过氧化亚硝酸盐荧光探针的设计、合成及活性研究
阅读说明：本技术 过氧化亚硝酸盐荧光探针的设计、合成及活性研究 (Design, synthesis and activity research of peroxynitrite fluorescent probe ) 是由 张卿 王忠长 徐天琦 雷德维 于 2021-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了过氧化亚硝酸盐荧光探针的设计、合成及活性研究,其合成路线如下：。(The invention discloses design, synthesis and activity research of a peroxynitrite fluorescent probe, wherein the synthetic route is as follows:)
技术领域
本发明属于分子生物学、医学等领域，尤其涉及过氧化亚硝酸盐荧光探针的制备方法及检测肿瘤内环境中过表达的ONOO-(过氧化亚硝酸盐)的应用。
背景技术
随着现代生活节奏的加快，肝脏面临着一系列的威胁，例如酒精、药物、有毒物质等。基于此，肝组织更容易产生急性损伤。急性肝损伤(ALI)的典型临床症状通常表现出肝细胞功能的显着衰竭。如果可以通过准确的早期评估，ALI 在去除损伤源以及合理治疗的情况下是可以逆转的。因此，实现ALI的早期诊断，已成为近年来的研究热点。
荧光成像(FLI)以其无创检测、高灵敏度、可原位加工和高时间分辨率的固有优势，在生物医学领域的基础研究和实际应用中引起了极大的兴趣。基于荧光成像技术开发出来的光学探头，极大的满足了ALI早期诊断的要求，表现出高灵敏度、高分辨率以及无创和快速成像等优点。如果该光学探头表现出优异的渗透性和生物相容性，即可以实现实时的原位监测。具体地，对于ALI，其可通过光学探测器来检测潜在生物标志物，包括反应性氮(例如ONOO。-)，反应性硫(H2S 和H2Sn)，酶(LAP、MAO和ALP)。其中，过氧亚硝酸盐(ONOO-)是最常见的生物标志物，这是比过氧化氢效果更强的强氧化剂，表现为超氧阴离子和一氧化氮的组合。虽然过氧亚硝酸盐或许与多种疾病的具有相关性，但要想通过原位监测，它可能与ALI密切相关。至今，许多ONOO-探针已被设计成具有识别部分，包括硼酸酯、靛红、呫吨、二苯基膦酯和硝基苯甲酸酯。然而，对于理想的ONOO-探针，其包含的反应机理仍然不够具体。因此，开发具有新识别基团的新型ONOO-探针仍然是必要的。
基于此，设计合成了以ONOO-为检测物的AIE荧光探针，该探针可直接靶向到肿瘤发生位置，在通过ONOO-的氧化还原作用，使得结构发生改变，发出具有AIE性质的荧光，实现ALI的早期诊断。与此同时，本发明对该荧光探针的生物活性进行了评价。
发明内容
发明目的：
1.提供一个对过氧化亚硝酸盐响应的新化合物，以开发一种新的小分子荧光探针。
2.提供上述小分子荧光探针的制备方法。
3.提供该探针检测ONOO-浓度等方面的初步应用。
技术方案：ONOO-小分子荧光探针的合成与表征：
aReagents and conditions：(a)4-bromo-N，N-diphenylaniline，Pd(PPh3)4，Na2CO3，THF，66℃；(b)3-(4-Methylpiperazin-1-yl)-3-oxopropanenitrile，Toluene，Piperidine，Acetic acid，85℃；(c) CH3I，Ether，35℃.
化合物1的合成：
称取5-醛基-2-噻吩硼酸(156mg，1mmol)，4-溴三苯胺(324mg，1mmol)溶于5 ml无水THF中，随后加入Pd(PPh3)4(232mg，0.1mmol)，Na2CO3(210mg，4mmol)， 66℃加热回流，氮气保护下搅拌反应过夜。待反应完成后，冷却至室温，二氯甲烷萃取，水洗，无水硫酸钠干燥。石油醚∶乙酸乙酯＝40∶1柱层析。得黄色固体。
化合物2的合成：
称取化合物1(178mg，0.5mmol)，3-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-氧代丙腈(167mg，1mmol)溶于10ml甲苯。随后加入哌啶600μl，乙酸600μl。氮气保护下，85℃搅拌回流过夜。待反应完成后，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，拌样，石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1柱层析，得红色固体。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.02(s，1H)，7.81(s，1H)，7.62(s，2H)，7.55(s，1H)，7.33(s，4H)，7.12(s，2H)，7.07 (s，4H)，6.97(s，2H)，3.56(s，4H)，2.35(s，4H)，2.20(s，3H).
化合物3的合成：
称取化合物2(100mg)以及过量碘甲烷，溶于干燥乙酸乙酯中，35℃搅拌回流6h。待反应完全后，将反应体系倒入冷乙醚中，过滤，乙醚洗涤，干燥，得红色固体，化合物3。1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ8.09(s，1H)，7.88(d，J＝4.0 Hz，1H)，7.67(d，J＝8.4Hz，2H)，7.62(d，J＝4.0Hz，1H)，7.37(t，J＝7.7Hz，4H)， 7.14(t，J＝7.4Hz，2H)，7.10(d，J＝7.9Hz，4H)，6.99(d，J＝8.4Hz，2H)，3.98(s，4H)， 3.51(t，J＝5.2Hz，4H).
附图说明
图1为本发明化合物2的核磁共振氢谱示意图
图2为本发明化合物3的核磁共振碳谱示意图
图3为本发明的ONOO-不同浓度梯度下荧光强度示意图
图4为本发明的pH干扰性测试示意图
图5为本发明的选择性示意图
图6为本发明的干扰性示意图
化合物2的氢谱：
见附图1
化合物3的氢谱：
见附图2
生物活性初步评价
不同浓度梯度下荧光强度的变化：
见附图6
附图说明
：该荧光探针对ONOO-响应灵敏，ONOO-浓度的轻微变化，导致其荧光强度的显著变化。pH干扰性测试：
见附图4
附图说明
：该探针(1mM)不受pH变化的干扰，依旧能够保留其在溶液中的稳定性。
选择性测试：
见附图5
附图说明
：该探针分别与13种相关分析物孵育40min后，仍只对ONOO-有显著的响应性。干扰性测试：
见附图6
附图说明
：该探针与13种相关分析物共孵育40min后，并不影响ONOO- 对该探针的选择性。该小分子荧光探针生物活性的初步评价均表明该探针具有检测过氧化亚硝酸盐的作用，可以应用于ALI早期诊断的原位检测。
以上详细描述了本发明的优选实施方式及生物活性评价，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述
具体实施方式
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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