一种生物传感器及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种生物传感器及其制备方法和应用 (Biosensor and preparation method and application thereof ) 是由 周明 付卫雷 于 2021-05-28 设计创作，主要内容包括：本申请涉及一种生物传感器及其制备方法和应用。所述生物传感器包括同时表达血红素氧化酶-1、藻胆体核蛋白亚基ApcF2和血红素跨膜转运蛋白的工程化细胞。本申请的生物传感器能够同时表达血红素氧化酶-1、藻胆体核蛋白亚基ApcF2和血红素跨膜转运蛋白,并低表达血红素,能够有效响应胞外血红素并产生荧光,且自身血红素背景荧光低,可有效进行血红素和/或血液检测。(The application relates to a biosensor and a preparation method and application thereof. The biosensor comprises an engineered cell which simultaneously expresses heme oxygenase-1, phycobilisome nucleoprotein subunit ApcF2 and heme transmembrane transporter. The biosensor can simultaneously express heme oxidase-1, phycobilisome nucleoprotein subunit ApcF2 and heme transmembrane transport protein, can express heme at low level, can effectively respond to extracellular heme and generate fluorescence, has low heme background fluorescence, and can effectively detect heme and/or blood.)
技术领域
本申请属于基因工程
技术领域
，涉及一种生物传感器及其制备方法和应用，尤其涉及一种对血红素敏感的生物传感器及其制备方法和应用。背景技术
人体内的微生物影响着人类的健康，同时也可被用于检测或治疗某些疾病。近年来，人工改造的微生物在疾病的诊治过程中得到了广泛的应用。
合成生物学是一种高效的人工改造微生物的方法，主要使用基本的DNA和RNA元件来构建能够响应某些小分子的基因回路(genecircles)，能输出可定量测定的信号，如荧光信号，从而赋予微生物工程菌新的功能，将相关肠胃道微生物构建成分子传感器(即相关工程菌)，然后通过口服这些分子传感器的方式，使得相关微生物工程菌能够定殖在宿主体内，当宿主发病时，这些分子传感器能够响应此疾病并将其转化为输出信号，从而实现检测疾病。
如有研究报道利用小鼠体内的一种大肠杆菌(NGF-1)，在菌株内构建了能够响应连四硫酸盐的基因回路，从而该大肠杆菌分子传感器能通过检测在肠道炎症期间形成的连四硫酸盐来监测肠道炎症，该分子传感器工程菌能够在6个多月的时间内对小鼠肠道内的炎症情况进行监测。
血红素(Heme)和珠蛋白结合组成血红蛋白，而血红蛋白是红细胞中的重要成分，因此，血红素可作为血液检测的标志物。在大肠杆菌中，血红素合成始于5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)，首先，5-ALA前体依次经HemB、HemC和HemD三步酶催化反应，并通过中间体：卟胆原(porphobilinogen，PBG)和尿卟啉原前体(pre-uroporphyrinogen)，生成第一个环四吡咯尿卟啉原III(Uroporphyrinogen III，UROGEN)，然后依次在HemE、HemF(或者HemN)、HemG和HemH酶连续催化反应下，尿卟啉原III通过中间体：粪卟啉原III(coproporphyrinogenIII，COPROGEN)、原卟啉原IX(protoporphyrinogen IX，PROTOGEN)和原卟啉IX(protoporphyrin IX，PROTO)，转化为血红素，其中，氧化产生原卟啉原IX过程中，粪卟啉原III既可以被氧依赖性的氧化酶(HemF)催化，也可以被非氧依赖性的氧化酶(HemN)催化。
