具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本发明实施例提供了一种微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。所述微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法的工艺流程如图1所示，包括以下步骤：

S01.将藻泥与无机盐水溶液混合处理，并进行孵育处理，获得第一混合藻泥液；

S02.将步骤S01中的第一混合藻泥液与液态醇混合处理，并进行提取处理，第二混合藻泥液；

S03.将步骤S02中的第二混合藻泥液进行固液分离处理，收集液态醇相；

S04.将步骤S03中的液态醇相中的液态醇除去，获得富含微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸(EPA)的提取物。

这样，本发明实施例微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法先通过无机盐对藻泥进行孵育处理，后采用液态醇进行提取，从而建立无机盐-液态醇体系直接对藻泥进行提取处理，使得最终提取物中岩藻黄素和岩藻黄醇提取效率以及EPA提取效率高，且能够有效回收液态醇溶剂，环境友好，而且提取物安全性高。另外，本发明实施例微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法工艺条件易控，能够有效保证微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取效率稳定，而且效率高。

其中，步骤S01中，藻泥与无机盐水溶液混合处理和孵育处理过程中，无机盐对藻泥中的微藻细胞进行作用，具体的如改变微藻细胞膜中的蛋白质，如使得细胞膜中的蛋白质发生变性发生沉淀，从而改变细胞膜的通透性。这样，微藻所含的活性成分如富含的微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等功能成分能够有效外渗。

发明人研究中发现无机盐水溶液的浓度和pH对孵育处理有影响，实施例中，按照藻泥与硫酸氨的质量比为1:30的比例进行混合处理；其中，无机盐水溶液的质量浓度为20％-50％，进一步为20％-40％，具体如30％。另一实施例中，无机盐水溶液的pH为弱碱性至弱酸性范围，优选pH为3.0-9.0，进一步为5.0-8.0，具体为pH为5.0和7.0。通过调整和优化无机盐水溶液的质量浓度和pH，能够提高无机盐对微藻细胞膜蛋白质发生变性发生沉淀，提高细胞膜的通透性。

实施例中，无机盐包括硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、碳酸盐、铵盐中的至少一种，具体实施例中，无机盐可以是包括硫酸钠、硫酸镁、硫酸氢二钾、磷酸氢二钾、碳酸钾、醋酸钾、醋酸镁、醋酸铵、氯化铵、碳酸铵、硫酸铵中的至少一种。通过对无机盐的选择，能提高无机盐对微藻细胞膜蛋白质的变性和沉淀作用，进一步提高细胞膜的通透性。另外，该些盐还具有与步骤S02中液态醇不溶特性，能够有效在步骤S03中与液态醇相分离。

另外，在步骤S01中上述藻泥与无机盐水溶液混合处理构建的混合物的基础上孵育处理应该是充分的，使得微藻细胞膜中的蛋白质充分发生变性和沉淀，提高细胞膜的通透性，如孵育10-60分钟，具体的如但不仅仅为30分钟。实施例中，在步骤S01中的混合处理和孵育处理过程中伴随有搅拌处理如磁力搅拌的步骤。通过搅拌处理，加速无机盐如硫酸盐对微藻细胞膜中蛋白变性作用和沉淀作用。

通过上述步骤S01中的混合处理和孵育处理后，在第一混合藻泥液含有发生沉淀的蛋白质和从微藻所含的活性成分如微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸成分会通过通透性发生改变的微藻细胞膜外渗透。因此，第一混合藻泥液中含有沉淀的蛋白质、溶解的多糖、发生外渗的微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等成分以及藻泥的混合物。

步骤S01中的藻泥可以是包括硅藻、金藻、针胞藻、普林藻、褐藻中的至少一种藻泥，具体如包括菱形藻、三角褐指藻、小环藻、舟形藻、角毛藻、等边金藻等。该些微藻可以联产高附加值代谢产物岩藻黄素、岩藻黄醇和EPA。

