一种可湿性菌粉剂及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种可湿性菌粉剂及其制备方法与应用 (Wettable bacterium powder and preparation method and application thereof ) 是由 周志成 刘天波 尹华群 孟德龙 滕凯 张明发 曹明峰 王振华 周向平 蔡海林 肖 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微生物菌剂技术领域,具体涉及一种可湿性菌粉剂及其制备方法与应用。所述可湿性菌粉剂各原料的质量百分含量为：菌剂母粉75％-90％,分散剂5-10％,润湿剂5-10％,稳定剂1-4％,保护剂0.1-1.0％；所述菌剂母粉由浓缩菌液和载体经混匀、干燥获得。通过载体、分散剂、润湿剂、稳定剂和保护剂的筛选以及各物料配比的设定,获得了润湿效果良好,悬浮率高,且活菌数高的可湿性菌粉剂,能够广泛用于农药可湿性菌粉剂。(The invention relates to the technical field of microbial agents, and particularly relates to wettable bacteria powder and a preparation method and application thereof. The wettable bacteria powder comprises the following raw materials in percentage by mass: 75-90% of microbial inoculum mother powder, 5-10% of dispersing agent, 5-10% of wetting agent, 1-4% of stabilizing agent and 0.1-1.0% of protective agent; the microbial inoculum mother powder is obtained by uniformly mixing and drying concentrated bacterial liquid and a carrier. Through the screening of the carrier, the dispersing agent, the wetting agent, the stabilizing agent and the protective agent and the setting of the mixture ratio of the materials, the wettable bacteria powder with good wetting effect, high suspension rate and high viable count is obtained, and the wettable bacteria powder can be widely used for pesticide wettable bacteria powder.)
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种可湿性菌粉剂及其制备方法与应用。
背景技术
微生物菌剂是从自然中分离到的有益微生物，筛选鉴定后，经发酵、混合、干燥等工艺加工成的活菌制剂，在现有技术中有着广泛的应用。
烟草赤星病和野火病为烟叶成熟其发生的主要病害，而二者造成的原因为不同的微生物引起的，防治药剂区别较大，而现有技术中主要通过菌核净、多抗霉素水剂等用于防治赤星病，对于野火病主要采用农用链霉素，主要采用抗生素进行防治，从而使得耐药性增强；随着微生物菌剂在农药中广泛应用，可采用微生物菌剂对烟叶的烟草赤星病和野火病进行治疗，传统技术中，以粉剂为主，采用粉剂喷粉法施药，但是其防治靶标药效差，单位面积上主剂的用药量大，回收率低、漂移污染严重；近年来，可湿性粉剂的研究成为了生物菌剂加工技术发展的一个新趋势，其在加工过程中不需要邮寄溶剂，且具有耐雨水冲刷和风吹，包装、贮藏、运输也方便，防治效果相较于粉剂要好，残效时间长。
