一种混合菌种固态发酵虾头制备ace抑制肽的方法
阅读说明：本技术 一种混合菌种固态发酵虾头制备ace抑制肽的方法 (Method for preparing ACE inhibitory peptide by solid-state fermentation of shrimp heads with mixed strains ) 是由 朱慧 李云 周飞 于 2021-01-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种混合菌种固态发酵虾头制备ACE抑制肽的方法,包括：虾头的预处理、菌株的活化和种子液的准备、发酵培养基的制备与灭菌、接种与发酵、肽的提取和分离、浓缩、干燥等。本发明的有益效果是：采用固态发酵法,成本低,无需添加的蛋白酶；将虾头预先制成一定粒径的颗粒,增加比表面积和原料利用率,也有利于发酵中热量的散发和菌体对氧的需要；采用两种菌株的混合发酵,利用两种菌株产的多种蛋白酶和肽酶,使得原料的降解更完全；采用定期补加糖的工艺,维持较低的糖浓度以利于菌体利用原料上的成分,促进原料上成分的降解和溶出；采用本发明描述的方法开发的虾头发酵肽,得率和纯度高,具有良好的抑制活性。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a method for preparing ACE inhibitory peptide by solid state fermentation of shrimp heads by mixed strains, which comprises the following steps: pretreatment of shrimp heads, activation of strains and preparation of seed liquid, preparation and sterilization of fermentation media, inoculation and fermentation, extraction and separation of peptides, concentration, drying and the like. The invention has the beneficial effects that: the solid state fermentation method is adopted, the cost is low, and protease does not need to be added; the shrimp heads are prepared into particles with a certain particle size in advance, so that the specific surface area and the utilization rate of raw materials are increased, and the heat dissipation and the oxygen requirement of bacteria in fermentation are facilitated; the mixed fermentation of the two strains is adopted, and the degradation of the raw materials is more complete by utilizing various proteases and peptidases produced by the two strains; a process of adding sugar regularly is adopted, and the lower sugar concentration is maintained to be beneficial to the thallus to utilize the components on the raw material and promote the degradation and dissolution of the components on the raw material; the shrimp head fermented peptide developed by the method has high yield and purity and good inhibitory activity.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为混合菌种固态发酵虾头制备ACE抑制肽的方法。