步骤S02中，当将第一混合藻泥液与液态醇混合处理后，在形成的混合物中，无机盐溶液-液态醇-蛋白质中间层构建了三相分离体系。在现有报道的技术中，目前三相分离技术体系是比较经典的用于提取蛋白质的方法，主要用于植物组织、细胞中蛋白质和各种酶的高效提取。虽然目前有将现有的用于提取蛋白质的三相分离技术体系结合破壁工艺以提取微藻油脂，但是实际油脂的提取率难超过90％，而且还常用到有毒有机溶剂。在本发明实施例中，发明人通过对三相分离体系的改进，具体的是在上述步骤S01的含有无机盐-水的体系中，加入步骤S02的液态醇，使得三者构建新的三相分离体系，而且用于微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取，从而有效提高微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取率，而且避免了需要破壁的工艺步骤避免使用有毒有机溶剂，从而同时降低能耗以降低成本和提高提取物的食用的安全性。

发明人研究发现，步骤S02中的第一混合藻泥液与液态醇混合比例和提取处理的温度对目标产物如微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的溶出率有一定的影响。因此，实施例中，第一混合藻泥液与液态醇的是按照体积比为1：(0.2-4)，进一步为2:1-1:3的比例进行所述混合处理，进一步为2:1，1:1或1:2。通过控制和优化液态醇的用量，从而提高本发明实施例三相分离体系对目标产物如微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的溶出率以提高该些目标物的提取率。在实施例中，液态醇包括乙醇、丁醇、丙醇、乙酸乙酯、庚醇中的至少一种，具体实施例中，液态醇包括叔丁醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇、乙醇、乙酸乙酯、庚醇中的至少一种。该些液态醇一方面能够有效溶解微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等目标产物，而且还不溶解无机盐，从而在步骤S02的混合处理过程中使得无机盐-液态醇-蛋白质可以形成三相。

另一实施例中，步骤S02中的提取处理的温度为20-60℃，进一步为35-55℃，具体如45℃。通过对提取处理温度提供一定范围的温度并进行优化，能够提高目标产物如微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸透过微藻细胞膜进入液态醇中，从而提高目标提取物的提取率，而且还能够加速目标提取物提取效率。另外，该提取处理应该是充分的，如在20-60℃，进一步为35-55℃具体的如45℃下，提取处理的时间为0.5-3小时，如2小时，实现对目标提取物的充分提取处理。

由于在步骤S01和S02的构建的无机盐下相-液态醇上相-蛋白质中间层构建了三相分离体系中，目标提取物如微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等以及蛋白质、多糖在水中和液态醇中溶解性不同，从而使得蛋白质沉淀在被提取处理后的藻泥中，而如微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等目标提取物会溶解于液态醇中。因此，通过步骤S03中的固液分离处理分离，获得含有如微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等目标提取物的液态醇相、含有提取处理后的藻泥和蛋白质沉淀的滤渣以及溶解多糖的无机盐水溶液相。

其中，对于含有藻泥和蛋白质沉淀的滤渣，经过一次的提取处理可能会使得微藻所含的微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等目标提取物提取的不彻底。因此，在进一步实施例中，还包括如下步骤：

将第二混合藻泥液进行固液分离处理获得的含藻泥滤渣(也即是含有藻泥和蛋白质沉淀的滤渣)与另一份无机盐水溶液进行混合处理和孵育处理后与另一份液态醇进行混合处理和提取处理。该步骤至少进行一次，也即是对滤渣至少进行一次的无机盐水溶液进行混合处理和孵育处理再采用液态醇进行提取处理的步骤。使得滤渣中残留的微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸等目标提取物提取彻底。

步骤S04中，对于固液分离处理处理获得的液态醇相，除去液态醇相中所含的液态醇溶剂和水，从而获得富含微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸(EPA)的提取物。其中，除去液态醇溶剂和水的方法可以是干燥处理如旋蒸干燥或者冷冻干燥等方式。当在步骤S03中对滤渣进行至少一次的重复步骤S01和步骤S02处理后时，将所有的液态醇相进行合并，然后进行步骤S04处理。

因此，上文各实施例微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法先通过建立无机盐-液态醇体系直接对藻泥进行提取处理，使得最终提取物中岩藻黄素和岩藻黄醇提取效率高达到70％，EPA提取效率达到95％，有效避免了现有需要对微藻进行破壁处理等高能耗工序，而且所用溶剂毒性低，且能够有效回收液态醇溶剂，环境友好，而且提取物安全性高。另外，该微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法工艺条件易控，能够有效保证微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取效率稳定，而且效率高。

