病。在一些实施例中，肾的纤维化病状是移植肾病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、内皮/血栓性微血管病损伤或HIV相关肾病(HIVVAN)。

在其它实施例中，纤维化病状与麻风病或肺结核相关。

在其它实施例中，本文所述的组合物用于治疗过度增殖性纤维化疾病，例如，非癌性纤维化疾病。在一个实施例中，过度增殖性纤维化疾病是多系统或器官特异性的。示例性过度增殖纤维化疾病包括但不限于多系统疾病(例如，系统性硬化症、多灶性纤维硬化、骨髓移植接受者中的硬皮病样移植物抗宿主病、肾源性系统性纤维化或硬皮病)和器官特异性病症(例如，眼、肺、心脏、肾、胰腺、皮肤和其它器官的纤维化)。

在某些实施例中，纤维化病状是心脏的纤维化病状。在某些实施例中，心脏的纤维化病状是心肌纤维化(例如，与放射性心肌炎、手术程序并发症(例如，心肌手术后纤维化)；感染性疾病(例如，查加斯病、细菌、旋毛虫病或真菌心肌炎)相关的心肌纤维化)；肉芽肿；代谢性贮藏病症(例如心肌病、血色素沉着病)；发育病症(例如，心内膜纤维弹性组织增生)；动脉硬化，或暴露于毒素或刺激物(例如，药物诱导的心肌病、药物诱导的心脏毒性、酒精性心肌病、钴中毒或暴露)。在某些实施例中，心肌纤维化与心脏组织的炎性病症(例如，心肌结节病)相关。在一些实施例中，纤维化病状是与心肌梗死相关的纤维化病状。在一些实施例中，纤维化病状是与充血性心脏衰竭相关的纤维化病状。

在一些实施例中，纤维化病状与选自硬皮病或狼疮的自体免疫疾病相关，例如系统性红斑狼疮。

在一些实施例中，纤维化病状是系统性的。在一些实施例中，纤维化病状是系统性硬化症症(例如，限制性系统性硬化症症、弥漫性系统性硬化症症或系统性硬化症症性硬皮病)、肾源性系统性纤维化、囊性纤维化、慢性移植物抗宿主病或动脉粥样硬化。

在一些实施例中，纤维化病状是硬皮病。在一些实施例中，硬皮病是局限性的，例如，斑状或线状硬皮病。在一些实施例中，所述病状是系统性硬化症症，例如，限制性系统性硬化症症、弥漫性系统性硬化症症或系统性硬化症症样硬皮病。

在其它实施例中，纤维化病状影响选自以下的一种或多种组织：肌腱、软骨、皮肤(例如，皮肤表皮或内皮)、心脏组织、血管组织(例如，动脉、静脉)、胰腺组织、肺组织、肾组织、子宫组织、卵巢组织、神经组织、睾丸组织、腹膜组织、结肠、小肠、胆道、肠、骨髓、造血组织或眼(例如，视网膜)组织。

在一些实施例中，纤维化病状是眼睛的纤维化病状。在一些实施例中，所述纤维化病状是青光眼、黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)、黄斑水肿(例如糖尿病性黄斑水肿)、视网膜病变(例如糖尿病性视网膜病变)或干眼症。

在某些实施例中，所述纤维化病状是皮肤的纤维化病状。在某些实施例中，皮肤的纤维化病状选自以下的一种或多种：皮肤纤维化(例如肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩)、硬皮病、肾源性系统性纤维化(例如，在严重肾衰竭患者中暴露于钆(其经常用作MRI的造影剂)后产生的)和瘢痕疙瘩。

在某些实施例中，纤维化病状是胃肠道的纤维化病状。在某些实施例中，纤维化病状选自以下的一种或多种：与硬皮病相关的纤维化；辐射诱导的肠纤维化；与前肠炎性病症(例如，巴雷特食管或慢性胃炎)相关的纤维化，和/或与后肠炎性病症(例如，炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎或克罗恩病)相关的纤维化。在一些实施例中，胃肠道的纤维化病状是与硬皮病相关的纤维化。

在一个实施例中，纤维化病状是慢性纤维化病状或病症。在某些实施例中，纤维化病状与炎性病状或病症有关。

在一些实施例中，纤维化和/或炎性病状是骨髓炎，例如慢性骨髓炎。

在一些实施例中，纤维化病状是淀粉样变性。在某些实施例中，淀粉样变性与慢性骨髓炎相关。

在一些实施例中，所述纤维化病状或病症是肝的纤维化病状或病症。在某些实施例中，肝的纤维化病状选自：非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪肝病(AFLD)或酒精性脂肪变性肝炎(ASH)。在一些实施例中，肝的纤维化病状选自：肝硬化、胆汁淤积性肝病(例如原发性胆汁性肝硬化(PBC))、胆管损伤、胆汁纤维化或胆管病。

在一些实施例中，纤维化病状或病症不是肝纤维化病状或病症。在一些实施例中，纤维化病状或病症不是肌肉纤维化病状或病症。

剂量方案

组合物(例如，活性部分)可以根据本文所述的剂量方案施用以减少或治疗纤维化。例如，可以以每天2g+/-20％至每天90g+/-20％(例如，每天72g+/-20％总氨基酸实体)的剂量将组合物施用至对象持续例如两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周或更长的治疗期。

在一些实施例中，可以以单剂量或多剂量方案向具有纤维化病状或病症的对象提供组合物。在一些实施例中，剂量每天施用两次、每天施用三次、每天施用四次、每天施用五次、每天施用六次、每天施用七次或更多次。在一些实施例中，每天施用组合物一次、两次或三次。在一些实施例中，组合物施用至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周。在一些实施例中，所述组合物长期施用(例如，超过30天，例如，31天、40天、50天、60天、3个月、6个月、9个月、一年、两年或三年)。

在一些实施例中，组合物在进餐之前施用。在其它实施例中，组合物与膳食同时施用。在其它实施例中，组合物在进餐后施用。

可以每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每9小时或每10小时施用组合物，以改善或降低对象(例如，具有纤维化病状或病症的对象)中的纤维化。

在一些实施例中，组合物包含四个棒状包，例如，每个棒状包包含本文所述的组合物中包含的每种氨基酸实体的量的25％+/-15％。在一些实施例中，每天三次施用四个棒状包。在一些实施例中，组合物包含三个棒状包，例如，每个棒状包包含本文所述的组合物中包含的每种氨基酸实体的量的33.3％+/-15％。在一些实施例中，每天三次施用三个棒状包。

在一些实施例中，组合物以约2g+/-20％至50g+/-20％总氨基酸实体的剂量施用，例如每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次或每天六次(例如每天三次)。在一些实施例中，以2g+/-20％至10g+/-20％总氨基酸实体的剂量每天三次施用组合物，例如8g+/-20％或10g+/-20％总氨基酸实体每天施用三次。在一些实施例中，组合物以10g+/-20％至20g+/-20％总氨基酸实体的剂量每天施用三次，例如11g+/-20％、12g+/-20％、15g+/-20％、16g+/-20％或20g+/-20％总氨基酸实体每天施用三次。在一些实施例中，组合物以20g+/-20％至30g+/-20％总氨基酸实体的剂量每天施用三次，例如21g+/-20％、22g+/-20％、23g+/-20％或24g+/-20％总氨基酸实体每天施用三次。

活性部分的制备和药物组合物

本公开内容的特征在于制造或制备前述发明的组合物(例如，活性部分)的方法。用于制备组合物的氨基酸实体可以是聚结的和/或速溶的，以有助于分散和/或溶解。

所述组合物可以使用来自以下来源的氨基酸实体制备，或者可以使用其他来源：例如FUSI-BCAA速溶掺合物(重量比为2:1:1的L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸)、速溶L-亮氨酸和其它酸可以从Ajinomoto Co.,Inc.获得。医药级氨基酸实体原料可用于制备药用氨基酸实体产品。食品(或补充剂)级氨基酸实体原料可用于生产膳食氨基酸实体产品。

为了制备本公开的组合物，可以使用以下一般步骤：可以在掺合单元中掺合起始物料(单独的氨基酸实体和赋形剂)，然后验证掺合物的均匀性和氨基酸实体含量，并将掺合的粉末填充到棒状包或其它单位剂型中。棒状包或其它单位剂型的内容物可在用于口服施用时分散在水中。

本发明的食品补充剂和医学营养组合物将是适于口服施用的形式。

当将原料，例如药物级氨基酸实体和/或赋形剂组合到组合物中时，污染物可能存在于组合物中。当组合物基本上不包含(例如，包含小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.1、0.01或0.001％(w/w))污染物时，组合物满足污染水平的标准。在一些实施例中，本文方法中描述的组合物不包含污染物。污染物包括并非有意存在于组合物中的任何物质(例如，药物级氨基酸实体和赋形剂，例如，口服施用组分，可以有意存在)或对组合物的产品质量参数具有负面影响的任何物质(例如，对象中的副作用、降低的效力、降低的稳定性/保质期、变色、气味、不良味道、不良质地/口感或组合物的组分的增加的分离)。在一些实施例中，污染物包括微生物、内毒素、金属或其组合。在一些实施例中，例如由金属、卵磷脂、胆碱、内毒素、微生物或组合物的每个部分的其他污染物(例如，来自原料的污染物)引起的污染水平低于食物中允许的水平。

赋形剂

本文披露的氨基酸组合物可以与一种或多种赋形剂复合或调配。合适的赋形剂的非限制性实例包括促味剂、矫味剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、黏合剂、致密剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂和着色剂。

在一些实施例中，赋形剂包含缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。

在一些实施例中，赋形剂包含防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，例如α-生育酚和抗坏血酸盐，和抗微生物剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。