背景技术
高血压是最常见的慢性病之一，主要表现为体循环动脉压增高的综合征，是多种心脑血管疾病的重要病因和诱发因素。目前我国对高血压疾病的总体知晓率、治疗率和控制率还明显较低。服用化学合成的降压药物是常用的治疗方法，虽然降压的效果明显，但是长期服用易引起干咳、皮疹、血管性水肿、蛋白尿、白细胞减少和停药综合症等不良反应。因此，寻找新型、安全、而且经济的降血压功能成分作为药物或食品功能因子，来预防和治疗高血压是非常必要的。食源降血压肽是来源于食品蛋白序列的肽段，主要通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，起到抑制或缓解血压升高的作用。食源ACE抑制肽具有无副作用，安全性及稳定性好的优点，使其已成为高血压非药物治疗的重点研究方向。
虾头是生产虾仁或去头虾等产品的主要副产物，占虾体重量三分之一左右。虾头从鲜虾上去除后组织酶活跃，水分含量偏高，很难储藏，加工后大部分常常被直接丢弃，或仅简单加工(如干燥、破碎)成养殖用的饲料，不仅污染环境，还造成了资源的浪费。虾头含有大量的蛋白类营养物质，是获得降压活性肽良好原料。研究开发虾头蛋白源ACE抑制肽作为功能食品因子，对降低合成降压药物治疗引起的副作用，预防心脑血管疾病，促进人体健康，具有重要的社会和经济意义。
食源ACE抑制肽的制备主要有酶解法和微生物发酵法。目前，已报道或公开的利用虾头蛋白制备ACE抑制肽的技术中，以酶解的方法为主，采用发酵法的很少。左琦等利用胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶两步酶解虾副产物制备ACE抑制肽，酶解产物ACE抑制的IC50值为1.645mg/mL(食品工业科技,2014,35(10):181-185)。施旭单等以虾壳粉为原料，优选中性蛋白酶为最佳用酶，制备多肽的ACE抑制率为84.04％，水解度为26.76％(食品科学,2012,33(11):131-136)。冯屏等利用碱性蛋白酶酶解虾头蛋白制备ACE抑制肽，酶解产物经凝胶过滤后最高ACE抑制活性组分的IC50为0.79mg/mL(食品科学,2012,33(11):131-136)。朱国萍等利用虾头在自溶过程中的内源蛋白酶水解蛋白制备ACE抑制肽，水解产物经超滤、凝胶层析和离子交换层析后IC50为0.19mg/mL(水产学报,2013,37(4):631-640)。酶解法的优势是工艺较简单，条件温和，能在较短时间内完成酶解过程。由于蛋白酶水解过程存在一定程度的随机性，如何选择合适的反应条件控制酶解过程是获得高产率活性肽的关键。酶解法要能达到较好的工业应用，需要优选具有特异性酶切位点能力的蛋白酶和肽酶，对原料蛋白进行深度水解也需要达到较高的水解度，从而释放高ACE活性的肽段。为实现上述目的，常需要使用两种和多种的酶进行水解，同时过程中需采用高纯度的酶，增加了生产的成本。
发明专利CN200710303512.5，中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用，采用枯草芽孢杆菌作为菌种经液体发酵制备酶液，再利用该酶液与中国毛虾打浆后制备的浆液混合后进行酶解，从酶解液中分离纯化具有六个氨基酸的降压肽，具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。此外，根据体内酶的作用位点，对上述三种六肽可能的酶解产物短肽进行了化学合成，经ACE抑制试验，筛选得到12种序列的短肽具有很好的ACE抑制活性。
上述现有的酶解法技术，蛋白酶反应的体系在水溶液进行，和蛋白酶反应的底物对象主要是物料中的水溶性蛋白，而对于虾头原料，其可溶解性成分少，主要是由不溶的固体成分组成，其中难溶性硬质蛋白(如角蛋白)或疏水性蛋白质采用酶解法则很难利用，因此较难获得很好的原料利用率和多肽产率。
微生物发酵法是制备食源ACE抑制活性肽的重要方法之一。发酵法利用海产品蛋白制备降压肽的关键是具有高蛋白酶和肽酶活力与释放特定功能肽段能力的食品安全菌种。Wang等利用乳酸菌发酵毛虾虾肉获得ACE抑制肽(Applied Microbiology andBiotechnology,2008,79(5):785-791.)。由于乳酸菌生长和发酵对营养要求高，蛋白水解活力弱，需要培养基质含有可利用的碳源和必须生长因子，利用乳酸菌发酵时常需预先用蛋白酶水解原料再进行发酵，添加的物质为后期分离纯化带来困难，使得工艺过程繁琐。
