具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明主要针对大脑皮层深层以及皮层下脑区神经信号的记录，本实施例以小动物为例，但对于灵长类动物的大脑皮层中层及以下深度的脑区同样适用。

一般情况下，由于常规实验技术和条件的限制，一个具体的在体实验采用单一的记录方法，即只记录荧光信号或只记录电信号。现有技术通常使用光纤记录法记录荧光信号，然而光纤记录法无法检测单个细胞的活动，只能检测光纤探针尖端附近的群体神经元荧光信号，而且荧光信号弱、记录光信号系统的采样频率以及信噪比较小等问题制约了光信号所能呈现神经信号的维度和保真度；现有技术通过膜片钳电生理方法记录电信号，然而在体膜片钳电生理方法单次实验只能检测单个细胞的电信号，且记录信号单一，很难获知影响神经电信号的来源。

本发明提供了一种在体膜片钳与光纤记录结合的神经信号记录系统，以解决上述现有技术中存在的局限性问题。本发明的实施例所研究的神经细胞已事先表达有荧光分子和光激活离子通道。如图1所示，为本发明实施例系统的结构框图，包括荧光信号记录单元1、激发单元2、膜片钳记录单元3和控制与处理单元4。控制与处理单元4连接膜片钳记录单元3，膜片钳记录单元3分别连接激发单元2和荧光信号记录单元1。激发单元2主要通过激光激活表达了光激活离子通道的神经细胞，进而实现对神经细胞的兴奋或抑制的调控，或者使表达有荧光分子的神经细胞在激发光下表现荧光强弱的动态变化。荧光信号记录单元1主要是采集表达有荧光分子的神经细胞在激发光下发生荧光变化的荧光信号，这类荧光分子既可以表达在特定脑区也可以表达在特定及非特定脑区的特定类型神经元。膜片钳记录单元3用于采集刺激神经细胞膜电位信号，并与荧光信号记录单元1采集的荧光信号进行整合。控制与处理单元4起到控制的作用，如设定光刺激激光的频率、强度、时间，以及激发荧光信号的激发光强度，增益等指标。除此之外，控制与处理单元4还具有存储数据的作用。在控制与处理单元4的控制下，激发单元2通过激光激活表达有光激活离子通道的神经细胞，或者表达有荧光分子的神经细胞在激发光作用下发生荧光变化，荧光信号记录单元1采集荧光信号，并将所采集到的荧光信号导入膜片钳记录单元3。膜片钳记录单元3记录同一脑区单个神经细胞的膜电位或电流，并同时接收荧光信号记录单元1采集的荧光信号，将荧光信号与电信号进行录入，随后将同一时间采集的荧光信号和电信号整合，保证了信号采集的同步性，最后将数据存储于控制与处理单元4上，实现了结合光纤记录和膜片钳记录方法以达到同时记录同一脑区荧光信号和神经电信号的目的。

具体的，膜片钳记录单元3包括信号记录探头31、电信号放大器32、神经信号采集器33、电生理数模转换器34和BNC电缆35。信号记录探头31、神经信号采集器33、电信号放大器32和电生理数模转换器34通过BNC电缆35依次连接。信号记录探头31进入目标脑区或核团，示例性的，信号记录探头31通过超微推进仪推入目标脑区或核团，吸附于目标脑区或核团的单个神经细胞，之后通过负压将吸附的细胞膜吸破，形成全细胞模式观察该神经细胞的电流或电位变化，使得膜片钳记录单元3可以记录单个神经细胞的膜电位或电流。信号记录探头31所记录的电信号经神经信号采集器33采集，经电信号放大器32放大以避免信号在传输的过程中衰减，随后传送至电生理数模转换器34。

荧光信号记录单元1包括光纤插针11、光纤跳线12和光纤记录主机13。光纤跳线12的一端连接光纤插针11，另一端连接光纤记录主机13。光纤记录主机13包括光路前端、光信号采集器、光信号放大器和光信号转换器，光路前端、光信号采集器、光信号放大器和光信号转换器依次连接。光路前端连接光纤跳线12，用于导入荧光信号。激发单元2包括激光光源21，激光光源21通过光纤跳线12与荧光信号记录单元1的光纤插针11连接。光纤跳线12连接光纤插针11和激光光源21。光纤插针11植入动物大脑的目标脑区或核团，示例性的，光纤插针11通过超微推进仪埋植入动物大脑的目标脑区或核团。激光光源21发出激光激活表达有光激活离子通道的神经细胞，或者表达有荧光分子的神经细胞在激发光作用下发生荧光变化。在本发明的系统中，光纤插针11既可以传递激发光，又可以采集荧光信号，实现了系统的集成，不但降低了系统的成本，而且系统也不会占据太多空间，方便实验人员操作。由于光信号在传输过程中会有所损耗，所以当光纤插针11采集到荧光信号，通过光纤跳线12进入光纤记录主机13，随后经光信号采集器传送至光信号放大器放大信号，经过光信号转换器转换为电信号，输出至电生理数模转换器34。