在一些实施例中，组合物包含黏合剂作为赋形剂。合适的黏合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯恶唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖及其组合。

在一些实施例中，组合物包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、Sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和轻质矿物油。

在一些实施例中，组合物包含分散增强剂作为赋形剂。合适的分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、黄原胶、膨润土、纯化的木质纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶型硅酸盐和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。

在一些实施例中，所述组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施例中，崩解剂是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶化淀粉和改性淀粉，甜味剂，粘土，例如膨润土，微晶纤维素，海藻酸盐，羟基乙酸淀粉钠，树胶，例如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐树胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施例中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

在一些实施例中，赋形剂包括调味剂。调味剂可以选自合成的调味油和调味芳香剂；天然油；来自植物、叶、花和果实的提取物；以及它们的组合。在一些实施例中，调味剂选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树；香草；柑橘油如柠檬油、橙油、葡萄和葡萄柚油；和水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏。

在一些实施例中，赋形剂包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载剂时)；糖精及其各种盐，例如钠盐；二肽甜味剂，例如阿斯巴甜糖；二氢查耳酮(dihydrochalcone)化合物，甘草素；甜菊(甜菊苷)；蔗糖的氯代衍生物，例如蔗糖素(sucralose)；和糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。还考虑氢化淀粉水解物和合成甜味剂3,6-二氢-6-甲基-1,2,3-恶噻嗪-4-酮-2,2-二氧化物，特别是其钾盐(乙酰磺胺酸钾(acesulfame-K))和钠盐和钙盐。

在一些实施例中，组合物包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例包括食品、药物和化妆品色料(FD&C)、药物和化妆品色料(D&C)和外用药物和化妆品色料(Ext.D&C)。着色剂可以用作染料或它们相应的色淀。

特定的赋形剂可以包括以下一种或多种：柠檬酸、卵磷脂(例如Alcolec F100)、甜味剂(例如蔗糖素、蔗糖素微粉化NF、乙酰磺胺酸钾(例如Ace-K))、分散增强剂(例如黄原胶(例如Ticaxan Rapid-3))、调味剂(例如香草奶冻(vanilla custard)#4306、Nat OrangeWONF#1326、酸橙865.0032U和柠檬862.2169U)、苦味遮蔽剂(例如936.2160U)和天然或人工色素(例如FD&C黄6号(Yellow6))。每个棒状包的示例性成分内容物示于表7中。

表7.每个棒状包中的成分内容物

在另一个实施例中，赋形剂限于柠檬酸、甜味剂(例如蔗糖素)、黄原胶、香味剂(例如香草奶冻#4036)、调味剂(例如Nat Orange WONF#1362)和着色剂(例如FD&C Yellow6)。赋形剂特别不包括卵磷脂(表8)。

表8.每个棒状包中的示例性内容物

膳食组合物

包括氨基酸实体的组合物(例如，活性部分)可以被调配并用作膳食组合物，例如，选自医疗食品、功能性食品或补充剂。在这样的实施例中，原料和最终产品应符合食品的标准。

本文公开的任何方面和实施例的组合物可以用作膳食组合物，例如选自医疗食品、功能性食品或补充剂。在一些实施例中，膳食组合物用于包括将组合物施用给对象的方法中。该组合物可用于以改善或降低纤维化为目的的膳食组合物中。

在一些实施例中，膳食组合物选自医疗食品、功能性食品或补充剂。在一些实施例中，所述组合物为包含本文所述组合物的营养补充剂、膳食调配物、功能性食品、医疗食品、食品或饮料的形式。在一些实施例中，包含本文所述的组合物的营养补充剂、膳食调配物、功能性食品、医疗食品、食品或饮料用于管理纤维化(例如，在具有纤维化病状或病症的对象中)。

本公开内容的特征在于改善纤维化的方法，所述方法包括向对象施用有效量的本文所述的膳食组合物。

本公开内容的特征在于向患有纤维化的对象(例如，患有纤维化病状或病症的对象)提供营养支持或补充的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的组合物。

本公开内容的特征在于提供有助于管理纤维化(例如，纤维化病状或病症)的营养支持或补充的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的本文所述的组合物。

在一些实施例中，对象已经患有或已经被诊断患有纤维化病状或病症。在其它实施例中，对象未患有纤维化病状或病症。

另外，所述组合物可用于对象(例如，没有纤维化的对象)的膳食管理方法中。

在一些实施例中，对象患有肺纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有心脏或脉管系统纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有肾脏纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有胰腺纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有皮肤纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有胃肠纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有骨髓或造血组织纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有神经系统纤维化病状或病症。在一些实施例中，对象患有眼纤维化病状或病症。

生物标记物

本文公开的任何方法可以包括评价或监测向患有纤维化的对象(例如，患有纤维化病状或病症的对象)施用如本文所述的本发明的组合物(例如，活性部分)的有效性。该方法包括获得组合物的有效性的值，使得该值指示疗法的有效性。

在一些实施例中，对象表现出升高的proC3水平，例如，相对于没有纤维化的健康对象。在一些实施例中，对象表现出升高的ALT水平，例如，相对于没有纤维化的健康对象。在一些实施例中，对象表现出升高的AST水平，例如相对于没有纤维化的健康对象。在一些实施例中，所述对象表现出升高的TIMP(例如，TIMP1或TIMP2)水平，例如相对于没有纤维化的健康对象。在一些实施例中，对象表现出升高的Col1a1水平，例如相对于没有纤维化的健康对象。在一些实施例中，所述对象表现出升高的Acta2水平，例如，相对于没有纤维化的健康对象。在一些实施例中，所述对象表现出升高的Hsp47水平，例如相对于没有纤维化的健康对象。在一些实施例中，对象表现出升高的羟脯氨酸水平，例如，相对于没有纤维化的健康对象。

在一些实施例中，以本文所述的剂量方案向对象施用组合物(例如，活性部分)降低以下一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、11种、12种、13种、14种、15种、16种或更多种(例如，全部)的水平或活性：(a)III型胶原蛋白的N-端片段(proC3)；(b)金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)蛋白；例如，TIMP1或TIMP2；(c)Col1a1；(d)Acta2；(e)ALT；(f)AST；(g)羟脯氨酸；(h)TGF-β；(i)MCP-1；(j)MIP-1；(k)胶原蛋白，例如I型和III型胶原蛋白；(l)α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)；(m)PIIINP；(n)Hsp47；(o)原胶原Iα1；(p)YKL40；或(q)GROα(CXCL1)。

评估(例如筛选)的方法

在另一个方面，本文公开了用于评估如本文所述的组合物的方法或测定。该方法包括：(a)在实施例9中所述的条件下，使一种或多种肝细胞类型(例如，肝细胞、星状细胞或巨噬细胞中的一种、两种或三种，例如，在肝细胞、星状细胞和巨噬细胞的三培养物中)，例如，通过膜(例如，渗透膜，例如，Transwell)分离的肝细胞类型(例如，通过膜与星状细胞和巨噬细胞中的一种或两种分离的肝细胞)与所述组合物接触；和(b)检测纤维化标记物，例如原胶原Iα1、MCP-1、YKL40或GROα(CXCL1))中的一种、两种、三种或更多种(例如全部)的水平。在一些实施例中，纤维化标记物(例如，原胶原Iα1、MCP-1、YKL40或GROα(CXCL1)中的一种、两种、三种或更多种(例如，全部))水平的变化(例如，降低)表明组合物适合于减少或治疗纤维化。在一些实施例中，所述组合物导致纤维化标记物(例如，原胶原Iα1、MCP-1、YKL40或GROα(CXCL1)中的一种、两种、三种或更多种(例如，全部))的水平降低，例如，至少10％、20％、30％、40％、50％或更多，例如，降低，例如，指示所述组合物适合于减少或治疗纤维化的降低。在某些实施例中，所述组合物导致以下各项中的一项、两项、三项或更多项(例如，全部)的降低：

(i)原胶原Iα1的水平(例如，原胶原Iα1水平降低至少20％、30％、40％或50％)；

(ii)MCP1水平(例如MCP1水平降低至少50％、60％、70％、80％或90％)；

(iii)YKL40水平(例如，YKL40水平降低至少70％、80％、90％或95％)；或

(iv)GROα(CXCL1)的水平(例如，GROα(CXCL1)水平降低至少15％、20％、25％或30％)。

在一些实施例中，一种或多种肝细胞类型(例如，肝细胞、星状细胞和巨噬细胞)存在于共培养物中，例如，由膜(例如，渗透膜，例如，Transwell)分离的肝细胞类型(例如，由膜与星状细胞或巨噬细胞中的一者或两者分离的肝细胞)存在于培养物中，例如，肝细胞与巨噬细胞与星状细胞的比率为约10：2：1(例如，由膜(例如，渗透膜，例如，Transwell)分离的肝细胞与星状细胞与巨噬细胞的比率为约10:2:1)。

在一些实施例中，检测步骤包括获得样品，例如培养物样品，例如来自实施例9中所述的Transwell板的培养物样品，并测量纤维化标记物(例如原胶原Iα1、MCP-1、YKL40或GROα(CXCL1)中的一种、两种、三种或更多种(例如全部))的水平。

实施例

以下实施例用于帮助理解本发明，但不是用来，也不应解释为以任何方式限制其范围。

实施例1.治疗性氨基酸组合物A-1治疗改善化学诱导的纤维化动物模型中的肝纤维化

在化学诱导的肝纤维化模型中测试氨基酸组合物A-1影响肝纤维化的能力。在小鼠中使用四氯化碳(CCl₄)化学诱导实验性肝纤维化的常用模型(Gideon Smith,AnimalModels of Cutaneous and Hepatic Fibrosis；Progress in Molecular Biology andTranslational Science,Vol.105,pp.371-408)。CCl₄在治疗4周后引起发炎、肝细胞损伤、坏死和纤维化，在8周后引起肝硬化。通过四氯化碳(CCl₄)在小鼠中诱导的肝纤维化类似于人类肝纤维化的重要特性，包括发炎、再生和纤维形成。

