一种新型抗菌羊毛硫肽AmylocinC及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种新型抗菌羊毛硫肽AmylocinC及其制备方法和应用 (Novel antibacterial lantibide AmylocinC and preparation method and application thereof ) 是由 刘洪伟 张丽萍 姚彩苗 赵雯雅 王雅娜 张飞燕 于 2021-02-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型抗菌羊毛硫肽AmylocinC及其制备方法和应用,属于抗菌肽制备领域。本发明通过将抗菌羊毛硫肽AmylocinC前体肽AmyC、合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150的基因通过热激转化法共转化至大肠杆菌感受态细胞,通过大肠杆菌异源表达获得抗菌羊毛硫肽AmylocinC。本发明公开的抗菌羊毛硫肽AmylocinC具有抗菌活性,能够抑制革兰氏阳性菌生长。(The invention discloses a novel antibacterial lantibide Amylocin C, a preparation method and application thereof, and belongs to the field of antibacterial peptide preparation. The invention co-transforms the genes of the precursor peptide AmyC of the antibacterial lantibiotic Amylocin C, the synthetase AmyMB and the peptidase structural domain AmyT150 into escherichia coli competent cells by a heat shock transformation method, and obtains the antibacterial lantibiotic Amylocin C by escherichia coli heterologous expression. The antibacterial lantibiotic Amylocin C disclosed by the invention has antibacterial activity and can inhibit the growth of gram-positive bacteria.)
技术领域
本发明属于抗菌肽制备领域，具体涉及一种新型抗菌羊毛硫肽AmylocinC及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素是全球最常见的处方药物，但在临床使用中由于耐受药性细菌的出现，使抗生素的使用面对越来越严重的挑战。目前全球为抵御致病菌而导致的抗生素乱用问题日益严重，为此寻找一些新型和环境友好型兼备的抗菌物质代替抗生素已成为研究热点。抗菌肽可以快速有效地杀死具有抗生素抗性的细菌，被认为是传统抗生素的最佳替代物。
羊毛硫肽是革兰氏阳性菌产生的一种环状小分子多肽，对多种食源性致病菌及多药物抗性细菌都有一定的抑制作用。羊毛硫肽类抗菌肽作用靶点通常位于细胞壁或细胞膜上，造成细胞壁或膜的结构不完整，形成孔洞从而杀死细菌，这一杀菌机制也导致羊毛硫肽类抗菌肽的耐药性极少出现。因其特殊的靶标识别作用，羊毛硫肽类抗菌肽几乎不会产生抗性，可作为传统抗生素代替药物。目前已经发现及报道的羊毛硫肽类抗菌肽在50种左右，其中NVB302、Mutacin1140、Duramycin、Gallidermin、Nisin及Microbisporicin已经进入临床研究。这样高的临床研究转化率使得羊毛硫肽类抗菌肽在药物研发中极具前景。
但是羊毛硫肽类抗菌肽通常存在抗菌谱较窄和抗逆性不足的缺点，因此开发研究新型高效的抗逆性较强的羊毛硫肽类抗菌肽具有重要的价值。随着高通量测序技术的快速发展，基于大量的微生物基因组数据显示，解淀粉芽孢杆菌在合成多种新颖的羊毛硫肽类抗菌肽方面，其潜力远超以往的认知。解淀粉芽孢杆菌中存在很多编码羊毛硫肽类抗菌肽的生物合成基因簇，这些基因簇在野生型菌株通常是沉默的，通过异源表达的方法实现这些羊毛硫肽类抗菌肽的生产对于研发新型高效的羊毛硫肽类抗菌肽具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型高效的羊毛硫肽AmylocinC及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，进一步扩展抗菌羊毛硫肽的种类，为进一步研发抗菌药物提供新的原料。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
第一方面，提供了一种羊毛硫肽AmylocinC，所述羊毛硫肽AmylocinC的分子结构式为：
所述抗菌羊毛硫肽AmylocinC的骨架氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，第2、7、9和10位的苏氨酸脱水形成脱氢丁氨酸，第16位丝氨酸脱水并与第20位半胱氨酸形成硫醚环，第27丝氨酸脱水并与第32位半胱氨酸形成硫醚环。
第二方面，提供了所述的抗菌羊毛硫肽AmylocinC的制备方法，将抗菌羊毛硫肽AmylocinC前体肽AmyC、合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150的基因共转化至大肠杆菌感受态细胞，通过大肠杆菌异源表达获得抗菌羊毛硫肽AmylocinC。
优选的，所述羊毛硫肽前体肽AmyC基因序列为如下至少一种：