但是现有技术中可湿性菌粉剂，主要通过助剂的加入实现其润湿等效果，但是其润湿效果较差，且菌粉剂中的活菌数大大降低，使得防治效果大大降低。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明采用细菌筛选方法获得复配高效菌群，将菌群进行扩增培养和发酵后，经离心压滤获得浓缩菌液后，加入特定的载体、分散剂、润湿剂、稳定剂和保护剂，经干燥后获得可湿菌粉剂。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种可湿性菌粉剂，所述可湿性菌粉剂各原料的质量百分含量为：
菌剂母粉75％-90％，分散剂5-10％，润湿剂5-10％，稳定剂1-4％，保护剂0.1-1.0％；
所述菌剂母粉由浓缩菌液和载体经混匀、干燥获得；
所述分散剂为三聚磷酸钠、PEG-8000、木质素磺酸钠中的一种或多种；
所述润湿剂为十二烷基磺酸钠、硬脂酸盐中的一种或两种；
所述稳定剂为磷酸氢二钾或磷酸二氢钾；
所述保护剂为羧甲基纤维素、维生素C、十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
进一步的，所述可湿粉剂中活菌数为3-5*1010cfu/ml。
进一步的，所述浓缩菌液和载体的质量比为1:8-9.5。
进一步的，所述载体为白炭黑、硅藻土中的一种或两种。
基于同一发明构思的，本发明还提供了一种可湿性菌粉剂的制备方法，具体包括：
S1:将菌种经斜面培养后接种至发酵液中，发酵后进行离心去除上清液，经压滤获得浓缩菌液；
S2:将所述浓缩菌液和载体搅拌均匀，并进行喷雾干燥获得菌剂母粉；
S3:将所述菌剂母粉与分散剂、润湿剂、稳定剂和保护剂搅拌均匀并干燥获得可湿性菌粉剂。
进一步的，所述压滤的工艺参数为：过滤压力为0.1-0.5MPa，过滤时间为12-35min，过滤后滤饼顶水量为浓缩菌液总体积的10-20％。
进一步的，所述步骤S2和步骤S3中的干燥过程的温度为55-65℃。
基于同一发明构思的，上述可湿菌粉剂或上述所述方法制备获得可湿性菌粉剂在农药中的应用。
进一步的，所述所述浓缩菌液中的菌群为复配菌剂，具体包括：芽孢杆菌属、乳杆菌属、勒克氏菌属，用于对抗烟草赤星病和野火病。
有益效果：
(1)本发明通过将菌剂进行扩增培养和发酵后，并采用离心、压滤的方法对菌液进行浓缩，获得高活菌量的菌液，并通过载体、分散剂、润湿剂、稳定剂和保护剂的筛选以及各物料配比的设定，获得了润湿效果良好，悬浮率高，且活菌数高的可湿性菌粉剂，能够广泛用于农药可湿性菌粉剂。
(2)本发明通过采用复配菌剂，如芽孢杆菌属、乳杆菌属、勒克氏菌属进行复配，并采用本发明可湿粉剂的制备方法，制备获得了用于防治烟草赤星病和野火病的可湿菌粉剂，其对烟草赤星病和野火病的靶标菌具有良好的抑制作用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同载体的菌剂母粉的镜检图；
图2为本发明实施例提供的不同载体的菌剂母粉抑菌圈实物图；
图3为本发明实施例提供的加入不同分散剂的菌剂母粉的镜检图；
图4为本发明实施例提供的加入不同分散剂的菌剂母粉的抑菌圈实物图；
图5为本发明实施例提供的加入不同润湿剂的菌剂母粉的镜检图；
图6为本发明实施例提供的加入不同润湿剂的菌剂母粉的抑菌圈实物图；
图7为本发明实施例提供的加入不同稳定剂的菌剂母粉的镜检图；
图8为本发明实施例提供的加入不同稳定剂的菌剂母粉的抑菌圈实物图；
图9为本发明实施例提供的加入不同保护剂的菌剂母粉的镜检图；
图10为本发明实施例提供的加入不同保护剂的菌剂母粉的抑菌圈实物图；
图11为本发明实施例提供的可湿菌粉剂的镜检图；
