一种壳聚糖固定化酶及其制备方法
阅读说明：本技术 一种壳聚糖固定化酶及其制备方法 (Chitosan immobilized enzyme and preparation method thereof ) 是由 梁力曼 牛奎 张建平 田宏燕 沈莉 于 2021-11-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种壳聚糖固定化酶的制备方法,其包括以下步骤：①配置浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液、浓度为2.25-2.5mg/ml的酶溶液,②将酶溶液加入壳聚糖溶液中形成预混液,并加入乙醇和异丁醇的混合溶液,于35-40℃下搅拌30min-1h,形成壳聚糖固定化酶的凝胶体,③配置浓度为3-5mg/ml的葡萄糖溶液,凝胶体中加入葡萄糖溶液,于35℃交联4h,④降温冷却,用无水乙醇洗涤,干燥后制得壳聚糖固定化酶颗粒。本发明具有生产时间短、制得的固定化酶酶活力回收率高等优点。(The invention discloses a preparation method of chitosan immobilized enzyme, which comprises the following steps: preparing a chitosan solution with the concentration of 1.5mg/ml and an enzyme solution with the concentration of 2.25-2.5mg/ml, adding the enzyme solution into the chitosan solution to form a premixed solution, adding a mixed solution of ethanol and isobutanol, stirring for 30min-1h at the temperature of 35-40 ℃ to form a gel of the chitosan immobilized enzyme, preparing a glucose solution with the concentration of 3-5mg/ml, adding the glucose solution into the gel, crosslinking for 4h at the temperature of 35 ℃, cooling, washing with absolute ethyl alcohol, and drying to obtain the chitosan immobilized enzyme particles. The invention has the advantages of short production time, high recovery rate of enzyme activity of the prepared immobilized enzyme and the like.)
技术领域
本发明涉及固定化酶的技术领域，尤其是一种壳聚糖固定化酶及其制备。
背景技术
固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。
如中国专利公开号为CN105316232A的《一种用于固定化酶制备反应的装置及其应用》所公开的，目前固定化酶最常用的制备方法有交联法和包埋法。
交联法是指借助多功能试剂使游离酶的氨基酸残基与双官能团或多官能团交联剂反应而发生交联的固定化方法。常用的双功能试剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2-2’-二磺酸等，常用的多功能试剂为甲苯-2-异氰-4-异硫氰，其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛具有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成Schiff碱，从而使酶分子交联，制成固定化酶。
包埋法是将酶包埋在多孔载体中使酶固定的方法，其制备工艺简便且条件较为温和。载体不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，可获得较高的酶活力回收率。因此，相对来说，采用包埋法制备的固定化酶具有更大的优势。然而，由于包埋法制备固定化酶常用的载体如明胶、琼脂、琼脂糖、壳聚糖、海藻酸钠等，都具有高粘度的特性，因此制备过程中存在成型难、生产效率低的技术问题，以致无法实现大规模工业化生产。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种壳聚糖固定化酶的制备方法，该方法具有生产时间短、制得的固定化酶酶活力回收率高等优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种壳聚糖固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①将壳聚糖粉末溶于质量浓度为2％的醋酸溶液制成浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，将游离酶溶解于pH为4-6的磷酸缓冲液中制成浓度为2.25-2.5mg/ml的酶溶液，②将酶溶液加入壳聚糖溶液中形成预混液，并加入乙醇和异丁醇的混合溶液，乙醇和异丁醇按重量比1:1-1:4混合，预混液与混合溶液的体积比为0.04-0.06:1，于35-40℃下搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置成浓度为3-5mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入葡萄糖溶液，于35℃交联4h，④降温冷却，用无水乙醇洗涤3次，干燥后制得壳聚糖固定化酶颗粒。
进一步的，所述酶溶液的浓度为2.35-2.5mg/ml。
进一步的，所述混合溶液中乙醇和异丁醇的体积比为1:3。
进一步的，所述游离酶为木瓜蛋白酶。
另一发明目的，本发明还提供了一种壳聚糖固定化酶，其采用上述方法制得。
采用上述方案，本发明制得的壳聚糖固定化酶具有易成型，孔隙多，酶活力回收率高、生产时间短等优点。
下面结合
具体实施方式
对本发明作进一步描述。
具体实施方式
一、本发明的具体实施例的壳聚糖固定化酶按下述步骤制得：
①将壳聚糖粉末溶于质量浓度为2％的醋酸溶液制成浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，将木瓜蛋白酶溶解于pH为4-6的磷酸缓冲液中制成浓度为2.25-2.5mg/ml的酶溶液，
②将酶溶液加入壳聚糖溶液中形成预混液，酶并加入乙醇和异丁醇的混合溶液，乙醇和异丁醇按重量比1:1-1:4混合，混合溶液和预混液的体积比为0.04-0.06：1，于35-40℃下搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置成浓度为3-5mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入葡萄糖溶液交联4-6h，④降温冷却，用无水乙醇洗涤3次，干燥后制得壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例1
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.25mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:3配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入12ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为3mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例2