1)SEQ ID NO.1所示的基因序列；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID NO.2所示多肽序列的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码SEQ ID NO.2所示多肽序列的DNA分子。
优选的，所述的合成酶AmyMB的基因序列为如下至少一种：
1)SEQ ID NO.3所示的基因序列；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交并编码具有合成酶AmyMB活性的蛋白质的基因序列；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有合成酶AmyMB活性的蛋白质的基因序列。
优选的，所述的肽酶结构域AmyT150的基因序列为如下至少一种：
1)如SEQ ID NO.4所示的基因序列；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交并编码具有肽酶结构域AmyT150活性的蛋白质的基因序列；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有肽酶结构域AmyT150活性的蛋白质的基因序列。
优选的，通过添加IPTG诱导共表达菌株中羊毛硫肽的异源表达。
优选的，异源表达后还包括分离纯化的步骤，采用半制备高效液相色谱法分离纯化，羊毛硫肽AmylocinC在23min洗脱出峰。
第三方面，提供了所述的抗菌羊毛硫肽AmylocinC在抗革兰氏阳性菌中的应用。
第四方面，提供了一种抗菌药物组合物，包括权利要求1所述的抗菌羊毛硫肽AmylocinC以及药学上可接受的辅料。
第五方面，提供了所述的羊毛硫肽AmylocinC的骨架氨基酸序列，所述的骨架氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述技术方案具有以下技术效果：
从解淀粉芽孢杆菌中鉴定和合成出的新型羊毛硫肽AmylocinC能够为多重耐药细菌的治疗提供新的替代药物，为异源生物合成羊毛硫肽提供技术支持。新型的羊毛硫肽AmylocinC对革兰氏阳性菌有较强的抑制效果，为治疗和预防革兰氏阳性菌提供了新的工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为共表达菌株的PCR扩增产物的结果；
图2为羊毛硫肽AmylocinC的高效液相纯化图；
图3为羊毛硫肽AmylocinC的质谱图；
图4为羊毛硫肽AmylocinC结构示意图；
图5为羊毛硫肽AmylocinC化学结构式。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
除非特殊说明，本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术。
除非特殊说明，本发明中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
LB培养基：用于大肠杆菌的培养；
胰蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母提取物5g，加去离子水定容至1000mL，调节pH值为7.0-7.2。
下述实施例中所用到的菌株和载体：
大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金生物技术公司(TransGen Biotech)。指示菌：金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、大肠杆菌和荧光假单胞菌由河北省科学院生物所保藏。pET-28a、pCDFDuet-1和PACYCDuet-1载体购自天恩泽生物技术公司(TIANDZ)。
下述实施例中所用到的生物信息学工具：
数据库：NCBI(National Center for Biotechnology Information Searchdatabase)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；
分析软件：antiSMASH 4.0(https://antismash.secondarymetabolites.org/)；
BAGEL 3(http://bagel.molgenrug.nl/)；
Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)；
本地软件：EditSeq软件，Primer 5.0软件，MegAlign软件。
本发明涉及的序列中，羊毛硫肽AmylocinC前体肽AmyC的编码基因序列如SEQ IDNO.1所示，其多肽序列如SEQ ID NO.2所示；羊毛硫肽合成酶的基因如SEQ ID NO.3所示；羊毛硫肽肽酶结构域如SEQ ID NO.4所示；羊毛硫肽AmylocinC的骨架氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
实施例1：羊毛硫肽AmylocinC的来源及筛选过程
1、在NCBI数据库中的“Genome”条目下输入“Bacillus amyloliquefaciens”查找解淀粉芽胞杆菌菌种所有菌株基本信息并获取所有菌株的NCBI登录号。
2、通过生物信息学软件antiSMASH 4.0和BAGEL 3挖掘27株解淀粉芽孢杆菌进行了基因组数据挖掘，共预测到314个基因簇，这些基因簇主要分为16种类型。并发现其中DSM7、TA208等12株菌中含有18个第二类羊毛硫肽合成基因簇，共挖掘出21个潜在的第二类羊毛硫肽，其中即存在合成新型羊毛硫肽AmylocinC的前体肽基因。合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150基因从解淀粉芽孢杆菌WS-8基因组序列获得。