本研究使用7-8周龄的雄性BALB/c小鼠。每笼饲养四只动物，保持标准12小时光照周期，并自由获取水和标准小鼠饲料。食物和水可随意获得。

给动物腹膜内(IP)给药5％CCl₄或载体，通常每周3天，持续4周。CCl4每周调配一次。通过口服管饲法(oral gavage)每天两次以23mg/ml、76mg/ml或153mg/ml给药10ml/kg的氨基酸组合物A-1。每周称重动物两次，每周一次经眼眶后窦收集血液用于血清。四周后，收集血液用于血清分离，并通过颈椎脱位术处死小鼠。除去肝的两个叶-将左叶置于含有10％福尔马林的管中用于组织病理学，同时称重右叶并置于含有2.3mm氧化锆珠和2倍体积的1:100蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich，#P8340)的珠磨器管中。在珠磨器中将组织样品均质化2分钟，并立即在4℃下以3,000rpm离心15分钟。在第2周和第4周分析血清的ALT/AST水平。进一步评估均质化肝脏样品的羟脯氨酸(Hyp)含量以鉴定肝纤维化的形成。

羟脯氨酸(第4周)

羟脯氨酸(4-羟脯氨酸，Hyp)是常见的非蛋白原性氨基酸，并且用作存在的胶原蛋白的量的间接测量，指示纤维化。CCl₄处理的动物中肝脏Hyp含量水平显著高于载体处理的动物。数据是平均值±标准差(STDEV)；"组合物A-1"：氨基酸组合物A-1；与载体对照进行比较，*p<0.05。原始数据示于表9中。

表9.肝羟脯氨酸含量水平结果

AST水平和ALT水平

天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)是肝脏健康的常用测定的临床生物标记物。在整个研究期间，施用CCl₄的动物中AST和ALT两者的水平都显著升高，表明发生了肝损伤。数据是平均值±标准差(STDEV)；"组合物A-1"：氨基酸组合物A-1；p值为与载体/CCl4对照进行比较；通过单尾T检验；n.s.不显著。原始数据示于表29和30中。

表10.ALT水平结果

表11.AST水平结果

简述

用氨基酸组合物A-1处理导致化学诱导的纤维化减少，如通过减少的羟脯氨酸(胶原蛋白产生的标记物)水平所指示的，并且导致肝损伤的临床生物标记物的改善，如通过减少的肝酶ALT和AST的水平所指示的(表12-14)。

表12.肝羟脯氨酸含量水平结果：原始数据

表13.ALT水平结果：原始数据

表14.AST水平结果：原始数据

实施例2.在临床前动物模型中用氨基酸组合物A-1治疗性处理(therapeutictreatment)NAFLD、NASH和HCC。

在STAM^TM模型(Stelic Institute&Co.,Tokyo,Japan；Saito K.等，2015Sci Rep5:12466)中测试了氨基酸组合物A-1和奥贝胆酸(6α-乙基-鹅脱氧胆酸；"OCA")治疗NASH的能力。包括另两组喂食标准饲料的正常C57BL/6小鼠和载体处理的STAM^TM小鼠作为对照。所有接受处理或载体的动物均从6周龄开始处理，直至9周龄。化合物通过口服管饲法施用，剂量体积为10ml/kg。氨基酸组合物A-1以1500mg/kg的剂量每天施用两次，OCA以30mg/kg的剂量每天施用一次。

STAM^TM是一种非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝细胞癌(HCC)的模型，由SMC实验室公司开发，并使用C57BL/6小鼠通过化学和膳食干预的组合产生(Saito K等，2015SciRep5:12466)。小鼠在出生时用低剂量的链脲霉素(streptozotocin)处理，并在4周开始喂食高脂肪饮食。脂肪肝的证据在5周前出现，随后NASH在7周前出现，纤维化在9周前出现。

在53只雄性小鼠中，通过在出生后2天单次皮下注射200μg链脲霉素(STZ，Sigma-Aldrich，USA)溶液并在4周龄后饲喂高脂肪饮食(HFD，57kcal％脂肪，Cat#HFD32，CLEAJapan，日本)来诱导NASH。

氨基酸组合物A-1、OCA和载体(如下所述)通过口服途径以10mL/kg的体积施用。将氨基酸组合物A-1溶解在去离子水中至150mg/ml(10X)。将OCA(Advanced ChemBlocksInc.)重新悬浮于0.5％甲基纤维素水溶液中至3mg/ml(10X)。氨基酸组合物A-1以1500mg/kg的剂量每天两次施用(9am和7pm)。OCA以30mg/kg的剂量每天施用一次(9am)。

2组(载体)、3组(氨基酸组合物A-1)和4组(OCA)的小鼠的肝样品用于下列测定。对于HE染色，从预先固定在Bouin's溶液中的肝组织石蜡块上切片，并用Lillie-Mayer's苏木素(Muto Pure Chemicals Co.,Ltd.，日本)和伊红溶液(Wako Pure ChemicalIndustries)染色。根据Kleiner标准(Kleiner D.E.等，Hepatology，2005；41:1313)计算NAFLD活性评分(NAS)。

研究组

1组：STZ：十只初生儿STZ-引发的小鼠随意进食正常饮食而不进行任何治疗，直到9周龄。

2组：载体：从6到9周龄，十只NASH小鼠以10mL/kg的体积每日两次(9am和7pm)口服施用载体(10％磷酸盐缓冲盐水，pH7.2)。

3组：氨基酸组合物A-1：从6到9周龄，十只NASH小鼠每天两次(9am和7pm)以1500mg/kg的剂量口服施用补充有氨基酸组合物A-1的灌注水。

4组：OCA：从6到9周龄，十只NASH小鼠每天一次(9am)以30mg/kg的剂量口服施用补充有OCA的0.5％甲基纤维素。

5组：正常：十只正常小鼠随意进食正常饮食而不进行任何处理，直到9周龄。

6组：HFD：十只正常小鼠随意进食高脂肪膳食而不进行任何处理，直到9周龄。

组织学结果：HE染色、NAFLD活性评分和α-平滑肌肌动蛋白染色

通过组织学分析和来自每只动物的H&E染色的肝切片的分级评价非酒精性脂肪肝病(NAFLD)活性评分。该评分是对脂肪变性(0-3)、发炎(0-2)和肝细胞气球样膨大(0-2)的程度进行分级的三个单独评分的总和。所有组织都使用Kleiner等人的评分标准(Kleiner等人，Hepatology，2005；41(6)：1313-21)进行分级。结果如表15所示。数据是平均值±标准差(Stdev)。正常的C57BL/6小鼠喂食标准饲料后的平均评分为0+/-0。载体处理的STAM^TM小鼠的平平均评分为4.7+/-0.67。氨基酸组合物A-1处理的小鼠的平均评分为3.1+/-0.74。OCA处理的小鼠的平均评分为2.9+/-0.74。当使用Dunnett氏多重比较检验进行比较时，氨基酸组合物A-1和OCA两者在NAFLD活性评分方面与载体在统计学上不同(氨基酸组合物A-1p＝0.0001，OCA p＝0.0001)。

类似地，氨基酸组合物A-1处理的小鼠显示平均气球样膨大评分0.4+/-0.52，相比之下，载体处理的STAM^TM小鼠的平均气球样膨大评分1.6+/-0.52，OCA处理的小鼠的平均气球样膨大评分0.3+/-0.48。当使用Dunnett氏多重比较检验进行比较时，氨基酸组合物A-1和OCA两者在气球样膨大评分方面与载体在统计学上不同(氨基酸组合物A-1p＝0.0001，OCA p＝0.0001)。原始数据示于表15-18中。

表15.NAFLD活性评分

表16.NAFLD活性：脂肪变性评分

表17.NAFLD活性：发炎评分

表18.NAFLD活性：气球样膨大评分

纤维化：天狼星红(Sirius Red)染色结果

通过分析每只动物的染色肝脏切片的天狼星红阳性染色细胞区域来评价纤维化。使用阳性染色面积的百分比定量图像，作为纤维化的量度。该分析的结果示于表19中。数据是平均值±标准差(Stdev)。正常的C57BL/6小鼠喂食标准饲料后的平均阳性面积为0.286+/-0.09。载体处理的STAM小鼠的平均阳性面积为1.1+/-0.26。氨基酸组合物A-1处理的小鼠的平均阳性面积为0.828+/-0.33。OCA处理的小鼠的平均评分为0.776+/-0.25。当使用Dunnett氏多重比较检验进行比较时，氨基酸组合物A-1和OCA在统计学上不同于载体(氨基酸组合物A-1p＝0.00494，OCA p＜0.016)。原始数据示于表19中。

表19.纤维化(平均阳性染色面积，天狼星红)

与用氨基酸组合物A-1处理后STAM小鼠模型中NAFLD活性评分、气球样膨大和纤维化的统计学显著改善相似(图1A)，用氨基酸组合物A-1处理后在高脂肪、高果糖和胆固醇饮食(HFFC)小鼠模型中确定了NAFLD活性评分、气球样膨大和纤维化的统计学显著改善(图1B)。

α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色结果

将所有小鼠的肝脏切片染色标记物α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)以鉴定活化的肝星状细胞。使用阳性染色面积的百分比定量图像，作为星状细胞活化的量度。结果示于表20中。数据是平均值±标准差(STDEV)；p值为与载体处理的STAM小鼠对照进行比较；通过单尾T检验。正常C57BL/6小鼠喂食标准饲料后的平均阳性面积为0.682+/-0.26。载体处理的STAM^TM小鼠的平均阳性面积为2.128+/-0.50。氨基酸组合物A-1处理的小鼠的平均阳性面积为1.657+/-0.84。OCA处理的小鼠的平均评分为1.562+/-0.31。