以下通过多个具体实施例来举例说明本发明实施例微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。

实施例1-实施例4

本实施例提供四种微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法包括如下步骤：

S1：以料液比1:30(m/v,g/mL)在湿藻泥中加入20％(实施例1)、30％(实施例2)、40％(实施例3)、50％(实施例4)硫酸铵溶液，在1000rpm下磁力搅拌，孵育30分钟；

S2：在上述混合藻泥液中按照湿藻泥和叔丁醇体积比为1:1的比例加入叔丁醇，1000rpm继续搅拌1小时，对细胞内富含EPA的油脂和岩藻黄醇、岩藻黄素等进行充分提取；

S3：离心收集叔丁醇相，吸出富含碳水化合物的硫酸铵溶液，加入新的硫酸铵溶液，重复1和2步骤3次，进行再次提取；

S4：合并叔丁醇相，45℃旋蒸干，溶于氯仿中，进行EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素的定量测定分析。

通过对实施例1至实施例4的步骤S4中对EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素含量测定分析结果得知，实施例3中的30％硫酸铵浓度最优，EPA提取率达到73％，岩藻黄醇和岩藻黄素的提取率达到52％。

实施例5-实施例8

本实施例提供四种微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法包括如下步骤：

S1：以料液比1:30(m/v,g/mL)在湿藻泥中加入30％硫酸铵溶液，并在1000rpm下磁力搅拌，孵育30分钟；

S2：在上述混合藻泥液中按照湿藻泥和叔丁醇体积比为1:1的比例加入叔丁醇，1000rpm继续搅拌1小时，对细胞内富含EPA的油脂和岩藻黄醇、岩藻黄素等进行充分提取；

S3：离心收集叔丁醇相，吸出富含碳水化合物的硫酸铵溶液，加入新的硫酸铵溶液，重复1和2步骤1次(实施例5)、2次(实施例6)、3次(实施例7)和4次(实施例8)，进行再次提取；

S4：合并叔丁醇相，45℃旋蒸干，溶于氯仿中，进行EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素的定量测定分析。

通过对实施例5至实施例8的步骤S4中对EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素含量测定分析结果得知，提取3次，EPA提取率最高，达到73％，提取4次，岩藻黄醇和岩藻黄素提取率最高，达到56％，综合EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素提取率，以及经济性，选择提取3次为下一步反应条件，此条件下，岩藻黄醇和岩藻黄素提取率达到52％。

实施例9-实施例12

本实施例提供四种微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法包括如下步骤：

S1：以料液比1:30(m/v,g/mL)在湿藻泥中加入30％硫酸铵溶液，且30％硫酸铵溶液的pH为5.0(实施例9)、6.0(实施例10)、7.0(实施例11)和8.0(实施例12)，并在1000rpm下磁力搅拌，孵育30分钟；

S2：在上述混合藻泥液中按照湿藻泥和叔丁醇体积比为1:1的比例加入叔丁醇，1000rpm继续搅拌1小时，对细胞内富含EPA的油脂和岩藻黄醇、岩藻黄素等进行充分提取；

S3：离心收集叔丁醇相，吸出富含碳水化合物的硫酸铵溶液，加入新的硫酸铵溶液，重复1和2步骤3次，进行再次提取；

S4：合并叔丁醇相，45℃旋蒸干，溶于氯仿中，进行EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素的定量测定分析。

通过对实施例5至实施例8的步骤S4中对EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素含量测定分析结果得知，pH为5.0和7.0对EPA的提取率最高，且没有显著差异，而pH5.0对岩藻黄醇和岩藻黄素的提取率显著高于其他几个条件，故选择pH5.0为下一步反应条件，此时，EPA的提取率达到72％，岩藻黄醇和岩藻黄素提取率达到53％。