有研究报道联合人工设计的大肠杆菌Nissle 1917菌株以及胶囊内镜，开发了一种能够检测肠道出血的方法，该方法利用血红素作为输入信号，其能够诱导下游荧光素酶基因表达并通过分解相关荧光素产生光信号，通过一个小型的电子回路将光信号转变为电信号，以无线传输方式将电信号传递到电脑或手机上，因此，将此工程菌与小型电子回路封装在小胶囊中，病人通过口服胶囊后，就可以检测肠道内是否出血，然而，由于系统多样性，以及报告基因的异源表达，又或者启动子和转录因子因转移到异源系统，此类模式的生物传感器可能在特异性方面存在问题(参见：Mimee M,Nadeau P,Hayward A,et al.Aningestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health[J].Science,2018,360(6391):915.)。
综上所述，提供一种高效、高特异性的血液检测传感器，对于血液检测领域具有重要意义。
发明内容
本申请提供了一种生物传感器及其制备方法和应用，所述生物传感器在血红素存在时，经过特定波长的光源激发后，能够发出远红光FR或者近红外光NIR，且具备高特异性和灵敏度，从而能够实现检测血红素以及血液。
第一方面，本申请提供一种生物传感器，所述生物传感器包括同时表达血红素氧化酶-1、藻胆体核蛋白亚基ApcF2和血红素跨膜转运蛋白的工程化细胞。
本申请的生物传感器中，所述血红素跨膜转运蛋白能够将血红素转移至细胞内，所述血红素氧化酶-1(Ho1)将血红素氧化成胆绿素(biliverdin，BV)，所述藻胆体核蛋白亚基ApcF2能够基于酶促反应，自催化共价结合胆绿素，结合后，经过特定波长的光源激发，可发出远红光FR或者近红外光NIR，从而实现了检测血红素。
优选地，所述工程化细胞缺失血红素合成酶基因。
优选地，所述血红素合成酶基因包括hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH和hemN。
本申请中，将工程化细胞中的血红素合成酶基因敲除，弱化工程化细胞自身合成血红素，从而降低工程化细胞内血红素的背景干扰。
优选地，所述藻胆体核蛋白亚基ApcF2为一组来源于藻种PCC7203的能发射远红光(约670nm)和近红外光(约710nm)的荧光蛋白，包括野生型蛋白ApcF2(如SEQ ID NO:1)及其突变后系列蛋白BDFP1.1、BDFP1.2、BDFP1.3、BDFP1.4、BDFP1.5、BDFP1.6、BDFP1.7、BDFP1.8和BDFP1.9，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2-10所示。
SEQ ID NO:1：
MQDKLTSVAKNCDLTGSSLNREVVETLKEFLADGEKRVQVAGVIGSNAAEIVKTAVSLLFQEYPELVSPGGNAYTTRRYNMYVRDMNYFLRYCSYAIVAGDASVLDERLLAGLRDTFNSLGIPLGPTARSIQLMKNIVKEKLVTAGMTNITFVDEPFDYVVREISETEI。
SEQ ID NO:2：
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SEQ ID NO:3：
MANREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDERLLAGFRDTFNSLGIPLCPTARSIQLMKKIVKEKLATAGMTNIAFVDEPFDYIAREISETEI。
SEQ ID NO:4：
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SEQ ID NO:5：
ADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGDASVLDGRLLAGLRDTFNSLGIPLGPTARGIQLMKKIVKEKLVTAGMTNITFVDEPFDYIVRGISETEI。
SEQ ID NO:6：
ADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDERMLAGLRDTFNSLGIPLGPTARSIQLMKKIVKEKLVTAGMTNITFVDEPFDYIARVISETEI。
SEQ ID NO:7：
MANREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDGRMLAGFRDTFNSLGIPLCPAARGIQLMKKIVKEKLATAGMTNIAFVDEPFDYIARVISETEI。
SEQ ID NO:8：
MANREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNMCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDGRMLAGLRDTFNSLGIPLGPTARGIQLMKKIVKEKLATAGMTNIAFVDEPFDYIARVISETEI。
SEQ ID NO:9：
MANREVVETLKELLADGEKRVQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNKCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDGRMLAGLRDTFNSLGIPLGPVARGIQLMKKIVKEKLATAGMTNIAFVDEPFDYIARVISETEI。
SEQ ID NO:10：
MANREVRETQKEQQADGEKRRQVAGVIGTNAAEVVKTAVSLLFQEYPELVSPGGCAYTTRRYNKCVRDMNYFLRMCSYAIVAGGASVLDGRMLAGLRDTFNSLGIPLGPVARGIQLMKKIVKEKLATAGMTNIAFVDEPFDYIARVISETEI。
根据本申请，BDFP1.1、BDFP1.2、BDFP1.3、BDFP1.4、BDFP1.5、BDFP1.6、BDFP1.7、BDFP1.8或BDFP1.9中的任意一种或至少两种的融合蛋白均能在本申请的生物传感器中达到相近的效果。
优选地，所述血红素跨膜转运蛋白包括跨膜转运蛋白ChuA。
优选地，所述工程化细胞包括工程化大肠杆菌。
优选地，所述工程化细胞中含有血红素氧化酶-1的编码基因、藻胆体核蛋白亚基ApcF2的编码基因和血红素跨膜转运蛋白的编码基因。
优选地，所述血红素氧化酶-1包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
优选地，所述血红素跨膜转运蛋白的编码基因包括SEQ ID NO:12所示的核酸序列。
SEQ ID NO:11：
MSSNLANKLRVGTKKAHTMAENVGFVKCFLKGVVEKSSYRKLVANFYYVYSAMEEEMEKHSQHPIVSKINFSQLNRKQTLEQDLSYYYGANWREQIQLSPAGEAYVQRIREISATEPELLIAHSYTRYLGDLSGGQILKNIAVTAMNLNDGQGTAFYEFADISDEKAFKAKYRQTLDELAIDEATGDRIVDEANAAFGMNMKMFQELEGNLIKAIGMMLFNTLTRKRTRGATELATAE。
SEQ ID NO:12：
atgagccgtcctcagtttaccagcctgcgtctgagcctgctggcgttagcagttagcgcgaccctgcctacctttgcctttgcgacggaaaccatgaccgttaccgcaaccgggaatgcccgcagttcatttgaggcaccgatgatggttagcgttattgataccagtgcaccggaaaatcagaccgccaccagtgccaccgacctgttacgtcatgttccgggtattacactggatggtaccggtcgcacaaatggtcaggatgttaatatgcgtgggtatgatcatagaggggtgttagttctggttgatggtgttagacaaggtactgataccggtcatctgaacggtacgtttctggatcctgcactgattaaaagagttgaaattgtacgtggtccgagcgcattactgtatggtagtggtgctctgggtggggttatttcctatgatacagttgatgcaaaagacctgctgcaggaaggtcagagcagcggttttagagtttttggtacaggtggaaccggtgatcatagtttaggtctgggtgcgagtgcatttggtcgtaccgaaaatctggatggtattgttgcctggagcagtcgtgatcgtggtgatctgcggcagagtaatggggagacagcaccgaatgatgagagtattaataatatgctggccaaaggtacgtggcagattgatagcgcacagagtctgagcgggttagttagatattataacaacgatgcacgtgaaccgaaaaatccgcagaccgttggtgcatccgagagctctaatccgatggttgatcgcagcaccattcagcgtgatgcacagttaagctataagctggccccacaaggtaatgattggttaaacgcagatgcaaaaatttattggtccgaagttcgtatcaatgcgcagaataccggaagcagcggtgaatatcgtgaacagattaccaaaggtgcacgtttagaaaaccgcagcacattattcgcggatagctttgcaagccatctgctgacctatggcggtgaatactatagacaggaacagcatccgggtggggcaacaacaggttttccgcaggcaaaaatcgattttagctctggttggctgcaggatgaaatcacactgcgggacctgccgattacccttctgggtggtaccagatatgatagttatagaggcagcagcgatggttacaaagatgttgatgcagataaatggagtagcagagcaggaatgaccattaatccgaccaattggttaatgctgtttgggagctatgcacaggcattccgggcacctacaatgggggaaatgtataatgatagtaaacatttcagtatcgggagattttacaccaactactgggttccgaatccgaatttacgtccggaaaccaatgaaacccaagaatatggtttcggcctgcgttttgatgacctgatgctgtcaaatgatgcattagagtttaaggcaagctattttgataccaaagcaaaagattacatcagtaccaccgttgacttcgcagcagcaaccacaatgtcatataatgttcctaacgcaaaaatctggggttgggatgttatgaccaaatataccacagatctgtttagcctggatgttgcatataatcgtacccgtggaaaagataccgacaccggtgaatacattagcagcattaacccggatacagttacctcaaccctgaatattcccattgcacattctggatttagcgttggttgggttggtacctttgcagatcgtagcacacacattagcagcagctatagcaagcagcctggatatggggttaatgatttttatgttagttaccagggtcagcaggccctgaaaggtatgaccacaaccctggtgttaggtaatgcatttgataaggaatattggagcccgcaaggtattccgcaggatggtcgtaatggtaaaatttttgtgagctatcagtggtaa。
优选地，所述生物传感器包括工程化大肠杆菌，所述工程化大肠杆菌中含有血红素氧化酶-1的编码基因、藻胆体核蛋白亚基ApcF2 BDFP1.6的编码基因和跨膜转运蛋白chuA的编码基因，并缺失血红素合成酶基因hemF，所述生物传感器的检测原理如图1所示，跨膜转运蛋白chuA能够将血红素(Heme)转移至细胞内，血红素氧化酶-1(Ho1)将血红素氧化成胆绿素(BV)，藻胆体核蛋白亚基ApcF2(BDFP1.6)能够基于酶促反应，自催化共价结合胆绿素，结合后，经过特定波长的光源激发，可发出远红光FR或者近红外光NIR，从而实现了检测血红素，此外，敲除hemF(ΔhemF)能弱化工程化细胞自身合成血红素，从而降低工程化细胞内血红素的背景干扰。
第二方面，本申请提供一种第一方面所述的生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
敲除宿主细胞的血红素合成酶基因，并将血红素氧化酶-1的编码基因、藻胆体核蛋白亚基ApcF2的编码基因和血红素跨膜转运蛋白的编码基因导入宿主细胞，得到所述生物传感器。
优选地，本申请中使用λ-red重组系统进行基因敲除。
优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌。
优选地，所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或直接基因注射中的任意一种。
优选地，本申请中通过质粒载体将基因导入宿主细胞。
优选地，所述质粒载体包括pACYCDuet。
第三方面，本申请提供一种组合物，所述组合物包括第一方面所述的生物传感器。
优选地，所述组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、电子回路或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本申请提供第一方面所述的生物传感器或第三方面所述的组合物在检测血红素和/或血液中的应用。
与现有技术相比本申请具有以下有益效果：