表20.活化的肝星状细胞(平均阳性染色区，α-平滑肌肌动蛋白)

用氨基酸组合物A-1处理使NASH的严重程度显著降低到与通过OCA抑制法尼醇X受体(FXR)(目前正在由Intercept Pharmaceuticals,Inc.进行临床研究，用于治疗NASH)相当的水平，如NAFLD活性评分(NAS)的显著降低所示(与OCA处理的小鼠的平均评分2.9+/-0.74相比，氨基酸组合物A-1的平均NAS：3.1+/-0.74，相对于载体处理的STAM小鼠的平均评分4.7+/-0.67，)，以及降低纤维化的发展，如肝星状细胞活化的下调所示(与OCA处理的小鼠的平均面积1.562+/-0.31相比，氨基酸组合物A-1的平均α阳性SMA染色面积：1.657+/-0.84，相对于载体处理的STAM^TM小鼠的平均面积2.128+/-0.50。。

表21.NAFLD活性评分：原始数据

表22.NAFLD活性：脂肪变性评分：原始数据

表23.NAFLD活性：发炎评分：原始数据

表24.NAFLD活性：气球样膨大评分：原始数据

表25.纤维化(平均阳性染色面积，天狼星红)：原始数据

表26.活化的肝星状细胞(平均阳性染色区域，α-平滑肌肌动蛋白)：原始数据

实施例3.用氨基酸组合物处理使肝星状细胞中纤维发生基因的表达降低

健康肝脏中的肝星状细胞位于肝细胞和肝窦状隙内皮细胞之间的Disse间隙中。响应肝损伤，肝星状细胞变得活化、增殖和收缩，增加αSMA的产生、I型和III型胶原蛋白以及特异性MMP和TIMP蛋白的分泌。选择LX-2细胞作为活化的肝星状细胞的模型，并用于测试特定的氨基酸组合物是否会降低TGFβ1诱导的纤维发生基因表达。

在第0天，将LX-2肝星状细胞(Millipore)在添加了2％热灭活胎牛血清(HI-FBS，HyClone)和0.2％Primocin(InVivoGen)的杜贝卡氏改良依格培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium)(DMEM，Corning)中以每孔1.67E4细胞接种在胶原蛋白I包被的96孔微孔板(ThermoFisher)中，，并在37℃，5％CO2下培养过夜。洗涤细胞，用不含氨基酸的DMEM(US Biologicals)替换培养基，所述不含氨基酸的DMEM包含基于人体代谢组数据库(1,2,3)中发布的值的基于血液中平均生理浓度的特定的定制氨基酸浓度，和特定的氨基酸组合物LIVRQ+N-乙酰半胱氨酸、LIVRQ、RQ+N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、LIV的剂量曲线，其为基础HMDB(Human Metabolome Database(Wishart DS,Tzur D,Knox C等，HMDB:the Human Metabolome Database.Nucleic Acids Res.2007Jan；35(Database issue):D521-6.17202168))衍生氨基酸浓度的40倍，或具有分别为HMDB衍生浓度50倍的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或半胱氨酸。含有N-乙酰半胱氨酸的组合以10mM给药。细胞在37℃、5％CO2下预处理6小时。预处理后，将TGFβ1(R&D Systems)或载体掺入每个孔中至5ng/mL的最终浓度，并在该刺激下于37℃、5％CO2下将细胞再培养12小时。

培养12小时后，对裂解物进行RNA提取和定量PCR，以使用TaqMan引物探针(Integrated DNA Technologies：Col1A1，Hs.PT.58.15517795；Actb，Hs.PT.39a.22214847；Acta2，Hs.PT.56a.24853961；Timp2，Hs.PT.58.80594)使用ΔΔCt法测定相对于β-肌动蛋白管家表达标准化的胶原蛋白-1A1表达。

表27显示了与有或没有TGFβ1刺激的载体相比，用氨基酸组合处理的LX-2细胞中的Col1a1、Acta2和Timp2的基因表达。LIVRQ+N-乙酰半胱氨酸、LIVRQ、RQ+N-乙酰半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸降低了Col1a1表达和Timp2表达。LIVRQ+N-乙酰半胱氨酸显示Col1a1、Acta2和Timp2的基因表达的最大降低。LIVRQ-N-乙酰半胱氨酸比单独的N-乙酰半胱氨酸、RQ+N-乙酰半胱氨酸和LIV显著更大地降低Acta2的表达。LIVRQ+N-乙酰半胱氨酸比任何其它组合显著更大地减少Timp2的表达(表27)。

表27.

表28显示了在1×或50×HMDB衍生的氨基酸浓度下，有或没有TGFβ1刺激物时，各个氨基酸的Col1a1表达。单独地，在50X时，只有半胱氨酸显示Col1a1表达的显着降低。

表28.

实施例4.氨基酸组合物处理通过影响脂质代谢和纤维化改善两种啮齿动物模型中NASH的进展

调配氨基酸组合物以同时靶向多种疾病病理学机制，从而安全且有效地处理NASH(表29)。如本文所述，在两个已建立的NASH小鼠模型中研究氨基酸组合物的效力，以确定氨基酸组合物对与NASH和相关病症有关的体征和症状的作用。

表29.氨基酸组合物的示例性氨基酸组分。

STAM^TM小鼠是SMC实验室公司(SMC Laboratories,Inc)开发的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝细胞癌(HCC)的模型。脂肪肝的证据在5周龄时存在，随后NASH在7周龄时存在，纤维化在9周龄时存在。雄性STAM小鼠在C57BL/6小鼠中产生，其在出生后2天接受低剂量链脲霉素，并在4周龄开始饲喂高脂肪饮食(57％kcal脂肪，HFD32，CLEA Japan,Inc.)(Saito K等，2015Sci Rep5:12466；在此通过引用将其全部内容并入本文)。从6周龄开始，以1.6m/kg的剂量每天两次将氨基酸组合物施用STAM小鼠，共3周。包括一组载体处理的STAM小鼠作为对照。未禁食的小鼠在9周龄时安乐死。收集血浆和肝脏样品用于进一步分析(图2)。

FATZO^TM小鼠是近交的肥胖症、代谢综合征和NASH的多基因模型，由CrownBioscience,Inc开发(Peterson RG.Et，2017PLoS一；在此通过引用将其全部并入)。从6周龄开始，给雄性FATZO小鼠喂食高脂肪、果糖和胆固醇(HFFC)饮食(40％kcal脂肪，D12079B，Research Diets,Inc.，和5％果糖饮用水溶液)，以诱导NAFLD和NASH。诱导后4周出现脂肪肝的证据，随后诱导后16周出现NASH，诱导后20周出现纤维化。从诱导后16周开始，以3.0g/kg的剂量每天两次施用设计的氨基酸组合物，持续4周(图2)。一组载体处理的FATZO小鼠作为对照。未禁食的小鼠在诱导后20周安乐死。收集血浆和肝脏样品用于进一步分析。

Aperio ScanScope CS全载玻片数字成像系统(Vista，CA)用于在H&E，PicricSirius Red，SMA，F4/80中成像。从整个载玻片捕获图像。

肝脏由对样品ID不知情的兽医病理学家使用NASH临床研究网络(CRN)肝脏组织学评分系统(Kleiner DE等，2015，在此全文引入作为参考)进行评估。NASH CRN评分系统评估脂肪变性、小叶发炎、肝细胞气球样膨大、变性和纤维化的进展。用NASH评分系统分析每种情况的肝脏的一个横截面。以0-3的等级评估脂肪变性、小叶发炎和纤维化进展。以0-2等级评估气球样膨大退化。

Aperio Automatic Image Quantitation的Positive Pixel Count算法用于定量扫描的载玻片图像中存在的特定染色的百分比。掩蔽并评估颜色范围(色调和饱和度范围)和三个强度范围(弱、阳性和强)。该算法对每个强度范围中的数量和强度和进行计数，以及三个附加量：平均强度、强/总数的比率、以及弱阳性像素的平均强度。

使用特定的阳性像素算法对天狼星红和油红O(Oil Red O)肝脏切片进行成像。修改阳性像素算法以区分橙色和蓝色。对于天狼星红的评估，进行从正常"色调值"(0.1-0.96)和"色饱和度"(0.04-0.29)的改变。将脉管系统和人为假象从分析中排除。

通过Folch's方法(Folch J等，J.Biol.Chem.1957；226:497；在此全文引入作为参考)获得肝脏总脂质提取物。将肝样品在氯仿-甲醇(2:1，v/v)中匀浆并在室温下培养过夜。用氯仿-甲醇-水(8:4:3，v/v/v)洗涤后，将提取物蒸发至干，并溶于异丙醇。分别通过甘油三酸酯E试验和胆固醇E试验测量肝脏甘油三酸酯和胆固醇含量。

使用Illumina TruSeq Stranded mRNA样品制备试剂盒(Illumina#RS-122-2103)将肝RNA样品转化为cDNA文库。在Q2溶液(Morrisville，NC)下分析转录组。将RNA seq数据标准化，并使用Ingenuity Pathway Analysis(QIAGEN Bioinformatics)进行分析。专注于路径水平的小鼠肝基因的表达，因为它可转化为人NAFLD(Teufel A等，Gastroenterology，2016，在此通过引用将其全部内容并入)。

在Human Metabolome Technologies(Yamagata，日本)进行基于毛细管电泳飞行时间质谱(CE-TOFMS)和LC-TOFMS平台的代谢图谱分析。通过将迁移时间和m/z比与真实标准比较来鉴定样品中的代谢物，并通过将它们的峰面积与真实标准的峰面积比较来定量。