图12为本发明实施例提供的稀释不同倍数的可湿菌粉剂的镜检图；
图13为本发明实施例提供的可湿菌粉剂的抑菌圈实物图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。本发明中微生物菌群是从拮抗草赤星病和野火病的微生物菌群进行筛选，获得明显拮抗作用的菌株，其复配菌群包括：芽孢杆菌属69.7％、乳杆菌属23.9％、勒克氏菌属6.45％。
实施例1
浓缩发酵液的制备：
将复配细菌的菌种通过多次斜面培养获得发酵种子，并将其接种至发酵罐中，获得发酵菌液，其中培养温度为37℃，斜面培养基和发酵液为常规的细菌培养组分配置而成；将发酵菌液先进行离心处理，去除上清液，并对沉积下来的混合物进行压滤，采用板框压滤进行过滤，压力分别为0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa、0.4MPa、0.5MPa、0.6MPa，记录各组完全过滤所需的时间，为了使滤饼中残留的菌体分离出来，在过滤完成后，向板框中加入水，称为顶水量，其中顶水量为浓缩菌液总体积的百分含量为0％、5％、10％、15％、20％，检测滤液中菌群的含量，获得收率，其结果如表1和表2所示，其中表1为不同压力条件下压滤时间的对比，表2为过滤压滤为0.4MPa，顶水量不同时菌群的含量和收率。
表1过滤压力对过滤速度的影响
表2滤饼顶水量对收率的影响
由表1可知，过滤过程中过滤压力越大，所需过滤时间越少，即过滤速度越快。生产中隔膜板框式过滤机最大过滤压力为0.6MPa，压力过高，生产过程较危险且能耗大，设备损耗较大。从生产成本和安全性考虑，选择过滤压力为0.1-0.5MPa，压滤时间12-35min。由图2可知，顶水量越大是，过滤后收率越高，但是，滤液体积越大，后续干燥处理过程工作量更大，因此可选择顶水量为10-20％，收率在96％左右，且后续处理过程较为简单。
实施例2
菌剂母粉的制备：
将实施例1获得的浓缩菌液和载体材料按照质量比为1：9的比例进行混合，在60℃条件下进行喷雾干燥获得菌剂母粉，其中载体材料选择为白炭黑(500目)、滑石粉(800目)、高岭土(1250目)和硅藻土(800目)，测定不同载体获得的菌剂母粉的可湿特性以及对烟草赤星病和野火病靶菌的抑制效果：将靶标菌悬浮液加入熔融态培养基制成混菌平板。凝固后加入拮抗菌发酵滤液0.2ml，30℃培养72小时后十字交叉法测量抑菌圈直径。表3为菌剂母粉的可湿特性结果，图1、2分别为不同载体的菌剂母粉的镜检结果和抑菌圈。
表3不同载体菌剂母粉的可湿性结果
由表3可知，白炭黑和硅藻土润湿时间短，悬浮率高，且活菌数高，可用于可湿菌粉剂的载体，根据图1、2可知，采用白炭黑和硅藻土作为载体的的菌剂母粉细菌密度高，且抑菌圈直径较大，二者具有较高的抑菌效果。
实施例3
分散剂选择：
将实施例2获得以白炭黑为载体的菌剂母粉与分散剂混合干燥，其中分散剂的加入量为10％，其中分散剂为三聚磷酸钠，木质素磺酸钠，羧甲基纤维素钠，PEG800，测定加入分散剂后的菌剂母粉的可湿特性和对烟草赤星病和野火病靶菌的抑制效果(具体方法与实施例2相同)，表4为可湿性菌粉剂分散剂的筛选，图3、4分别为加入不同分散剂的镜检结果和抑菌圈。
表4可湿性粉剂分散剂的筛选
由表4可知，三聚磷酸钠和PEG-800润湿时间短，木质素氨磺酸钠和三局磷酸钠的悬浮率较高，木质素磺酸钠、三聚磷酸钠活菌数高，可用于可湿菌粉剂的载体，根据图3可知，用血球计数板测定混合制剂已稀释10倍的活菌数的含量，其中木质素磺酸钠和三聚磷酸钠中的发酵液菌浓度最高，其次是羧甲基纤维素钠和三聚磷酸钠，根据图4可知，三聚磷酸钠和木质素磺酸钠的抑菌圈直径大，具有较高的抑菌效果，因此，三聚磷酸钠、PEG-8000和木质素磺酸钠可以作为可湿菌粉剂的分散剂。
实施例4
润湿剂选择：