(1)本申请的生物传感器能够同时表达血红素氧化酶-1、藻胆体核蛋白亚基ApcF2和血红素跨膜转运蛋白，并低表达血红素，能够有效响应胞外血红素并产生荧光，且自身血红素背景荧光低，可有效进行血红素和/或血液检测；
(2)本申请的生物传感器制备简单、成本低，且可有效检测体内出血，具有广阔的发展期前景。
附图说明
图1为本申请生物传感器原理图；
图2为本申请生物传感器与血液反应荧光强度图，误差棒表示标准偏差SD来自3个独立样本数据统计；
图3为本申请生物传感器与血红素反应荧光强度图，误差棒表示标准偏差SD来自3个独立样本数据统计；
图4为本申请生物传感器与缓冲液反应荧光强度图，误差棒表示标准偏差SD来自3个独立样本数据统计；
图5为本申请生物传感器与胆绿素反应荧光强度图，误差棒表示标准偏差SD来自3个独立样本数据统计；
图6为试验例1中1号培养液图；
图7为试验例1中2号培养液图；
图8为试验例1中3号培养液图；
图9为试验例1中4号培养液图；
图10为试验例1中5号培养液图；
图11为不同工程化细胞荧光强度图；
图12为生物传感器与血液的荧光强度的剂量反应曲线图；
图13为生物传感器与血红素的荧光强度的剂量反应曲线图；
图14为斑马鱼体内试验流程图；
图15为斑马鱼成像图；
图16为斑马鱼荧光强度图。
具体实施方式
为进一步阐述本申请所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本申请作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本申请，而非对本申请的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例构建重组质粒，基因实验操作是按照《分子克隆》进行，引物序列如表1所示。
编码跨膜转运蛋白chuA的基因序列(SEQ ID NO:12)由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，并通过限制性酶切位点NcoI和XhoI，将其插入质粒pACYCDuet(Novagen公司)，得到重组质粒pACYCDuet-chuA，该质粒带有氯霉素抗性。
从质粒pACYCDuet-ho1(含有血红素氧化酶-1基因ho1，ho1基因序列来源于all1897(GeneBank)，藻种PCC7120)和pET28a-bdfp1.6中分别扩增得到血红素氧化酶-1(使用引物P3、P4)和藻胆体核蛋白亚基ApcF2(使用引物P5、P6)的基因序列，其中，血红素氧化酶-1的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，藻胆体核蛋白亚基ApcF2的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，然后，血红素氧化酶-1基因ho1使用限制性酶切位点NcoI和PstI，插入到载体质粒pCDFDuet的第一个开放式阅读框架(ORFs)；藻胆体核蛋白亚基ApcF2基因bdfp1.6通过使用限制性酶切位点BglII和XhoI，插入到载体质粒pCDFDuet(Novagen公司)的第二个开放式阅读框架(ORFs)，得到重组质粒pCDFDuet-ho1-bdfp1.6，带有链霉素抗性。
表1
实施例2
本实施例进行大肠杆菌血红素合成酶基因hemF敲除。
以质粒pKD4为模板，扩增hemF及其两侧区域基因、卡那霉素基因和FRT位点，所述hemF基因序列如SEQ ID NO:13所示，hemF上游区域序列如SEQ ID NO:14所示，hemF下游区域序列如SEQ ID NO:15所示，卡那霉素基因序列如SEQ ID NO:16所示，FRT位点序列如SEQID NO:17所示。
SEQ ID NO:13：
atgaaacccgacgcacaccaggttaaacagtttctgctcaaccttcaggatacgatttgtcagcagctgaccgccgtcgatggcgcagaatttgtcgaagatagttggcagcgcgaagctggcggcggcgggcgtagtcgggtgttgcgtaatggtggtgttttcgaacaggcaggcgtcaacttttcgcatgtccacggtgaggcgatgcctgcttccgccaccgctcatcgcccggaacttgccgggcgcagtttcgaggcgatgggcgtttcactggtagtgcatccgcataacccgtatgttcccaccagccacgcgaatgtgcggttttttattgccgaaaaaccgggtgccgatcccgtctggtggtttggcggcggcttcgatttaacccctttctatggttttgaagaagacgccattcactggcaccgcaccgcccgtgacctgtgcctgccatttggtgaagacgtttatccccgttacaaaaagtggtgcgacgattacttctacctcaaacatcgcaacgaacagcgcggtattggcgggctgttctttgatgatctgaacacgccagatttcgaccactgttttgcctttatgcaggcggtaggcaaaggctacaccgacgcttatttaccaattgtagagcgacgtaaagcgatggcctacggcgagcgcgagcgcaattttcagctctaccgtcgcggtcgttatgtcgagttcaatctggtctgggatcgcggcacgctgtttggcctgcaaactggcgggcgcaccgagtctatcctgatgtcaatgccgccactggtacgctgggaatatgattatcagccaaaagatggcagcccagaagcggcgttaagtgagtttattaaggtcagggattgggtgtaa。
SEQ ID NO:14：
cgttccattttgcgtaatcatgggattgatgcgcgtttaacgcgttctggcgatacgtttatcccactttacgatcgcgttgaaatcgcccataaacatggcgcagatctgtttatgtcaattcatgccgatggctttaccaacccgaaagctgccggtgcttcggtatttgccctctctaaccgtggggcaagtagcgcaatggcgaaatacctgtctgaacgcgaaaaccgcgccgatgaagttgccggtaaaaaggcgactgacaaggatcacctattgcaacaagtgctgtttgatctggtgcaaacagataccattaaaaatagtctgacgctcggctcgcatattctgaagaagattaagccggtgcataaactgcacagccgcaacaccgaacaagcggcatttgtggtgttgaaatcaccgtcggttccttcggtgctggtggaaacctcgtttatcaccaacccggaagaagaacggctgttaggcacggcggcgtttcgtcagaaaatcgccacagcgattgctgaaggcgtgatcagttatttccactggttcgacaaccagaaagcacattcgaaaaagcgataagtt。
SEQ ID NO:15：
ctccctcacccccactcccgcatccgctgatgcagcgtcagtgacggcttctcggaaaacagctgctggtaatccgtggcaaattgccccagatgccagaatccccactgcatggcggcgtcttttaccgtcatactttgcgaccacggacttatcagttcgcggcgtacggcgttcaggcgaatgcgtttcagccacgcgttcgggccaatgcctaaaatagcgtgaaacgcgttttgtagcgtgcggcggctgacatgcagttgattacacaaatccagcaccgtcaccggttcggacatgttttccagcacatattcacgggcgcgggaaagcaatcgacggtaactctgatgactgatgctttccgccgtcaccattggttgcgcttcttccagcatggcccccatcgccattagcaaattatcccccagcacttttcgcactgcaggctgatggagattttccggattctcgcaaaacgtcgccagcgcctgttggacaaagccccacagcgcggctttatgctgctctttcacttccagcgccgactggttacgcaacatatgtaatacccgatccgggttatgcaaaaagtta。
SEQ ID NO:16：
atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga。
SEQ ID NO:17：
gaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaact。
将质粒pKD46转化到大肠杆菌BL21中，该质粒带有氨苄青霉素抗性基因、λ-red重组酶基因和阿拉伯糖启动子，在含氨苄青霉素(50g/mL)的LB培养基培养中培养转化后的大肠杆菌，当OD600达到0.3时，加入终浓度为2％的阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达λ-red重组酶，然后将含有hemF及其两侧区域基因、卡那霉素基因和FRT位点的基因片段转化到上述含λ-red重组酶的大肠杆菌中，使用含卡那霉素(30g/mL)的LB平板筛选敲除成功的菌株，并进一步通过PCR实验来验证，在42℃条件下过夜培养，去除质粒pKD46，得到敲除hemF的大肠杆菌。