使用多重ELISA测定(Meso Scale Discovery，Rockville，Maryland)定量肝脏中IL-1b蛋白的水平。

该氨基酸组合物改善STAM和FATZO小鼠两者的气球样膨大和纤维化

用氨基酸组合物处理显著降低STAM和FATZO小鼠两者中的NAFLD活性评分(NAS)(图3A)。用氨基酸组合物处理也显著降低STAM小鼠中肝细胞的气球样膨大(图3B)。根据组织学测定，通过用氨基酸组合物处理STAM小鼠，脂肪变性和发炎的评分没有改变。用氨基酸组合物处理STAM小鼠后，天狼星红-阳性的纤维化面积显著降低，而用氨基酸组合物处理STAM小鼠后，油红O面积没有改变(图3C)。肝脏甘油三酸酯和胆固醇水平没有改变。

用氨基酸组合物处理也显著降低了FATZO小鼠中肝细胞的气球样膨大(图3D)。脂肪变性和发炎以及肝脏甘油三酸酯和胆固醇水平的评分在用氨基酸组合物处理的FATZO小鼠中没有改变。用氨基酸组合物处理FATZO小鼠，天狼星红-阳性的纤维化面积显著降低，而用氨基酸组合物处理FATZO小鼠，油红O面积没有改变(图3E)。

该氨基酸组合物预防纤维生成路径

纤维化是几种生物过程的联系，例如代谢失调、发炎和细胞死亡。肝细胞中的脂质积累和慢性发炎诱导肝星状细胞的纤维化活化(Wober H等，Cell Res.2009，其通过引用整体并入本文)。用氨基酸组合物处理所产生的肝脏基因表达模式与纤维发生TGF-b信号传导路径的抑制一致(图4)。

越来越多的证据表明CCR2/CCR5及其配体(包括MCP-1/MIP-1)促进巨噬细胞募集和肝星状细胞活化，导致肝组织损伤后的纤维化(Lefebvre E等，PLoS One2016，在此将其全部引入作为参考)。氨基酸组合物在NASH的STAM模型中通过减少肝TGF-b信号传导和MCP-1和MIP-1蛋白而显示出有效的抗纤维化活性(图5)。

在NASH的STAM和FATZO小鼠模型中，氨基酸组合物显示了一致的疾病改变活性，包括NAS的改善和气球样膨大和纤维化的改善。氨基酸组合物的活性似乎至少部分地通过增加脂肪酸氧化、降低与纤维化相关的转录路径的水平来驱动。

实施例5.肝星状细胞的TGFβ1纤维发生基因表达

原代人肝星状细胞从Samsara Sciences获得。细胞在完全HSC培养基中生长至～80％汇合，在T75或T150培养瓶中低于第10代接种到无菌的、胶原蛋白I包被的96孔光学塑料微孔板(ThermoScientific，152036)中，并在37℃、5％CO2的加湿培养箱中在含有2％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM中培养过夜。过夜培养后，洗涤板，并用培养基±单氨基酸缺失(amino acid dropout)、1xhMDB DMEM±补充氨基酸剂量预处理10.5小时。预处理10.5小时后，应用补充了3ng/mL TGFβ1的相同预处理培养基，并在37℃、5％CO2下培养24小时。刺激24小时后，除去上清液，提取RNA，并在每个单个氨基酸缺失和补充中，通过相对于其自身的1×HMDB浓度标准化，使用ΔΔCq法来评估基因表达。

通过ELISA(人原胶原Iα1DuoSet ELISA，R&D Systems)从以1/100稀释在1X试剂稀释液(试剂辅助试剂盒2，R&D Systems)的上清液中测量人原胶原Iα1。

Col1a1基因表达

表30、31-1、31-2、31-3和31-4显示了来自三个不同健康供体的原代人肝星状细胞中Col1a1基因表达的平均倍数变化。LIVRQNAC和LIVRQNAC+S在三个供体中的两个中显示Col1a1基因表达的显著降低。LIVRQNAC+G和RQNAC在所有三个供体中都显示了Col1a1表达的显著降低。LIVRQ仅在一个供体中显示Col1a1基因表达的显著变化。单独的LIV没有显著改变Col1a1基因表达。

当单独施用氨基酸时，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和精氨酸中的每一种在任何供体中都没有显著改变Col1a1基因表达。谷氨酰胺降低了三个供体中的两个中的Col1a1基因表达。N-乙酰半胱氨酸显着降低了Col1a1基因在所有三个供体中的表达。

表30.在施用氨基酸组合物后，Col1a1基因表达的倍数变化，其相对于第一供体中的Gapdh表达标准化

表31.在施用单一氨基酸组合物后Col1a1基因表达的倍数变化，相对于第一供体中的Gapdh表达标准化

表31-1.在施用氨基酸组合物后Col1a1基因表达的倍数变化，相对于第二供体中的Gapdh表达标准化。

表31-2.在施用氨基酸组合物后Col1a1基因表达的倍数变化，相对于第二供体中的Gapdh表达标准化。

表31-3.在施用氨基酸组合物后Col1a1基因表达的倍数变化，相对于第三供体中的Gapdh表达标准化。

表31-4.在施用单一氨基酸组合物后Col1a1基因表达的倍数变化，相对于第二供体中的Gapdh表达标准化。

原胶原Iα1分泌

表32、33-1、33-2、33-3和33-4显示了来自三个不同健康供体的原人肝星状细胞中原胶原Iα1的倍数变化，所述倍数变化是相对于其各自的基线氨基酸条件标准化的。在每个治疗组中，通过单向ANOVA和Dunnett多重比较检验计算统计学显著性。在所有三个供体中，LIV组合显着增加原胶原Iα1分泌。向LIV的组合中加入精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)抵消了单独LIV的促纤维化效应。LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LIVRQNAC+S和RQNAC在所有三个供体中显著降低了原胶原Iα1的分泌。单独地，N-乙酰半胱氨酸显示出显著降低三个供体中的两个中的原胶原Iα1分泌。缬氨酸显著增加了两个供体中的仅一个的原胶原Iα1分泌，而异亮氨酸和精氨酸显著增加了三个供体中的两个的原胶原Iα1分泌。换句话说，单独施用谷氨酰胺对原胶原Iα1分泌没有显著影响。因此，基于单独的氨基酸处理的效果，与单独的LIV相比，具有精氨酸和谷氨酰胺的LIV减少促纤维化效果是无法预期的。

表32.在第一供体中施用氨基酸组合物后原胶原1α1分泌的倍数变化

表33.在第一供体中施用单一氨基酸组合物后原胶原1α1分泌的倍数变化

表33-1.在第二供体中施用氨基酸组合物后原胶原1α1分泌的倍数变化

表33-2.在第二供体中施用单一氨基酸组合物后原胶原1α1分泌的倍数变化

表33-3.在第三供体中施用氨基酸组合物后原胶原1α1分泌的倍数变化

表33-4.在第三供体中施用单一氨基酸组合物后原胶原1α1分泌的倍数变化

实施例6.用氨基酸组合物治疗小鼠模型中的NASH

小鼠中NASH的诱导

在一个实施例中，检测LIVRQNAC和相关氨基酸组合物在FATZO小鼠模型中的肥胖症、代谢驱动的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的作用。

在16周的诱导期，通过在饮用水(WDF)中添加5％果糖的西方饮食(研究饮食#D12079B；脂肪40％kcal、蛋白质17％kcal、碳水化合物43％kcal)在60只雄性FATZO小鼠中诱导NASH。饮食和水可随意获得。建立了以对照饮食(n＝6，Purina#5008；脂肪17％kcal、蛋白质27％kcal、碳水化合物56％kcal)和无菌水喂养的同胎仔畜对照雄性FATZO小鼠，以作为对照。将小鼠收容在具有微隔离器的塑料笼中。每周更换一次无菌垫褥。小鼠每笼收容三只，并在整个研究期间维持十二小时光周期。每天监测室温，并保持在22-25℃，在诱导期每周记录体重。

在16周饮食诱导后，6只小鼠保持对照饮食(组1，对照)，而60只诱导的小鼠依体重和血浆葡萄糖(进食)随机分配用于以下处理。从西方饮食NASH诱导后16周开始，对FATZO小鼠施用测试物品4周。通过口服管饲法施用测试物品。在西方饮食NASH诱导后20周使动物安乐死，并收获组织用于分析。

LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LRQNAC和OCA(Advanced ChemBlocks,Inc.)、赋形剂和灌注水由Axcella Health,Inc提供。0.5％的甲基纤维素由CrownBio,Inc提供。给药溶液按附录1制备。TA化合物(氨基酸组合物)是每天在灌注水和赋形剂0.125％的黄原胶、1.5mM月桂基硫酸钠和0.28％卵磷脂中新鲜调配的氨基酸摻合物(Baxter#27F7114)。将奥贝胆酸(OCA)悬浮在灌注水中的0.5％甲基纤维素中。所有测试物品均冷藏保存。赞助者以冷冻粉末形式提供TA化合物。给药持续4周。

LIVRQNAC+G和LRQNAC的亮氨酸剂量与LIVRQNAC的剂量相匹配。

在整个研究中，通过口服管饲法以10mL/kg的体积施用LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LRQNAC、OCA和载体。剂量通过每日体重计算。LIVRQNAC、LIVRQNAC+G、LRQNAC和载体每天施用两次(BID)，而OCA在早晨每天施用一次(QD)。小鼠每天接受一次OCA(QD)，和一种载体QD。剂量在0700和1800通过口服管饲法施用4周。