实施例2
羊毛硫肽AmylocinC的异源表达
1、将实施例1中挖掘出的羊毛硫肽前体肽AmyC、合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150基因的碱基序列送至NovoPro公司进行合成。并将前体肽基因构建到pET28a载体上，合成酶基因构建到pCDFDuet-1载体上，肽酶结构域基因构建到pACYCDuet-1载体上。
2、将上述的含有羊毛硫肽前体肽AmyC、合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150基因的三个重组载体利用热激转化法共转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，构建共表达菌株。
3、采用含三种抗生素的LB平板(卡纳霉素、壮观霉素、氯霉素)筛选出阳性共表达菌株。
4、采用菌落PCR的方法对共表达菌株的阳性菌落进行鉴定。
所用引物如下所示(SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.11)：
AmyC F1：TAATACGACTCACTATAGGG
AmyC R1：TAGTCGTTACATGGACTGAC
AmyMB F1：CCTGGGTGATATCTATGAAAACTAA
AmyMB R1：TTAATCCAGTGCCAGCGGTGTCG
AmyT150 F1：CACCATCATCACCACCTG
AmyT150 R1：TTAGGCGGTTTTATCTTTGCGTTCC
PCR反应体系为：
含前体肽AmyC共表达菌株PCR验证条件：95℃，2min；95℃，30s,Tm55℃，40s,72℃，30s，共32个循环；72℃，10min；4℃，保存。
含合成酶AmyMB共表达菌株PCR验证条件：95℃，2min；95℃，30s,Tm53℃，40s,72℃，2min，共32个循环；72℃，10min；4℃，保存。
含肽酶结构域AmyT150共表达菌株PCR验证条件为：95℃，2min；95℃，30s,Tm50℃，40s,72℃，1min，共32个循环；72℃，10min；4℃，保存。
共表达菌株验证结果如图1所示，PCR扩增产物条带与目的条带相一致，表明共表达菌株构建成功。
5、挑取共表达菌株菌落接种于100mL含三种抗生素(卡纳霉素、壮观霉素、氯霉素)的LB液体培养基中，37℃培养12h，180rpm连续摇动。
6、以5％接种量接种转瓶至800mL LB液体培养基中，37℃下连续摇动培养。培养90min后，测定OD600值为0.6-0.8时，将摇床温度降低至25℃，半小时后，在超净台上加入IPTG使其终浓度为0.2mM/mL。
7、保持25℃，180rpm连续摇动培养24h后，8000rpm，4℃离心20min，收集菌体。菌体沉淀-20℃保存备用。
实施例3
羊毛硫肽AmylocinC的纯化和鉴定
1、取实施例2所得菌体，甲醇萃取4h后，收集甲醇萃取相，经0.22μm的有机滤膜过滤后，采用半制备高效液相色谱分离纯化(HPLC:SHIMADZU LC-20A,Japan)。
C18柱型号为Shim-pack VP-ODS，内径20mm，柱长250mm，填充介质为C18，检测波长范围(190-800nm)。
流动相由A液和B液组成；
A液：由H2O和三氟乙酸组成，三氟乙酸在A液中的体积百分含量为0.1％；
B液：由乙腈和三氟乙酸组成，三氟乙酸在B液中的体积百分含量为0.1％；
洗脱条件为：10％～35％乙腈线性梯度洗脱(0～13min)；35％～100％乙腈线性梯度洗脱(13～43min)；100％乙腈等度洗脱(43～53min)；100％～10％乙腈线性梯度洗脱(53～63min)；10％乙腈等度洗脱(63～78min)；上样量为5000μL，流速为5mL/min，检测波长为214nm，柱温为30℃。
共表达菌株3BT的异源表达产物高效液相纯化图谱如图2所示，图中以星号标注的色谱峰即为AmylocinC，出峰时间为23min。
2、对纯化后的AmylocinC进行质谱鉴定，结果如图3所示。
采用QTOF MS/MS鉴定AmylocinC结构：在一级质谱的基础上，选择对应分子量为3053.51Da的母离子进行二级串联质谱分析，串联质谱分析结果如图3所示。
羊毛硫肽AmylocinC的结构示意图如图4所示，其第2、7、9和10位的苏氨酸脱水形成脱氢丁氨酸，第16位丝氨酸脱水并与第20位半胱氨酸形成硫醚环，第27丝氨酸脱水并与第32位半胱氨酸形成硫醚环。
羊毛硫肽AmylocinC化学结构式如图5所示。
实施例5：羊毛硫肽AmylocinC生物活性测定
以金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、大肠杆菌和荧光假单胞菌为指示菌做平板对峙实验。制备菌悬液倒入预热融化的固体LB培养基中混匀后到平板，每个平板定量倒入30mL。待平板凝固后，使用直径为8mm的打孔器打孔。每个孔内加入100uL分离组分，最后置于37℃恒温培养箱中培养1天后观察结果，以相同体积的溶剂(乙腈)作为对照，实验结果如表1所示，结果表明，AmylocinC对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有较强抑菌活性。
表1羊毛硫肽AmylocinC生物活性活性测定
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一种新型抗菌羊毛硫肽AmylocinC及其制备方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaaag attttcaagc actgactcca atgactgaag aagaattaaa aaaccttgca 60
gggggatcag atgcaacccc gatgaccgta acgccgacaa ccatcacaat accaatctct 120