发明内容
本发明的目的在于，解决现有技术中，以虾头为原料制备ACE抑制肽，尚缺乏对原料水解率高、产物抑制活性好的方法。目前主要以酶解法为主，而虾头主要有不溶性的固体成分构成，在液相体系中酶解效率低，较难获得高的蛋白水解率。本发明采用固态发酵的方法，利用接种混合菌种，采用发酵过程中补加糖的方式发酵，提高了蛋白的水解率，获得抑制活性高的小分子多肽。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种混合菌种固态发酵虾头制备ACE抑制肽的方法，包括如下步骤：
A、原料的预处理：将新鲜虾头干燥、粉碎，获得破碎后虾头粉；
B、菌株活化：取枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别进行固体斜面活化培养，获得斜面培养物；
C、种子液的准备：将所述斜面培养物进行扩大培养，获得种子液；
D、发酵培养基的制备、拌料与灭菌：所述破碎后虾头粉与培养液混合并灭菌，获得发酵培养基；
E、接种与固态发酵：将所述种子液与所述发酵培养基混合，开始发酵，从发酵时间24～36小时开始，补加糖源，直至发酵结束，获得发酵物料；
F、肽的提取和分离：将所述发酵物料与酸剂混合，搅拌后经过滤、脱色、超滤、洗脱去杂，获得含ACE抑制肽的洗脱液；
G、浓缩、干燥制成成品：将所述洗脱液浓缩、干燥，获得含ACE抑制肽的虾头发酵多肽粉。
步骤A中，虾头干燥后粉粹成适当粒径的颗粒增加了比表面积，是菌体能充分和原料中的蛋白接触便于酶解释放小分子肽，此外保持一定大小的颗粒大小，起到填充剂的作用，有利于固态发酵中热量的散发和空气流通用于菌体生长的氧的需要。
本发明所用菌株为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的组合，即具有产碱性蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶能力的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌株均可实现该技术方案。芽孢杆菌生长对营养要求低，蛋白水解酶系丰富，可分泌多种胞外蛋白酶和氨肽酶，其中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是商业化中性蛋白酶和碱性蛋白酶重要的生产菌种。此外，如枯草芽孢杆菌等是生产发酵食品如豆豉、豆酱和纳豆等的常用菌种，有良好的安全性，适用于作为发酵菌株制备食源ACE抑制肽。现有利用毛虾全虾制备ACE抑制肽的技术中，如发明专利CN200710303512.5，需在含有特定蛋白的液体培养基预先接入菌种进行发酵、离心去除菌体以制备酶液，再利用发酵制备的酶液在液相体系下水解原料中的目标蛋白(主要为水溶性蛋白，对不溶性蛋白利用率低)，从而获得目标产物。但本发明采用固态发酵的方法，菌体直接生长在固体原料基质上，可以直接以虾头为底物产生蛋白酶和氨肽酶，这些蛋白酶和氨肽酶即可就地水解虾头原料上的蛋白产生ACE抑制肽。与在液相体系中的酶解过程相比，由于菌体生长在原料上，即有利于使原料颗粒进一步降解而促进蛋白的溶出，也可使不溶性的固体蛋白得到有效降解，提高了原料的蛋白水解率。在优选的芽孢杆菌菌株组合的持续存在情况下，产酶和对底物蛋白的水解同步发生、互相促进，ACE抑制肽的生产效率得到大幅度提升，而且由于不需要预先添加外源酶水解(如wang等的方法(AppliedMicrobiology and Biotechnology,2008,79(5):785-791.))，节约了成本。
步骤E中，采用定期补加糖的方式进行，在发酵过程中始终维持降低的糖浓度，以利于菌体利用虾头原料上的成分作为碳源，促进原料上成分的降解和溶出，可以有效提高原料利用率和活性肽的发酵产量，从而提高经济效益。
优选的，包括如下步骤：
A、原料的预处理：将所述新鲜虾头于60～70℃烘箱中干燥18～20小时至恒重，之后采用粉碎机破碎，过8～80目标准筛，获得所述破碎后虾头粉，颗粒粒径为0.2～2.5mm；
B、菌株活化：取所述枯草芽孢杆菌和所述地衣芽孢杆菌分别接种于斜面培养基，37～40℃培养18～24小时，分别获得枯草芽孢杆菌斜面培养物和地衣芽孢杆菌斜面培养物；