每天监测活力、临床体征和行为。在给药期间每天记录体重。每周通过尾夹在AM(0700)中收集血液样本用于葡萄糖测量(StatStrip血糖仪)。

动物用CO2吸入麻醉并通过心脏穿刺放血以安乐死。在麻醉动物结束时通过心脏穿刺获得终末血液样本(K2EDTA)。样品以冷冻形式提供给Axcella Health。记录器官重量(总肝脏，性腺脂肪垫)。将胰腺、小肠和性腺脂肪垫固定在10％缓冲福尔马林中，并按照方案中的指导制备。也将小肠、性腺脂肪垫和肝的切片在液氮中速冻并运输至赞助者。

将肝组织在Bouin溶液中于4℃固定24小时，然后浸入标准浓度的酒精然后二甲苯中，以制备用于石蜡包埋的组织。在石蜡包埋和冷却后，切下五微米切片并染色用于常规H&E和苦味酸(Picric)天狼星红。将肝脏的右和左叶的切片冷冻在OCT中，用于用油红染色分析脂质含量。Aperio全玻片数字成像系统(Scan Scope CS，Vista，CA)用于成像。所有载玻片在20x成像。扫描时间范围从1.5分钟到最大时间2.25分钟。将整个图像容纳并储存在其Spectrum软件系统中，从整个载玻片拍摄图像。

使用NASH肝脏评分标准来评估肝脏。在这个小鼠研究中，用NASH评分系统分析了每个病例的一个肝脏横切面。根据已公开的NASH CRN评分系统，该评分系统包括NAFLD活性评分(NAS)、纤维化阶段和通过模式识别鉴定NASH。NAS可在0至8的范围内，并通过来自H&E染色切片的脂肪变性(0-3)、小叶发炎(0-3)和肝细胞气球样膨大(0-2)的评分的总和来计算。从苦味酸天狼星红染色的载玻片对纤维化评分(0-4)。NASH系统用于人类肝脏18号活组织检查。系统地评估了脂肪变性、小叶发炎、肝细胞气球样膨大变性、纤维化、NAS和通过模式识别的NASH的存在。在本研究中，我们评估了本研究中每只小鼠的肝脏的一个总横截面。这是18号人类肝脏活组织检查的大小的约15倍。病理评分确定为0、+1、+2或+3。对损伤(lesion)的位置(门周(periportal)、小叶中心(centrilobular)和中间带(mid zonal))和脂肪积累(局灶(focal)、门周和/或小叶中心)进行评分。评分的另一部分是损伤的局灶、多灶和/或扩散的分布。此外，轻度、中度和严重的损伤。这些参数构成总NASH评分。

所有免疫组织化学染色步骤使用Dako FLEX系统在自动化免疫染色仪上进行；在室温下进行培养，并且Tris缓冲盐水加0.05％Tween20，pH7.4(TBS-Dako公司)用于所有洗涤和稀释剂。在每次培养后进行彻底洗涤。一级抗体包括抗小鼠SMA、F4/80、Mac-2和苦味酸天狼星红。对照切片用同种型对照使用与第一抗体相同的浓度处理以验证染色特异性。

从H&E染色的切片分析白色脂肪组织(WAT)脂肪细胞大小。使用Aperio ImageScope Application，通过测量每个组织样品的10个最大脂肪细胞的面积来评价该区域的3个局部区域(组织边缘、不在血管周围的组织、血管周围的组织)。在每个组织内，每个区域的10个热点被量化(μm²)并被平均。

通过免疫组织化学染色鉴定胰腺β-胰岛细胞。

采用Aperio自动图像定量(Automatic Image Quantitation)来定量免疫组织化学染色、油红O和天狼星红染色的阳性像素。使用阳性像素计数算法来量化扫描的载玻片图像中存在的特定染色的百分比。掩蔽并评估颜色范围(色调和饱和度范围)和三个强度范围(弱、阳性和强)。该算法对每个强度范围中的数量和强度和进行计数，以及三个附加量：平均强度、强/总数的比率、以及弱阳性像素的平均强度。修改阳性像素算法以区分橙色和蓝色。对于天狼星红评估，进行从正常"色调值"(0.1-0.96)和"色饱和度"(0.04-0.29)的改变。将脉管系统和人为假象从分析中排除。

使用多重ELISA测定(Meso Scale Discovery，Rockville，Maryland)定量肝脏IL-1b蛋白水平。

使用Bonferroni多重比较试验在GraphPad Prism 6(GraphPad软件公司，USA)上进行肝组织学评分的统计学分析。P值＜0.05被认为是统计学显著的。结果表示为平均值±SEM。在第2组(载体)和以下组之间进行比较：第3组(LIVRQNAC1,500mg/kg)，第4组(LIVRQNAC3,000mg/kg)，第5组(LIVRQNAC+G 3,885mg/kg)，和(LRQNAC2,469mg/kg)。

体重和肝重

与对照喂养的动物相比，喂养补充了果糖的西方饮食(WDF)16周引起对体重的显著影响。在施用测试药剂之前，与喂养对照饮食的动物相比，喂养WDF的动物明显更重(47.6±0.45相对于43.9±1.03g；p＜0.01)。

与所有处理组中的基线值相比，体重降低；与载体相比，体重减轻没有显著差异(对于对照、载体、LIVRQNAC(1500mg/kg)、LIVRQNAC(3000mg/kg)、LIVRQNAC+G、LRQNAC和OCA分别为-7.6±0.9、-6.9±1.3、-6.8±1.4、-5.7±1.2、-6.4±1.0、-4.7±1.6和-3.9±1.5％；p＜0.4992)。

与对照饮食相比，喂养WDF的载体处理动物的肝重(体重％)显著更高(7.22±0.3相对5.05±0.24％；p＜0.0001)；然而，在喂养WDF的动物中，在任何处理组中均未发现与载体相比的显著作用(对于载体、LIVRQNAC(1500mg/kg)、LIVRQNAC(3000mg/kg)、LIVRQNAC+G、LILRQNAC和OCA，分别为7.22±03、7.14±0.3、7.19±0.26、6.69±0.18、7.02±0.5和6.81±0.2；p＜0.7450)。

肝脏组织学

用对照饮食喂养的FATZO小鼠发生轻度脂肪变性、气球样膨大或纤维化(图6)。用WDF喂养并用载体处理的FATZO小鼠发生了显著的脂肪变性、气球样膨大和纤维化。与载体组中主要的大泡型脂肪变性相反，在LIVRQNAC、LIVRQNAC+G和LRQNAC组中观察到主要是小泡型和减少的大泡型脂肪变性的混合物，如图7所示。

NAFLD活性评分由固定肝组织中脂肪变性(0-3)和气球样膨大(0-2)的组织学评分计算。在WDF喂养的动物中，与载体处理组相比，所有的氨基酸组合物处理都使NAS显著减少(图8)。与载体相比，LIVRQNAC和氨基酸组合物处理减少了肝脂肪变性，尽管只有LIVRQNAC+G和LRQNAC达到统计学显著性(p＜0.05)，而LIVRQNAC没有达到(LIVRQNAC3.0G/kg，p＝0.12)。所有氨基酸组合物的处理均显著减轻了肝细胞气球样膨大、脂毒性和细胞死亡的生物标记物。总之，氨基酸组合物相关的肝病理的改善主要归因于肝细胞气球样膨大的减弱。与载体相比，OCA对NAS评分和NAS组分没有显著影响。

来自载体处理的动物的肝脏显示轻度纤维化；评分0.8±0.1。当与载体处理组相比时，只有来自用LIVRQNAC(1500mg/kg)处理的动物的肝显示纤维化的显著减少(0.2±0.1相比0.8±0.1，p＜0.01)，而用LIVRQNAC(3000mg/kg)、LIVRQNAC+G或LRQNAC处理则没有。天狼星红胶原蛋白染色证明，与载体相比，所有氨基酸组合物处理具有显著更低的胶原蛋白沉积(LIVRQNAC1500mg/kg，p＜0.01；LIVRQNAC3000 mg/kg，p＜0.01；LIVRQNAC+G，p＝0.09；LRQNAC，p＜0.05)。OCA不影响肝纤维化评分或天狼星红胶原蛋白染色区域。

肝脏趋化因子和细胞因子

如表34所示，与对照饮食喂养的小鼠相比，WDF喂养的小鼠的肝脏中促发炎细胞因子IL-1b蛋白水平升高。

表34.施用氨基酸组合物后平均肝脏IL-1b蛋白水平

简述

基于临床观察，WDF喂养的FATZO小鼠比那些用对照饮食喂养的小鼠增加更多的体重。所有处理在FATZO小鼠中都有良好的耐受性。WDF喂养的小鼠和对照饮食喂养的小鼠两者在处理期间体重减轻，这可能是由于与每天两次通过口服管饲法施用测试物品或载体相关的应激。

与载体相比，NAS在所有氨基酸组合物处理组中显著减弱，主要归因于气球样膨大评分。在所有氨基酸组合物处理组中肝细胞气球样膨大显著减少。在LIVRQNAC+G和LRQNAC处理组中，脂肪变性显著减少。LIVRQNAC也降低了脂肪变性，尽管差异不显著。与组织学和生物化学数据一致，氨基酸组合物处理不影响脂肪从头合成(de novo lipogenesis)酶FASN和ACACA的RNA水平。

肝细胞脂肪变性的特征因氨基酸组合物处理而不同。WDF-喂养的小鼠(载体组)的肝脏主要显示大泡型脂肪变性。相反，在所有氨基酸组合物处理组中，大泡型脂肪变性减少，并且是小泡型和大泡型脂肪变性的混合。氨基酸组合物对大泡型到小泡型脂肪变性表现型的生物学意义和机制值得进一步研究。