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.35mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:3配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入12ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为3mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例3
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:3配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入11ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为3mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例4
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:1配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入8ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为3mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例5
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:2配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入9ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为3mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例6
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:4配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入12ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为3mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例7
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:3配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入11ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为4mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
实施例8
①制备浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，制备浓度为2.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，乙醇和异丁醇按重量比为1:3配置混合溶液，
②取100ml酶溶液与100ml壳聚糖溶液混合，加入11ml的乙醇和异丁醇的混合溶液，35℃搅拌30min-1h，搅拌速度为150-200r/min，形成壳聚糖固定化酶的凝胶体，
③将氧化的葡萄糖溶于无水乙醇配置浓度为5mg/ml的葡萄糖溶液，凝胶体中加入1ml葡萄糖溶液滴入凝胶体中交联4h，
④降温冷却，用无水乙醇洗涤，干燥后得到壳聚糖固定化酶颗粒。
二、对上述实施例1-9的壳聚糖固定化酶的酶活性进行测定。
采用分光光度法测定：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。具体步骤如下。
1、酶稀释液
称取L-半胱氨酸盐酸盐(C3H7NO2S·HCL·H2O)5.27g，氯化钠(NaCL)23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH＝5.5，加水稀释至1000ml。
2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。
3、酪蛋白溶液
称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g(精确到0.0002g)，置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH＝7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。
4、三氯乙酸溶液
称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。
5、酪氨酸标准溶液
称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg(精确0.0002g)用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol/l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug/ml的溶液。
6、试样溶液
称取壳聚糖固定化酶0.9g(精确0.0002g)置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用(60min内使用)。
7、测定步骤
吸取试样溶液1.00ml置于10ml具塞比色管中，于37℃±0.2℃水浴中保温10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00ml，摇匀，置37℃±0.2℃水浴中，反应十分钟，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00ml，摇匀，于37℃±0.2℃水浴中放置40min，用干燥滤纸滤过，取滤液，在2h内在波长为275nm处用蒸馏水做参比测出滤液的吸光度A1。
空白试验：吸取试样溶液1.00ml置于10ml具塞比色管中，于37℃±0.2℃水浴中保温10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00ml，摇匀，反应10min，加入在37℃±0.2℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00ml，摇匀，于37℃±0.2℃水浴中放置40min，用干燥滤纸滤过，取滤液，在2h内在波长为275nm初拥蒸馏水为参比册数滤液的吸光度A2。
酪氨酸标准溶液的吸光度：用蒸馏水做参比，在波长275nm处测定50ug/ml酪氨酸标准溶液的吸光度A3。
根据以下公式计算结果：
试样中木瓜蛋白酶活力X1(U/g)按式(1)计算：
(1)
式中：A1——试样溶液的吸光度；
A2——空白试验的吸光度；
A3——酪氨酸标准溶液的吸光度；
m1——对照品溶液中每毫升含酪氨酸的量，单位为微克(μg)；
m2——试样的质量，单位为克(g)；
n——试样溶液的稀释倍数。
U/g表示固定化酶活力，回收率按下式计算：
固定化酶活力回收率(％)＝固定化酶活力(U)/溶液酶总活力(U)×100％。其中，固定化酶活力是指酶被固定化后测得的固定化酶的活力，溶液酶总活力是指固定化前酶溶液中酶的活力。
测试结果如下表1
表1-固定化酶活力回收率
上述实施1-8中可知，固定化酶活力达到31.00-38.22U/g，固定化酶活力回收率达到56.14-66.12％，实施1-3中随着酶溶液浓度的不同，会影响壳聚糖载体上酶的附着，而实施例4-6中，乙醇和异丁醇的配比以及体积的不同，对于壳聚糖载体表面的孔隙成型有影响，当异丁醇含量高时，可以加速凝胶成型，但比表面积相对小，反之，则凝胶成型慢或难以成型，成型后则比表面积较大，葡萄糖溶液的浓度高低则会影响固定化酶的机械强度，对其回收率起到影响。
本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种金属负载的方法