进一步，光纤记录主机13可根据需求配置相应的特定波长激光或LED光源产生激光。优选的，本实施例中，激发单元2选用双色激光光源，两种颜色的激发光被耦合在同一根光纤中，激发产生的两种荧光信号通过光纤跳线被传输和分别收集。两种颜色波段的荧光信号中，其中一路荧光信号为蓝光激发的敏感荧光信号，另一路荧光信号为红光激发的的荧光信号，其荧光亮度不会受到该被测神经元活动强弱的影响，因此可以作为对照组来排除光纤缠绕和实验动物剧烈运动引起的信号伪迹，从而实现实验动物的自身对照，且通过增大多模光纤的数值孔径，也能提高荧光信号的收集效率。

在本发明中，电生理数模转换器34收集同时进入电生理数模转换器34的由荧光记录单元1采集的荧光信号所转化的电信号和膜片钳记录单元3记录的神经电信号，实现不同信号的同步记录。本发明的系统能够同时反映出脉冲放电等膜电位的变化和相关联环路的神经化学信号变化情况，在提高神经信号记录的维度、形式以及获得数据的丰富性上有质的提升。

控制与处理单元4包括控制模块和数据存储模块。控制模块用于向膜片钳记录单元3发出指令，再通过膜片钳记录单元3控制激发单元2，如设定光刺激激光的频率、强度、时间，以及激发荧光信号的激发光强度，增益等指标，同时通过膜片钳记录单元3对荧光信号记录单元1进行控制。数据存储模块用于存储在电生理数模转换器34录入整合的数据。

现有技术中，光纤插针11的末端为平面，与目标脑区的接触面积有限，对光信号的接收效率较低，限制了光纤插针11对光信号的采集。本实施例中，光纤插针11具有倾斜底面，对直径相同的光纤插针而言，相较于平面，倾斜底面与目标脑区的接触面积更大，对光信号的接收效率更高。进一步，光纤插针11也可以替换为微型玻璃棱镜。

膜片钳记录单元3如果仅记录神经元的放电信号或者场电位,信号记录探头31可以为多通道电极；膜片钳记录单元3如果记录单个神经元的放电，信号记录探头31可以为玻璃微电极。优选的，本发明选用玻璃微电极为信号记录探头31。

本发明还提供了一种在体膜片钳与光纤记录结合的神经信号记录方法，包括以下步骤：

步骤S1，将光纤插针11垂直小动物颅骨A表面插入目标脑区，玻璃微电极以一定的倾斜角度插入同一目标脑区；

如图2所示，为本发明的系统的使用状态图。对于小动物而言，如小鼠，由于其颅骨A表面积比较小，且经过头部固定操作后，颅骨A的部分表面积将被固定剂覆盖，因而缩小了颅骨A的可操作空间。荧光信号记录单元1、激发单元2和膜片钳记录单元3作用于同一脑区，在空间内存在竞争关系。光纤插针11由一定长度的高NA值光纤以及相应的不透光陶瓷套筒组成，考虑到小动物颅骨A有限的操作空间，选用直径为不超过1.25mm的陶瓷套筒，以及直径为不超过200μm的光纤插针11。在保证荧光信号收集效率的前提下尽可能地缩小光纤插针11的直径。膜片钳记录单元3一般采用玻璃微电极进行记录，而玻璃微电极的尖端直径小于4μm，相比光纤插针11，玻璃微电极对脑组织的损伤非常小，适合在脑组织内进行较长距离推进，而光纤插针11的直径较大，对脑组织损伤也相对显著，需要用最短距离到达目标脑区。因而，在具体的实施中，将光纤插针11垂直于小动物的颅骨A表面插入目标脑区。当光纤插针11插入目标脑区时，玻璃微电极在距离陶瓷套筒约1.5mm处倾斜45°-60°插入同一目标脑区，此时，光纤插针11与玻璃微电极在同一空间内实现兼容。进一步，根据小动物颅骨A可操作区域的面积及目标脑区的位置，一根光纤插针11至少可以搭配一个玻璃微电极。

步骤S2，利用激光光源21发出激光，激活表达有光激活离子通道的神经细胞；光纤插针11传导荧光信号，随后经光纤跳线传送至光纤记录主机13，在光纤记录主机13内部，通过光信号放大器13放大信号，经过光信号转换器14转换为电信号；玻璃微电极记录单个神经细胞的膜电位或电流，所记录的电信号经电信号放大器32放大，随后传送至神经信号采集器3；

步骤S3，荧光信号记录单元1收集到的信号与膜片钳记录单元3采集到的信号传入电生理数模转换器34中进行同步；

步骤S4，将电生理数模转换器34中的数据导入控制与处理单元4进行存储。

由此，本发明提供了一种在体膜片钳与光纤记录结合的神经信号记录方法及系统，其中神经信号记录系统包括荧光信号记录单元、激发单元、膜片钳记录单元和控制与处理单元，膜片钳记录单元包括电生理数模转换器。本发明的系统中激光单元与荧光信号记录单元共用一个光纤插针，其中光纤插针既可以传递激发光又可以采集荧光信号。荧光信号记录单元记录荧光信号，膜片钳记录单元记录神经电信号，荧光信号和神经电信号在电生理数模转换器中同步。本发明的系统能够同时反映出脉冲放电等膜电位的变化和相关联环路的神经化学信号变化情况，在神经信号记录的维度、形式以及获得数据的丰富性上有质的提升。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。