低剂量LIVRQNAC处理而不是高剂量LIVRQNAC处理使NAFLD的FATZO模型中的肝纤维化评分显著减弱。LIVRQNAC+G和LRQNAC对纤维化没有影响。尽管如此，天狼星红胶原蛋白染色证明LIVRQNAC、LIVRQNAC+G和LRQNAC显著减少了肝脏中的胶原蛋白沉积。

总之，在FATZO小鼠中测试的所有三种氨基酸组合物(LIVRQNAC、LIVRQNAC+G和LRQNAC)减弱NAFLD活性评分、肝细胞气球样膨大和纤维化。这些氨基酸组合物可用于处理NASH。含甘氨酸的氨基酸组合物可进一步减少路径，导致肝纤维化减少。

实施例7.用氨基酸组合物治疗对象。

本文所述研究的特征在于向患有2型糖尿病(T2DM)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的对象施用包含氨基酸的组合物。该PRE-IND和IRB批准的研究的目的是通过观察在施用6周和12周后纤维化、发炎、胰岛素敏感性、葡萄糖和脂质代谢、和细胞凋亡的各种标记物，确定氨基酸组合物的安全性和耐受性以及其对人生理学的结构和功能的影响。该组合物包括每个棒状包约1g L-亮氨酸、约0.5g L-异亮氨酸、约0.5g L-缬氨酸、约1.5g L-精氨酸(或1.81g L-精氨酸HCl)、约2.0g L-谷氨酰胺和约0.15g N-乙酰半胱氨酸，用于以四个棒状包每天三次(例如，总共约72g每天，或约24g每天三次)施用。

在该研究中，对象每天接受氨基酸组合物三次，持续12周。氨基酸以粉末形式提供以溶解在12盎司水中。在12周的研究期间提供参与者氨基酸组合物。

本研究的主要疗效指标(outcome measure)是安全性和耐受性。次要疗效指标是通过与代谢、发炎和纤维化有关的生物标记物来检查对人类生理学的影响。在基线(第1天)、在研究的第6周和第12周进行评估。

选择对象的关键标准包括以下：年龄为18至70岁的男性或女性，包括端值；愿意并能够提供书面知情同意书；筛选时T2DM或血红蛋白A1c(HbA1c)的病史≥6.5％且＜10％；通过以下标准之一记录脂肪肝疾病：a.通过以下方法中的至少一种在筛选3个月内确认脂肪变性的先前病史：MRI测定的肝脂肪，PDFF≥8％；Fibroscan的控制衰减参数(ControlAttenuation Parameter)≥300dB/m；肝活组织检查表明非NASH NAFLD脂肪变性＞I级。如果患者在筛选的3个月内没有这种记录的先前的脂肪变性病史(如4a中所记录的)，则在筛选时必须使用下式记录到≥10％的肝脂肪评分：

预测的肝脂肪百分比＝10^(-0.805+(0.282*代谢综合征[是＝1/否＝0])+(0.078*2型糖尿病[是＝2/否＝0])+(0.525*log10(胰岛素mU/L))+(0.521*log10(AST U/L))–(0.454*log10(AST/ALT))34

注意：胰岛素、ALT和AST应当在空腹血清样品中测量。对象必须在筛选前3个月内进行稳定的运动、饮食和生活方式常规，没有大的体重波动，即在筛选时，对象在过去的3个月内应在其体重的±3％内。筛选时的身体质量指数(Body mass index)(BMI)≥32kg/m2。对于MRI设备不能容纳BMI≥45kg/m2的患者的地点，可以应用40-45kg/m2的上限。患者必须在筛选之前接受稳定剂量的葡萄糖降低药物(其可以包括二甲双胍、磺酰脲类、二肽基肽酶-4[DPP-4]抑制剂、钠-葡萄糖共转运蛋白2(sodium-glucose co-transporter2)[SGLT2]抑制剂或长效基础胰岛素)至少3个月，并且计划在研究期间保持相同的药物，而没有预期其药物剂量调整。参见以下第8部分的排除的糖尿病相关药物的完整列表。如果对象同时接受抗高血压药物(例如，β阻断剂、氢氯噻嗪、ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂)、用于血脂异常的药物(例如，他汀类药物、贝特类药物)和用于甲状腺功能低下的药物(例如，左旋甲状腺素)的治疗，只要他们在筛选前服用稳定剂量和疗程的这些药物至少3个月，并且计划在研究期间保持相同的药物而没有预期其药物剂量调整，他们就可以包括在研究中。对象可以服用维生素补充剂(例如多种维生素；维生素E＜400IU/天)。然而，他们必须在筛选前服用稳定剂量和疗程的这些维生素补充剂至少3个月，而没有预期的剂量调整。具有生育可能性(childbearing potential)的女性对象在筛选时必须具有阴性血清妊娠试验，并且必须同意在整个研究期间以及在研究治疗最后一次剂量后30天在异性性交期间使用高效的避孕方法。生育可能性是指那些没有进行子宫切除术、双侧卵巢切除术或医学记录的卵巢衰竭的女性对象，或年龄<50岁、有任何持续时间闭经的女性。

LIVRQNAC在第12周减少血浆pro-C3和其它关键纤维化生物标记物，支持纤维发生的抑制。在基线(第1天)和在第6和12周确定血浆proC3、PIIINP和TIMP-1的平均水平。图9A显示在指定数量的对象中Pro-C3随时间的平均值(ng/ml，+/-SEM)。与第1天相比，LIVRQNAC在第12周显著地(p＜0.05)降低了pro-C3水平。图9B显示相对于第1天，LIVRQNAC在第6周和第12周趋于降低PIIINP和TIMP-1水平(ng/ml，+/-SEM)。

该研究的发现表明，氨基酸组合物具有良好的安全性和耐受性特征，并影响与纤维化相关的人体结构和功能的生物标记物。

实施例8:肝星状细胞的TGFβ1纤维发生基因表达

根据以下选择供体的标准从Samsara Sciences获得原代人肝星状细胞：成人年龄(18至50岁之间)，正常BMI(＞18.5和＜25)，并且没有混杂的肝病。将在完全HSC培养基中生长至～80％汇合的细胞在T75或T150培养瓶中低于第10代接种到无菌的、I型胶原蛋白包被的96孔光学塑料微孔板(ThermoScientific，152036)中，每孔6000个细胞(～1250个细胞/cm2)，并在37℃、5％CO2的加湿培养箱中在含有2％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM中培养过夜。

过夜培养后，将板从培养箱中移出，轻轻地用移液管移出培养基，用每孔150μLDPBS洗涤两次。除去DPBS，并将预处理培养基(±单个氨基酸缺失，±1X HMDB DMEM+1％抗生素-抗真菌剂，10mM HEPES，±补充氨基酸剂量；有关培养基组成，参见实验)以150μL/孔应用于细胞。将板放回培养箱中10.5小时。

预处理10.5小时后，从细胞中除去培养基，并使用现在补充了3ng/mL TGFβ1的相同的预处理培养基。每个平板包含含有3ng/mL TGFβ1的1X人血浆氨基酸(HMDB或PAA)浓度培养基，含有0ng/mL TGFβ1的1X HMDB，以及含有3ng/mL TGFβ1+20μM水飞蓟宾(Silybin)的1X HMDB，以用作对照。然后将板在37℃，5％CO2下培养24小时。

在24小时刺激后，取出上清液并以两个单独的等分试样在-80℃冷冻。然后用缓冲液FCW(FastLane Cell Multiplex NR Kit，Qiagen，216713)以125μL每孔洗涤细胞。立即除去洗涤缓冲液，应用50μL细胞处理混合物(含有基因组DNA清除缓冲液)以裂解细胞，在室温下培养10分钟。然后将RNA裂解物转移至96孔qPCR板中，密封，并在热循环仪上于75℃消化gDNA5分钟。将RNA裂解物在-80℃冷冻。

每20μL一步RT-qPCR反应含有4μL RNA裂解物。Hsp47和Gapdh的基因表达分别使用HEX和FAM荧光通道，用市售引物-探针混合物(人Hsp47引物-探针组，HEX；和人Gapdh引物-探针组，来自IDT的FAM)进行多重化。在每个单氨基酸缺失和补充中，通过相对于其自身的1×HMDB浓度标准化，使用ΔΔCq方法评估基因表达。

结果

Hsp47基因表达

表35、36、37、38、39和40显示了来自三个不同健康供体的原代人肝星状细胞中Hsp47基因表达的平均倍数变化。LIVRQNac、LIVRQNacG、LIVRQNacS、RQNac和N-乙酰半胱氨酸在所有三个供体中降低Hsp47基因表达。LIVRQ仅在三个供体中的一个中降低Hsp47，并且LIV对Hsp47基因表达没有显著影响。

当单独施用氨基酸时，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸在任何供体中没有显著改变Hsp47基因表达。当单独施用氨基酸时，精氨酸显著增加了三个供体中的两个中的Hsp47基因表达。当单独施用时，谷氨酰胺显著增加三个供体之一中的Hsp47基因表达。N-乙酰半胱氨酸显着降低了所有三个供体中Hsp47基因的表达。

表35.在施用氨基酸组合物后Hsp47基因表达的倍数变化，相对于第一供体中的Gapdh表达标准化

表36.在施用单一氨基酸组合物后Hsp47基因表达的倍数变化，相对于第一供体中的Gapdh表达标准化

表37.在施用氨基酸组合物后Hsp47基因表达的倍数变化，相对于第二供体中的Gapdh表达标准化。

表38.在施用单一氨基酸组合物后Hsp47基因表达的倍数变化，相对于第二供体中的Gapdh表达标准化。

表39.在施用氨基酸组合物后Hsp47基因表达的倍数变化，相对于第三供体中的Gapdh表达标准化

表40.在施用单一氨基酸组合物后Hsp47基因表达的倍数变化，相对于第二供体中的Gapdh表达标准化。

实施例9.重现肝脏微环境以审问纤维化的三培养模型

细胞接种和维持

开发了包括肝脏的三种主要细胞类型(肝细胞、肝巨噬细胞和星状细胞)的三培养模型，以评估氨基酸组合L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺和N-乙酰半胱氨酸(LIVRQNAC)对纤维化的影响。