实施例13-实施例16

本实施例提供四种微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法包括如下步骤：

S1：以料液比1:30(m/v,g/mL)在湿藻泥中加入30％硫酸铵溶液，且30％硫酸铵溶液的pH为5.0，并在1000rpm下磁力搅拌，孵育30分钟；

S2：在上述混合藻泥液中加入体积比2:1(实施例13)、1:1(实施例14)、1:2(实施例15)、1:3(实施例16)(v/v,mL/mL)比例的叔丁醇，1000rpm继续搅拌1小时，对细胞内富含EPA的油脂和岩藻黄醇、岩藻黄素等进行充分提取；

S3：离心收集叔丁醇相，吸出富含碳水化合物的硫酸铵溶液，加入新的硫酸铵溶液，重复1和2步骤3次，进行再次提取；

S4：合并叔丁醇相，45℃旋蒸干，溶于氯仿中，进行EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素的定量测定分析。

通过对实施例13至实施例16的步骤S4中对EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素含量测定分析结果得知，混合藻泥液与叔丁醇的体积比为2:1，1:1和1:2对目标化合物的提取率最高，且无显著差异，但是从经济角度考虑，最终选择2:1作为后续实验条件，此条件下，EPA的提取率达到72％，岩藻黄醇和岩藻黄素的提取率达到52％。

实施例17-实施例20

本实施例提供四种微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法包括如下步骤：

S1：以料液比1:30(m/v,g/mL)在湿藻泥中加入30％硫酸铵溶液，且30％硫酸铵溶液的pH为5.0，并在1000rpm下磁力搅拌，孵育30分钟；

S2：在上述混合藻泥液中加入体积2:1比例的叔丁醇，1000rpm继续搅拌1小时，混合溶液的温度控制为25℃(实施例17)、35℃(实施例18)、45℃(实施例19)和55℃(实施例20)对细胞内富含EPA的油脂和岩藻黄醇、岩藻黄素等进行充分提取；

S3：离心收集叔丁醇相，吸出富含碳水化合物的硫酸铵溶液，加入新的硫酸铵溶液，重复1和2步骤3次，进行再次提取；

S4：合并叔丁醇相，45℃旋蒸干，溶于氯仿中，进行EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素的定量测定分析。

通过对实施例13至实施例16的步骤S4中对EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素含量测定分析结果得知，45℃对EPA提取率最高，达到82％，25℃对岩藻黄醇和岩藻黄素的提取率最高，达到53％，略高于45℃，此时岩藻黄醇和岩藻黄素的提取率达到52％；综合考虑，选择45℃作为后续反应条件。

实施例21-实施例23

本实施例提供四种微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法。微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法包括如下步骤：

S1：以料液比1:30(m/v,g/mL)在湿藻泥中加入30％硫酸铵溶液，且30％硫酸铵溶液的pH为5.0，并在1000rpm下磁力搅拌，孵育30分钟；

S2：在上述混合藻泥液中加入2:1比例的叔丁醇，1000rpm继续搅拌0.5h(实施例21)、1.0h(实施例22)和2.0h(实施例23)时间，混合溶液的温度控制为45℃对细胞内富含EPA的油脂和岩藻黄醇、岩藻黄素等进行充分提取；

S3：离心收集叔丁醇相，吸出富含碳水化合物的硫酸铵溶液，加入新的硫酸铵溶液，重复1和2步骤3次，进行再次提取；

S4：合并叔丁醇相，45℃旋蒸干，溶于氯仿中，进行EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素的定量测定分析。

通过对实施例13至实施例16的步骤S4中对EPA、岩藻黄醇和岩藻黄素含量测定分析结果得知，提取时长达到2h时，EPA的提取率达到95％，岩藻黄醇和岩藻黄素的提取率达到70％。

由上述实施例1至实施例23对提取物的测试结果可知，本发明实施例微藻岩藻黄素和岩藻黄醇以及二十碳五烯酸的提取方法先通过建立无机盐-液态醇体系直接对藻泥进行提取处理，使得最终提取物中岩藻黄素和岩藻黄醇提取效率高达到70％，EPA提取效率达到95％，目标提取物提取率高。而且过程中物毒性有机溶剂，提取物的安全性高，提高了提取物食用的安全性，同能够保证提取效率稳定，而且效率高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。