C、种子液的准备：将所述枯草芽孢杆菌斜面培养物和所述地衣芽孢杆菌斜面培养物分别接种于种子液培养基，在37～40℃、200～300rpm条件下摇床培养18～30小时，之后加入适量无菌种子液培养基稀释，调整菌体浓度为1～50×107CFU/mL，获得枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液，所述枯草芽孢杆菌种子液和所述地衣芽孢杆菌种子液混合获得所述种子液；
D、发酵培养基的制备、拌料与灭菌：所述破碎后虾头粉按每100g与30～80mL所述培养液混合，混匀后用0.5～0.6mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0～8.0，于121～125℃下灭菌15～20min，获得所述发酵培养基；
E、接种与固态发酵：将所述种子液与所述发酵培养基混合，按每100g虾头粉接种5～20mL所述种子液，在28～40℃、相对湿度60～100％条件下发酵，从发酵时间24～36小时开始，每12～24小时按每100g虾头粉加入灭菌后的20～25g/L葡萄糖溶液10～50mL，发酵至4～7天结束，获得所述发酵物料；
F、肽的提取和分离：将所述发酵物料按每100g与200～500mL浓度为0.05～0.08mol/L盐酸溶液混合，在150～200rpm搅拌、10～30℃条件下提取1～2小时，提取液经200～300目的滤布过滤后得到初滤液，按所述初滤液体积的0.3～0.5％加入活性碳，40～45℃吸附30～60分钟后再次过滤，之后采用5kDa的陶瓷膜进行超滤，保留分子量小于5kDa的组分，再采用1kDa的陶瓷膜进行第二次超滤，保留分子量小于1kDa的组分，合并收集小于1kDa的滤液上样于阳离子交换柱，待小肽完全吸附于柱上后，采用去离子水清洗柱子以去除非肽类杂质，然后用1～2mol/L氨水洗脱吸附在所述阳离子交换柱上的多肽，收集获得含ACE抑制肽的洗脱液；
G、浓缩、干燥制成成品：将所述洗脱液经低温真空浓缩、冷冻干燥，获得含ACE抑制肽的虾头发酵多肽粉。
步骤E中的按发酵培养基中含有的虾头粉质量按每100g与5～20mL的种子液混合，虾头粉仅与少量的发酵培养基、种子液混合，以提供菌体生长的需要，步骤F中的发酵物料主体仍是固体，可以有效地降低发酵成本。
优选的，步骤C中，所述枯草芽孢杆菌种子液和所述地衣芽孢杆菌种子液按体积比1:0.5～3比例混合，获得所述种子液。
优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CMCC63501，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌AS1.269。
所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，两种菌种可产生碱性蛋白酶、中性蛋白酶和氨肽酶，在这些酶的共同作用下，有利于获得一般酶解法较难释放的肽段，作为优选枯草芽孢杆菌菌株CMCC63501、地衣芽孢杆菌菌株AS1.269用于本发明所述的方法中。
即可以理解为，本发明所述的方法，所使用枯草芽孢杆菌的菌株并不限于CMCC63501、地衣芽孢杆菌的菌株并不限于AS1.269，即具备产生碱性蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶能力的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌株均可实现该技术方案。
优选的，步骤B中，所述斜面培养基包括：葡萄糖5～6g/L，胰蛋白胨10～12g/L，氯化钠5～6g/L，磷酸氢二钾2～3g/L，琼脂15～18g/L；调节pH为7.0～7.2，121～125℃灭菌15～20分钟。
优选的，步骤C中，所述种子液培养基包括：葡萄糖10～20g/L，胰蛋白胨5～10g/L，酵母粉2～5g/L，氯化钠1～5g/L，磷酸氢二钾2～3g/L，pH为7.0～7.5，121～125℃灭菌15～20分钟。
优选的，步骤D中，所述培养液包括碳源、氮源、无机盐、表面活性剂；所述碳源的浓度为5～60g/L，所述氮源的浓度为5～100g/L，所述无机盐的浓度为1～5g/L，所述表面活性剂的浓度为0.1～1g/L。
优选的，所述碳源的浓度为10～30g/L。
优选的，所述碳源包括葡萄糖、甘露醇、淀粉中的一种或多种；所述氮源包括酵母浸粉、氯化铵中的一种或多种；所述无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、氯化钙中的一种或多种；所述表面活性剂包括吐温80、表面活性素中的一种或多种。
磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、氯化钙等即能做为无机盐促进发酵，又能补充钾、镁、锌、铁、钙等微量元素。
优选的，步骤F中，阳离子交换柱为Dowex 50WX2。
通过不同的阳离子交换柱的筛选比较，发现Dowex 50WX2能使ACE抑制肽更高效地分离出来。
与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：
1.本发明采用发酵法，微生物具有生长繁殖快、生长条件简单、蛋白水解酶系丰富等特点，与酶解法相比，发酵法成本低，无需添加成本高的蛋白酶，同时可水解利用的蛋白种类多。发酵过程微生物产生的多种蛋白酶和肽酶的共同作用，可获得酶解法无法产生的多肽片段。
2.针对虾头原料是不溶性颗粒的性质，设计采用固态发酵的方式进行。干虾头经粉粹后形成带壳的固体颗粒，适当粒径的颗粒增加了比表面积，是菌体能充分和原料中的蛋白接触便于酶解释放小分子肽，同时保持了一定大小的颗粒，起到填充剂的作用，有利于固态发酵中热量的散发和空气流通用于菌体生长的氧的需要。在固态发酵的模式下，菌体可吸附和粘附在固体物料表面，对难溶性的蛋白进行降解，避免了酶解法无法水解不溶性蛋白的缺点，从而增加原料的水解度。
3.本发明采用芽孢杆菌作为发酵菌株，并设计两种菌株按比例进行混菌发酵。芽孢菌株杆菌具有产多种蛋白酶和肽酶的能力，利用两种菌株的多种酶的产生的多种蛋白酶和肽酶共同作用，有利于获得一般酶解法较难释放的肽段。
4.本发明所述的固态发酵过程中，采用定期补加糖的方式进行，在发酵过程中始终维持降低的糖浓度，以利于菌体利用虾头原料上的成分作为碳源，促进原料上成分的降解和溶出，可以有效提高原料利用率和活性肽的发酵产量，从而提高经济效益。
5.本发明提供了在三角瓶体系和发酵罐体系两种实施方式，具有实用性，可根据具体的实际条件选择实施。
6.采用本发明描述的方法开发的虾头发酵肽，得率和纯度高，具有良好的抑制活性(IC50值小于0.089mg/mL)，此外还具有良好的风味和色泽，可作
为功能因子添加于营养食品和特需食品。
附图说明
图1为本申请固态发酵法和酶解法对原料蛋白水解和产物的ACE抑制活性的效果对比图；
图2为本申请采用单一菌种和混合菌种的效果对比图；
图3为本申请发酵过程补料添加糖的影响对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC63501和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AS1.269，根据保藏号，在公共保藏机构购得。
实施例1
本实施例采用在三角瓶体系中，利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC63501和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AS1.269混合菌种固态发酵虾头制备ACE抑制肽。
具体实施步骤如下：
(1)原料处理准备
新鲜虾头(加工虾仁后的副产物)于60℃烘箱中干燥18小时至恒重，干燥后的虾头采用粉碎机破碎后，过10目标准筛，破碎后颗粒的粒径在2mm左右。
(2)菌株的活化
菌种接种于斜面培养基于37℃培养24小时，用于菌种活化。斜面培养基包括：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，琼脂15g/L；调节pH为7.2，121℃灭菌20分钟
(3)种子液准备
分别将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌斜面菌种接种于种子液培养基，种子液培养基包括：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH为7.5，121℃灭菌20分钟。在37℃、200rpm条件下摇床培养24小时，在培养后的菌液中加入适量无菌种子液培养基稀释，以调整菌体浓度为1×107CFU/mL。
(4)拌料与灭菌