使用96孔或12孔transwell(Corning)共培养从健康供体分离的肝细胞、巨噬细胞和星状细胞。

将从Samsara Sciences获得的并在T150培养瓶中在完全HSC培养基中生长至～80％汇合的原代人肝星状细胞接种到预先用胶原蛋白(Corning)包被的transwell膜的下表面上。

一旦接种星状细胞，也将原代人PBMC衍生的巨噬细胞加到膜的下表面上。在Transwell中，将两种细胞都铺在肝细胞铺板培养基(William's E培养基(Gibco)，其中添加了10％热灭活FBS(Atlanta Bio)、2mM Glutamax(Gibco)和0.2％Primocin(InVivoGen))，并在37℃、5％CO₂下培养6小时。

培养6小时后，将来自健康人供体的原代肝细胞接种在transwell上表面的胶原蛋白凝胶上。将三培养物在上述肝细胞铺板培养基中于37℃、5％CO₂下培养。6小时后，将细胞洗涤一次，并在37℃、5％CO₂的肝细胞铺板培养基中培养过夜。在第1天，将细胞洗涤一次，并在补充有2mM Glutamax(Gibco)和1x青霉素/链霉素(P/S)的肝细胞限定培养基(Corning)中37℃、5％CO₂下培养过夜。

氨基酸预处理

在第2天，用DPBS 1X(Gibco)洗涤细胞两次，并保持在：

a.无氨基酸的WEM(美国生物制剂)，补充有11mM葡萄糖(Sigma)，0.272mM丙酮酸钠(Sigma)，1x P/S(Gibco)，并含有基于血液中平均生理浓度的限定的定制氨基酸浓度；或

b.与上述相同的培养基，其中限定的氨基酸组合物LIVRQNAC的一种浓度为30X或40X。

细胞在限定培养基(a和b)中在37℃、5％CO₂下维持24小时。

用游离脂肪酸和不同氨基酸组合物的共处理

预处理24小时后，将细胞维持在上述相同培养基中，并暴露于250μM具有2:1(油酸盐：棕榈酸盐)比例的游离脂肪酸(FFAs)，其中补充有1ng/ml±LIVRQNAC的TNF-α(Thermofiser)。在37℃、5％CO₂下培养24小时后，分别从Transwell的每一侧上除去培养基，并将细胞在与上述相同的条件下再培养48小时。

24小时后通过ELISA分析细胞因子/趋化因子和原胶原Iα1

用来自96孔transwell板两侧的上清液分析多重组的分析物：IL6、IL8、MCP1、IP10、Groα和原胶原Iα1(Fireplex试剂盒，Abcam)。通过ELISA(人壳多糖酶3样蛋白1(YKL40)Quantikine ELISA，R&D Systems)在从12孔transwell板收集的上清液中测量YKL40。

原胶原Iα1分泌

表41显示了用(FFAs TNFα)+LIVRQNAC在30x处理的星状细胞分泌的原胶原Iα1的倍数变化，相对于FFAs+TNFα基线标准化。通过T检验计算的统计学显著性显示LIVRQNAC显着降低了原胶原Iα1的分泌。测量肝细胞侧的原胶原Iα1水平，显示在两种处理之间没有差异(表42)。

表41.与1x的LIVRQNAC相比，施用30x的LIVRQNAC后三培养物中星状细胞的原胶原Iα1分泌的倍数变化

表42.与1x的LIVRQNAC相比，施用30x的LIVRQNAC后三培养物中从肝细胞侧测量的原胶原Iα1水平的倍数变化

表43和44显示了分别用30x的FFA+TNFα+LIVRQNAC处理的巨噬细胞和星状细胞或肝细胞侧分泌的细胞因子和趋化因子的倍数变化，其相对于FFA+TNFα基线(1x的LIVRQNAC)标准化。测量了几种促发炎细胞因子(IL-6、IL-8、IP-10、aad GROalpha(CXCL1))和趋化因子(MCP1)，它们已经确定了化学引诱物性质，并且在NASH患者中显示出被上调。通过T检验计算的统计学显著性显示，与1x的对照LIVRQNAC相比，用30x的LIVRQNAC处理显著降低了IL-6、IP-10、GROα(CXCL1)和MCP1水平。当用30x LIVRQNAC处理时，IL-8水平也降低，然而与1x LIVRQNAC相比，没有表现出统计学显著性。

表43.与1x的LIVRQNAC相比，施用30x的LIVRQNAC后巨噬细胞和星状细胞分泌的细胞因子和趋化因子的倍数变化

表44.与1x的LIVRQNAC相比，施用30x的LIVRQNAC后肝细胞分泌的细胞因子和趋化因子的倍数变化

表45和46显示了用FFA TNFα+LIVRQNAC在40x处理的巨噬细胞和星状细胞或肝细胞分泌的YKL-40的倍数变化，标准化为LIVRQNAC 1x。

YKL40(也称为壳多糖酶3样蛋白1[CHI3L1])的血浆水平在几种炎性疾病中增加，包括NASH。已经显示，在NAFLD患者中，YKL40血浆水平随着纤维化的进展而增加。通过T检验计算的统计学显著性显示40x的LIVRQNAC显著降低肝细胞YKL40水平。当用LIVRQNAC40x处理时，从巨噬细胞和星状细胞侧测得的YKL-40水平也降低，但与LIVRQNAC 1x处理相比，没有表现出统计学显著性。

表45.与1x LIVRQNAC相比，施用40x LIVRQNAC后星状细胞和巨噬细胞分泌YKL40的倍数变化

表46.与1x LIVRQNAC相比，施用40x LIVRQNAC后肝细胞YKL40分泌的倍数变化

实施例10:TGFβ1诱导的肝星状细胞增殖

肝星状细胞的增殖是活化的肝星状细胞的关键表现型特征。根据以下选择供体的标准从Samsara Sciences获得原代人肝星状细胞：成人年龄(18至50岁之间)，正常BMI(＞18.5和＜25)，并且没有混杂的肝病。将来自三个不同供体的细胞在T75或T150培养瓶中在完全HSC培养基中生长至～80％汇合，在低于10代的条件下，以6000细胞/孔(～1250细胞/cm²)接种到无菌的、I型胶原蛋白包被的96孔光学塑料微孔板(ThermoScientific，152036)，并在37℃、5％CO₂的加湿培养箱中，在含有2％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM中培养过夜。

过夜培养后，将板从培养箱中移出，轻轻地用移液管移出培养基，用每孔150μLDPBS洗涤两次。除去DPBS，将预处理培养基(1×HMDB氨基酸DMEM+1％抗生素-抗真菌剂，10mM HEPES，±HMDB氨基酸浓度的倍数(X)的补充处理剂量)以每孔150μL施用于细胞。每种处理和剂量在每个板的三个重复孔中测试。在每个板的6个重复孔中测试载体对照。将板培养过夜。过夜预处理后，从细胞中除去培养基，并使用补充了3ng/mL TGFβ1的相同预处理培养基。为了测定增殖，用10μM EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)标记细胞，其在活性DNA合成期间掺入DNA中。然后将板在37℃，5％CO₂下培养24小时。

在24小时刺激后，取出上清液并以两个单独的等分试样在-80℃冷冻。然后用DPBS洗涤细胞，用4％多聚甲醛溶液固定20分钟。用0.1％Triton X-100透化细胞，并使用click-iT^TMEdU Alexa Fluor^TM555HCS测定法(Invitrogen)根据制造商的说明书标记EdU。细胞核用细胞渗透性DNA结合染料Hoechst33342标记。

使用ImageXpress显微共焦高含量成像仪(Molecular Devices)使用10x PlanApo物镜使细胞成像。每孔成像十二个帧。在Texas Red通道中检测用Alexa Fluor555标记的EdU。在DAPI通道中检测用Hoechst33342标记的细胞核。使用MetaXpress6.2.3.733版(Molecular Devices)进行图像分析。确定每种条件下增殖细胞的数量(定义为EdU标记阳性的那些细胞核(EdU+))和总细胞核计数。EdU阳性细胞百分比(％EdU+)确定为EdU阳性细胞核的数目除以每孔的细胞核总数。相对于用3ng/mL TGFβ1刺激的基线氨基酸(1×HMDB)载体(PBS)条件，计算核计数和％EdU+细胞的倍数变化。将在3ng/mL TGFβ1处理的PBS载体孔中的每种表现型测量的平均值定义为基线。将每个孔中的表现型测量值除以该基线。等于1的得分表示与基线无变化。分数小于或大于1分别意味着减少或增加。对log2转化得分进行统计分析(平均值、标准差计算和双尾t检验)。

结果

表47显示了来自三个不同供体的原代人肝星状细胞中相对于PBS载体条件，活跃增殖EdU阳性细胞百分比的倍数变化的log2转化。LIVRQNAC降低了所有三个供体中活跃增殖的EdU阳性细胞相对于3ng/mL TGFβ1载体的百分比。表48显示了在来自三个不同供体的原代人肝星状细胞中相对于PBS载体条件的细胞核计数倍数变化的log2转化。相对于3ng/mL TGFβ1载体，在测试的三个供体中的两个中，LIVRQNAC在最高两个剂量条件下减少了细胞核计数。

表47.

表48.

尽管已经参照优选实施例和各种替代实施例具体示出和描述了本发明，但是相关领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上对其进行各种改变。

在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。