将实施例2获得以白炭黑为载体的菌剂母粉与润湿剂混合干燥，其中润湿剂加入量为10％，润湿剂具体为硬脂酸盐、十二烷基苯磺酸钠、吐温80，测定加入润湿剂后的菌剂母粉的可湿特性和对烟草赤星病和野火病靶菌的抑制效果(具体方法与实施例2相同)，表5为可湿性菌粉剂润湿剂的筛选，图5、6分别为加入不同润湿剂的镜检结果和抑菌圈。
表5可湿性菌粉剂润湿剂的筛选
由表5和图5可知，十二烷基苯磺酸钠和硬脂酸盐润湿时间短，吐温-80的悬浮率较高，硬脂酸的活菌数高，根据图6可知，三者润湿剂的抑菌圈直径较为接近，综合上述润湿剂的可湿性结果和抑菌圈的直径大小，十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸和吐温-80均可以作为可湿菌粉剂的润湿剂，优选吐温-80。
实施例5
稳定剂选择
将稳定剂加入至实施例1获得的浓缩菌液中，混合均匀后梯度稀释涂布在NA平板上，一部分置于254nm紫外灯40cm处照射1h，另一部分直接30℃培养，对照不加保护剂，其中稳定剂加入量为2％，稳定剂具体为CaCO3,K2HPO4,KH2PO4，测定培养后活菌数和对烟草赤星病和野火病靶菌的抑制效果(具体方法与实施例2相同)，表6为可湿性菌粉剂稳定剂的筛选，图7、8分别为加入不同稳定剂的镜检结果和抑菌圈。
表6可湿性稳定剂的筛选
由表7和图8可知，采用稳定剂K2HPO4,KH2PO4时活菌数高，根据图8可知，K2HPO4,KH2PO4的抑菌圈直径较CaCO3大，综合上述稳定剂的活菌数结果和抑菌圈的直径大小，可湿性菌粉剂的稳定剂优选为K2HPO4,KH2PO4。
实施例6
保护剂选择
将保护剂加入至实施例1获得的浓缩菌液中，混合均匀后梯度稀释涂布在NA平板上，一部分置于254nm紫外灯40cm处照射1h，另一部分直接30℃培养，对照不加保护剂，其中保护剂加入量为2％，保护剂具体为维生素C、羧甲基纤维素，十二烷基硫酸钠，测定培养后活菌数和对烟草赤星病和野火病靶菌的抑制效果(具体方法与实施例2相同)，表7为可湿性菌粉剂稳定剂的筛选，图9、10分别为加入不同保护剂的镜检结果和抑菌圈。
表7可湿性粉剂保护剂的筛选
由表7、图9、10可知，采用保护剂维生素C和羧甲基纤维素时活菌数高，维生素C和羧甲基纤维素的抑菌圈直径较十二烷基硫酸钠大，综合上述保护剂的活菌数结果和抑菌圈的直径大小，可湿性菌粉剂的保护剂优选为维生素C和羧甲基纤维素。
实施例7
将实施例1获得的浓缩菌液与载体白炭黑按照质量比为1:9的比例混合搅拌均匀后，并在60℃条件下喷雾干燥获得菌剂母粉；选取分散剂三聚磷酸钠(10％)、润湿剂吐温-80(10％)，稳定剂K2HPO4(2％)，保护剂羧甲基纤维素钠(0.1％)与所述菌剂母粉(77.9％)搅拌混合均匀并于60℃条件下干燥处理获得可湿性菌粉剂。
将获得的可湿菌粉剂进行镜检，并将其符合后稀释10倍、100倍和10000倍进行镜检，观测细菌的浓度，详见图11、12，另采用平板对峙法测定可湿性菌粉剂对病菌的拮抗效果：在室内进行，对于野火病和赤星病，将纯培养的病原菌置于LB和PDA液体培养基中，28℃振荡培养12小时，并配制成稀释5000倍的菌悬液备用；将分离的待测拮抗微生物菌群置于1/2LB液体培养基中，28℃振荡培养5d。将稀释过的病原菌菌悬液与1/2固体培养基以3：2000的比例混匀后倒平板。然后用半径5mm的无菌打孔器呈十字形打孔，在孔内加入100μl待测菌液，并在培养皿底部对应标记供试菌群编号和接种时间。同时取一平皿，只加入烟草病原菌作为对照。28℃下恒温培养，待对照长满整个培养皿时，观察实验组有无抑菌圈形成并测量抑菌圈的大小；其结果如图13所示。
根据图11、12，其中图12中(a)、(b)、(c)、分别为可湿性粉剂复活后发酵原液稀释10倍、稀释100倍、稀释10000倍的镜检结果，可知实施例7获得可湿性菌粉剂活菌数浓度较高，根据图13，其中1-4为平行4个样品，可知可湿性粉剂样品长势比较好，整个平板呈透明状态，说明抑菌效果较好，可以作为防治烟草赤星病和野火病的可湿性菌粉剂农药。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。