发酵培养基：葡萄糖10g/L、甘露醇5g/L；酵母浸粉0.5g/L、氯化铵0.5g/L；磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸亚铁0.05g/L、氯化钙0.1g/L、吐温80 0.5g/L、表面活性素(Surfactin)0.02g/L。各组分称量好后溶于去离子水制成培养液，培养液按破碎后虾头粉混合。250mL三角瓶装入虾头粉50g，培养液35mL，搅拌充分混合，混匀后用0.5mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.5，于121℃下灭菌15min。
(5)接种与发酵
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌种子液按1:2比例混合后，按每100g虾头粉接种10mL混合种子液。在28℃、相对湿度60％的培养箱中发酵，从发酵时间第24小时开始，每24小时按100g虾头粉加入灭菌后的20g/L葡萄糖溶液50mL，并充分搅拌混匀以便于供氧和释放发酵产热；发酵至第6天结束。
(6)肽的提取与分离
按每100g发酵料中加入300mL 0.05mol/L盐酸溶液，混合均匀后在100rpm搅拌、10℃条件下提取1小时，提取液经200目的滤布过滤后得到初滤液，按初滤液体积的0.3％加入活性碳，40℃吸附30分钟后再次过滤，得到肽提取的上清液。上清液采用5kDa的陶瓷膜进行超滤，保留分子量小于5kDa的组分，再采用1kDa的陶瓷膜进行第二次超滤，保留分子量小于1kDa的组分，合并收集小于1kDa的滤液。滤液上样于阳离子交换柱(Dowex 50WX2)，采用去离子水清洗柱以去除非肽类杂质，然后用1mol/L氨水洗脱吸附在柱子上的多肽，收集洗脱液。
(7)干燥制成成品
将经超滤分离得到的肽溶液进行低温真空浓缩、冷冻干燥，得到虾头发酵肽粉。
本实施例描述的方法得到的虾头活性肽粉采用如下检测方法进行性能测试：
1、ACE抑制活性采用高效液相色谱法(HPLC)法测定：
ACE酶溶于含有50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及300mmol/L NaCl缓冲溶液中至终浓度为0.1U/mL，底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)溶于含有50mmol/L HEPES及300mmol/L NaCl缓冲溶液中至终浓度为5mmol/L。反应体系总体积100μL，40μL反应缓冲液(50mmol/L HEPES及300mmol/L NaCl)和40μL待测样品混合后，于37℃下保温5min，然后依次加入10μL 5mmol/L底物HHL和10μL 0.1U/mL ACE，混匀后37℃下反应30min，加入250μL1mol/L HCl终止反应，采用HPLC法测定酶反应产生的HA。用蒸馏水替代样品作空白对照。HPLC检测条件：流动相组成：0.2％(v/v)TFA溶于含有23％(v/v)乙腈的水溶液中。流速为1mL/min，上样量10μL，检测波长为228nm，检测柱温为25℃。采用228nm检测时，反应产物HA和未反应完的底物HHL均有吸收峰，在本色谱条件下两吸收峰能很好地分离。IC50值定义为在测定条件下抑制50％ACE酶活所需抑制物的浓度。
2、水解度DH％采用邻苯二甲醛(OPA)法测定：
水解度(DH)根据邻苯二醛(OPA)法(Nielsen P M.Journal of Food Science,2010,66(5):642-646.)测定水解释放的α-氨基含量。α-氨基含量用标准曲线对应的丝氨酸浓度表示。以酶解样品测定的α-氨基含量与底物蛋白完全酸水解后测定的α-氨基含量的百分比表示水解度DH％。
3、活性肽的分子量分布采用高效体积排阻色谱注方法测定：
色谱柱:TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm凝胶柱，流动相组成：乙睛:水:三氟乙酸(体积比)＝40:59.95:0.05，检测波长：220nm，流速:0.5mL/min，柱温：30℃，进样体积：10μL。冷冻干燥的样品配制成0.2mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜后上样，在上述色谱条件下进样分析。根据相对分子质量校正曲线方程对样品的色谱图及其数据进行计算处理，采用峰面积归一化法计算各相对分子质量范围内多肽的相对百分比之和。
4、蛋白酶与氨肽酶活性测定
蛋白酶活力测定采用福林酚法，参考GB/T 23527-2009测定，碱性蛋白酶和中性蛋白分别在pH10.0和pH7.0条件下测定。氨肽酶测定以L-亮氨酸-4-硝基苯胺为底物，在测定条件下，单位时间内水解底物生成1μg对硝基苯胺所消耗的酶量定义为一个酶活力单位。