ttagcaggct gtccgacgac aaagtgtgcg tctattgtca gtccatgtaa cgactaa 177
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Lys Asp Phe Gln Ala Leu Thr Pro Met Thr Glu Glu Glu Leu
1 5 10 15
Lys Asn Leu Ala Gly Gly Ser Asp Ala Thr Pro Met Thr Val Thr Pro
20 25 30
Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ile Ser Leu Ala Gly Cys Pro Thr Thr Lys
35 40 45
Cys Ala Ser Ile Val Ser Pro Cys Asn Asp
50 55
<210> 3
<211> 2907
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcatcacc atcatcacca catgaacaaa acccagaaca gcgataacta tgtgtatgag 60
aatagcatgc tgaacctgtt caaagaagag gattattttg aaggcttcgc ccagtattat 120
atcagcatct ttaaagccca gatcgtgaaa gaaattgatc gtattccgag cgaaagcctg 180
ctggataaag gttgtctggt tgaaagcatt ctgatcaact acaaaaaaaa gatctatcat 240
ctggcaggca aaaccctgat ccatgaattt catcagacct tcgatgagtt cgatcagaaa 300
aacgagagca aaaactatga catctttagc gaacgcctga aaaatagcgc atttgtggaa 360
gaaatcctga acaattatcc ggttctgcag gatctgatta gccgtagcac cagcgatttt 420
attcgtttta ccatcagcat catcaagcac tgggtgaacg attataagaa aatccagcag 480
aaatttaacc tgagctttgg caaaatgcgc aaaatcaata tgaatgccgg tgatgttcat 540
aatggtggta aaagcgttgt gatcatcgag ttcgaaaata acaagctggt gtataaaccg 600
cgtagcctgg aaattgatgt gttctatgaa aaagtgatcg attatgtgaa ccagtattac 660
cagaccaatc tgaaaacacc gctgagcctg aatcagggtg aatatggttg gcaagaatat 720
gttcagagcg aaccgtgtga taatatcgaa caggtgcgca attattacta tcagtttggt 780
atgcacctgg gcttcattta tgcatttcag ggtagcgatt ttcacttcga aaacattatt 840
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tttagcgaag agaacaaaga aaacgtgaat ctgatggcaa gcgcacaggt gaataaaacc 960
attctgaaaa gcgcactgtt caactatatg agctttccgg aagataatgg cctgacaaat 1020
attggtggtc tgattaatac cgaaaaccag aaaggcgaaa aagaagaagt gctgcatatc 1080
aaaaccgaca aaattagcat gcgcaagaaa cagtacctgt ttaaacgtgg tcgtaatctg 1140
ccggtgtata agaataaagt tgccgaatgc tttgaattcg aacgcgaatt tatcgaaggc 1200
ttcaaacgca tctattttat cctgaaagag gatctgtata tccgcaacct gattagcgat 1260
ctgaattatg caccgattcg tattattgtt cgtccgacct atgtttatgc aagctttctg 1320
gaaacactgc tgcatccgat gtatctgaaa gattatggtg aacgtattcg tgtgctgagc 1380
tttatcaaag atgcctacac caaatacaaa gtgttcgata gcattagccc gttcgagatc 1440
aaagatatga tgattggtga tatcccgtat ttcaacgcac cgattagcga aaaacgtgtg 1500
tattccaata gcatccatgt tgttgatacc ggcattatga aacagagcgc aaaacaagaa 1560
gttctgaccc gtctggcaaa tatgagcgaa gaagatatgc atcagcaggt tagcctgatt 1620
aacatggcac tgagcagcac cgcagcaaat ctggatatta tctataaaaa ccagatcgat 1680
gacttcgttc cgggttatct gaaaaacgac atccagatta aagaactgat ccagattgaa 1740
accgactgca ttctgaagca ggcaattgaa agcgaaaaat atctgcagtg ggttagcatt 1800