5、蛋白质含量采用凯氏定氮法测定。
肽含量采用GB/T 22492-2008附录B的方法测定。
经检测，本实施例描述的方法得到的虾头活性肽粉有如下指标：
每100g干虾头粉可得到活性肽粉8.63g，所制备活性肽粉的蛋白质含量(以干基计，N×6.25)95.7％，肽含量(以干基计)93.85％，IC50值达0.054mg/mL，高于文献报道的采用酶解法水解虾头制备ACE抑制肽的活性(食品科学,2012,33(11):131-136)。
实施例2
本实施例分别采用本发明所描述的固态发酵法和采用酶解法，对原料蛋白水解和产物的ACE抑制活性的效果进行对比。
固态发酵法同实施例1所述，发酵5天时取样，采用同实施例1的检测方法进行性能测试。
酶解法：20g虾头干粉加入到200mL蒸馏水中充分混合后配制成0.1g/mL的悬浮液，按酶与底物的比例为3000U/g加入蛋白酶，在各酶的最适条件下(碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶)进行酶反应，期间滴加1mol/L HCl或者NaOH维持pH在最适条件，酶解6小时后取样测定。枯草芽孢杆菌发酵蛋白酶液采用以下方法制备：菌株CMCC63501接种到种子液培养基，在37℃、200rpm条件下摇床培养24小时。按2％的接种量接种上述种子液到液体发酵产酶培养基中，37℃、200rpm条件下摇床培养36小时，然后在6000rpm下离心10min，收集上清液即为发酵蛋白酶。液体发酵产酶培养基：葡萄糖15g/L，豆粕30g/L，CaCl2 2g/L，K2HPO42g/L，吐温80 1g/L，NaCl 2g/L，pH 8.0，115℃灭菌15min。发酵所得的酶液与0.2g/mL虾头粉悬浮液等体积混合，在pH7.5，40℃条件下，酶解6小时取样，采用同实施例1的检测方法进行性能测试。
对比结果如图1所示。从图1可以看出，固态发酵法获得了最高的蛋白水解率，达到60.7％，而各种选用不同酶的酶解法所得的蛋白水解率在18～24％之间(与文献(食品科学,2012,33(11):131-136)报道的采用酶解法水解虾头的蛋白水解率相接近)。此外，固态发酵法也获得了更多的分子量小于1KDa的小分子多肽，表明该方法可更有效地利用固态虾头粉原料释放小分子多肽。而现有研究与报道表明，具有良好活性的ACE抑制肽都是分子量小于1KDa的小分子肽。
实施例3
本实施例说明分别采用单一菌种和混合菌种发酵，进行对比。
原料预处理、拌料和灭菌后，分别加入单独使用B.subtilis和B.licheniformis，以及两种菌株按1:0.5、1:1、1:2、1:3不同比例组合接种，按实施例1中描述的发酵条件进行发酵，发酵6天取样，采用同实施例1的检测方法进行性能测试。
对比结果如图2所示。从图2可以看出，采用单一菌种时，蛋白水解度、ACE抑制活性及小于1KDa的小分子多肽含量三项指标均低于混合菌种发酵。从两种菌种不同配比结果可以看出，四种实验比例所获得蛋白水解度和ACE抑制活性未发现显著性差异，但1:1和1:2两种比例所得的小于1KDa的小分子多肽比例更高，对释放小分子多肽更有利。
实施例4
本实施例说明探究发酵过程补料添加糖的影响。
原料预处理、拌料灭菌、种子液准备与接种同实施例1所述，接种后发酵过程中分别采用不添加葡萄糖、方式1(第2天一次性添加32mL 50g/L葡萄糖)、方式2(第3和第5天分两次添加20mL 40g/L葡萄糖)、方式3(第2、3、4、5天分别添加20mL 20g/L葡萄糖)，发酵6天取样，采用同实施例1的检测方法进行性能测试。
对比结果如图3所示。从图3可以看出，发酵过程中补加糖可显著提高蛋白水解度、ACE抑制活性及小于1KDa的小分子多肽含量。三种补加糖的方式中，一次性添加(方式1)的效果最差，三项指标均低于方式2和方式3。采用方式3即从发酵第2天起每天添加少量糖，可以获得更好的水解度和更多的小分子多肽，表明这种方式可使得原料的水解效率更高，产率更好。
实施例5
本实施例说明探究表面活性剂添加对产酶的影响。
发酵培养基中加入不同表面活性剂的含量和组合，其他条件与操作同实施例1所述，分别拌料并灭菌后进行固态发酵，发酵3天后取样测定碱性蛋白酶、中性蛋白酶和氨肽酶活力，结果如表1。
从表1中可以看出，添加表面活性剂可显著提高蛋白酶和氨肽酶的产出，采用两种表面活性剂的组合比单独添加一种表面活性剂对产酶更有利，两种蛋白酶分别提高了40％以上，而氨肽酶提高了56.8％