gtttcagcac cgaatggcac cctgagcgtt ggtccgctga gttttggtct gtatgatggc 1860
ctggcaggcg tgggtctgta ttttagcgca tatgatttca tctacaacga tgagaaagtg 1920
aaaagcgtgc tgcgtaaaat tgtgaacagc attaaccaga tctacgagca cagcatttac 1980
aaaaccaact ttagcgcctt ttatggcagc agcagctata tctatttcgt gaacaaaatg 2040
cgtggcaccg gtctgtatag cgaaaatgaa gttaatagca tgtgcaaggc ctacctggaa 2100
aaactgcgtc aagaaaccgc acagattacc catacagatt ttattggcgg tctggcaggt 2160
attctgaaag ttgttattca gctgggtcgt tattatcgta ccgaactgat ggaagatacc 2220
gcacgtgcag tttgtaaaga aatttgtaaa cgtgccattc agaatcgcaa tgaggcatat 2280
tggaaaagtg atgccgatga aaatattgtg ctggcaggtt ttagccatgg tattaccggt 2340
atttgttatg ccctgagcga atattatgca catattgaag caagtggcga agttctgcgt 2400
ctgattgaaa gtgcactgaa atatgaggac aagttcttcg acatcaagat caacaaatgg 2460
cgtgataacc gcaaaaacga aagcgattat tcaagcgcaa tgtggtgtca tggtagctgt 2520
ggtatcctgc tgggtcgcag ccgtatttat gaaaatgttg atggtcgtat tcacgtgggc 2580
tatatcaatg aaagcctgga tgataccctg ctgaatggta atagccatcg tcagggttat 2640
agcctgtgtc atggcaccat gggtaatatt gatgttctgc atgcaattaa agagctgtcc 2700
ctgtttaaga accgcaaaca agaaatcgag aacacgatta acatttgggt gaaccacttt 2760
gaagagaatc tgctgaaaaa tggctggcag aatggtattc gtaatgatca tagcggtctg 2820
ggtatgatgc tgggcaaaac cggtcagctg tatgcactgc tgcgcctggt taataaagaa 2880
atcccgacac cgctggcact ggattaa 2907
<210> 4
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcatcacc atcatcacca catgaaaatc cgcaaacgta aactgccggt tattctgcag 60
cgtaatcagt ttgattgtgg tattacctgt ctggcaatgg ttctgagccg tgcagaaggc 120
attaaaatca atccgaataa actgaaactg aacaaagaaa tcattggccg tgatggcacc 180
gatctgattg aaatgaaaaa aatcagcgaa accttcgact acgactttaa agcatttcgc 240
accgataaca tcatgcagct gaaagagctg aataaaaacc atccgctgat tgtgcattgg 300
aaccataatc attttgttgt cgttgatgcc tttggcacgg ataacgttaa aatcattgat 360
ccgagcagcg gtcgtctgac cattacactg gaagaattca aaaccttcta taacggcatt 420
agcattatgc tgatccgcaa aaatgaactg gaacgcaaag ataaaaccgc ctaa 474
<210> 5
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Thr Pro Met Thr Val Thr Pro Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ile Ser
1 5 10 15
Leu Ala Gly Cys Pro Thr Thr Lys Cys Ala Ser Ile Val Ser Pro Cys
20 25 30
Asn Asp
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctgggtgat atctatgaaa actaa 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttaatccagt gccagcggtg tcg 23
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caccatcatc accacctg 18
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttaggcggtt ttatctttgc gttcc 25
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