表1不同表面活性剂添加对菌株产酶的影响
实施例6
本实施例说明在固态发酵罐(卧式转轴式机械搅拌发酵罐30L)体系中，利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC63501和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AS1.269混合菌种固态发酵虾头制备ACE抑制肽。
具体实施步骤如下：
(1)原料处理准备
新鲜虾头(加工虾仁后的副产物)于70℃烘箱中干燥20小时至恒重，干燥后的虾头采用粉碎机破碎后，过80目标准筛，破碎后颗粒的粒径在0.2mm左右。
(2)菌株的活化
菌种接种于斜面培养基于40℃培养18小时，用于菌种活化。斜面培养基包括：葡萄糖6g/L，胰蛋白胨12g/L，氯化钠6g/L，磷酸氢二钾3g/L，琼脂18g/L；调节pH为7.0，125℃灭菌15分钟。
(3)种子液准备
分别将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌斜面菌种接种于种子液培养基，种子液培养基包括：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾3g/L，pH为7.0，125℃灭菌15分钟。在40℃、300rpm条件下摇床培养18小时，在培养后的菌液中加入适量无菌种子液培养基稀释，以调整菌体浓度为5×108CFU/mL。
(4)拌料与灭菌
发酵培养基：葡萄糖8g/L、甘露醇2g/L、淀粉5g/L；酵母浸粉0.5g/L、氯化铵0.5g/L；磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸亚铁0.05g/L、氯化钙0.1g/L；吐温80 0.5g/L、表面活性素(Surfactin)0.02g/L。各组分称量好后溶于去离子水制成培养液，培养液按破碎后虾头粉混合，每100g虾头粉采用80mL培养液混合，混匀后用0.5mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0。30L固态发酵罐装料量35％，于121℃下原位灭菌15min。
(5)接种与发酵
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌种子液按1:1比例混合后，按每100g虾头粉接种20mL混合种子液。接种后发酵罐条件控制为：温度40℃、相对湿度95％、搅拌转速5rpm、通气流量0.2～0.3VVM、罐压0.01～0.03Mpa，从发酵时间36小时开始，每12小时按100g虾头粉加入灭菌后的25g/L葡萄糖溶液10mL，发酵至5天结束。
(6)肽的提取与分离
按每100g发酵料中加入500mL 0.08mol/L盐酸溶液，混合均匀后容器在200rpm搅拌、30℃条件下提取2小时，提取液经300目的滤布过滤后得到初滤液，按初滤液体积的0.5％加入活性碳，45℃吸附60分钟后再次过滤，得到肽提取的上清液。上清液采用5kDa的陶瓷膜进行超滤，保留分子量小于5kDa的组分，再采用1kDa的陶瓷膜进行第二次超滤，保留分子量小于1kDa的组分，合并收集滤液。滤液上样于阳离子交换柱(Dowex 50WX2)，采用去离子水清洗柱以去除非肽类杂质，然后用1mol/L氨水洗脱吸附在柱子上的多肽，收集洗脱液。
(7)干燥制成成品
将经超滤分离得到的肽溶液进行低温真空浓缩、冷冻干燥，得到虾头发酵肽粉。
采用同实施例1的检测方法进行性能测试，本实施例描述的方法得到的虾头肽粉有如下指标：
每100g干虾头粉可得到活性肽粉12.05g，所制备活性肽粉的蛋白质含量(以干基计，N×6.25)92.2％，肽含量(以干基计)89.6％，IC50值达0.089mg/mL。
可以看出，无论是在实施例1的小试，还是实施例6的发酵罐规模的扩大生产中，本发明方法均能获得得率和纯度高，具有良好的抑制活性ACE抑制肽。并且比起传统酶解法，由于不需要预先加入底物产酶，在规模化生产中大大节约了成本。在菌株存在的情况下，虾头为原料，产酶和底物蛋白水解同步发生、互相促进，蛋白水解率得到大幅度提升，获得更多更纯的ACE抑制肽。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
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