实施例3
本实施例提供一种生物传感器，所述生物传感器为工程化大肠杆菌，所述工程化大肠杆菌中含有血红素氧化酶-1的编码基因、藻胆体核蛋白亚基ApcF2 BDFP1.6的编码基因和跨膜转运蛋白chuA的编码基因，并缺失血红素合成酶基因hemF。
将实施例1制备的重组质粒pACYCDuet-chuA和pCDFDuet-ho1-bdfp1.6导入实施例2制备的敲除hemF的大肠杆菌，得到工程化大肠杆菌，并使用含有卡那霉素(30g/mL)、氯霉素(40g/mL)和链霉素(50g/mL)的TB培养基培养所述工程化大肠杆菌，待大肠杆菌的OD600达到0.7时，加入1mM IPTG诱导蛋白表达，于16℃诱导15h，使其共表达ChuA、BDFP1.6和HO1，使用50mL离心管，于16℃、5000×g离心5min，并用蒸馏水清洗两次，收集细胞。
此外，为了确定该生物传感器(工程化大肠杆菌)是否对血红素有反应，在培养基加入IPTG的同时，再加入终浓度为20μM的血红素，经过16℃下诱导15h，再用荧光光谱仪检测大肠杆菌的荧光。
试验例1
本试验例检测实施例3制备的生物传感器对血红素或血液的亲和性。
取4个培养瓶，使用含有卡那霉素(30g/mL)、氯霉素(40g/mL)和链霉素(50g/mL)的TB培养基分别培养所述工程化大肠杆菌，待大肠杆菌的OD600达到0.7时，各加入1mM IPTG诱导蛋白表达，于16℃诱导16h，随后分别加入10μM的血红素、1000ppm的血液、缓冲液(10μM的血红素溶解于100mM NaHCO3中)和10μM的胆绿素，然后在37℃下每20分钟监测一次荧光，结果如图2-图5所示，图2和图3分别为加入血液和血红素的试验结果图，荧光强度均不断增强并达到较高水平，表明本申请制备的生物传感器能够有效响应血红素或血液，并产生高强度荧光，图4和图5分别为加入缓冲液和胆绿素的实验结果，荧光强度较低且无明显变化，表明本申请制备的生物传感器的背景干扰较低，因此能够进行有效检测。
取5个培养瓶，编号1-5号，1号接种敲除hemF、但仅导入pCDFDuet-ho1-bdfp1.6质粒的大肠杆菌，在培养基中加入IPTG和血红素进行培养；2号接种实施例3制备的生物传感器，在培养基中加入IPTG和血红素进行培养；3号接种实施例3制备的生物传感器，在培养基中仅加入IPTG进行培养；4号加入未敲除hemF、但导入pCDFDuet-ho1-bdfp1.6和pACYCDuet-chuA质粒的大肠杆菌，在培养基中仅加入IPTG进行培养；5号加入未敲除hemF、但导入pCDFDuet-ho1-bdfp1.6和pACYCDuet-chuA质粒的大肠杆菌，在培养基中加入IPTG和血红素进行培养；检测各组培养液的荧光，结果如图6-图11所示，1号培养液的荧光强度很低，表明不能表达血红素跨膜转运蛋白的细胞无法对血红素有反应；2号培养液的荧光强度较高，表明本申请制备的生物传感器能够有效响应血红素；3号培养液信号强度很低，表明本申请制备的生物传感器的背景干扰较低；4号和5号培养液的荧光强度均高于2号，表明不敲除hemF，会产生较强的背景荧光，影响检测。
为了测定本申请的生物传感器结合血红素或血液的KD值(解离常数)，采用不同浓度的血红素或血液对实施例3制备的生物传感器进行滴定检测，具体包括：使用含有卡那霉素(30g/mL)、氯霉素(40g/mL)和链霉素(50g/mL)的TB培养基分别培养所述生物传感器，待大肠杆菌的OD600达到0.7时，各加入1mM IPTG诱导蛋白表达，于16℃诱导16h，随后将细胞分为成50份，随机取12份分别加入10ppm、30ppm、40ppm、70ppm、100ppm、200ppm、300ppm、400ppm、500ppm、600ppm、1000ppm和2000ppm血液进行反应，随机取13份分别加入0.3μM、0.5μM、0.7μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、7μM、20μM、40μM、70μM和100μM血红素进行反应，血红素体系反应时间100min，血液体系反应时间180min，随后检测荧光强度，上述实验分别进行1次技术重复。
荧光强度与剂量间的关系可采用单一位点结合模型的Scatchard方程(式(1))进行拟合处理，结果如图12和图13所示。
F＝(Fmax[c])/(KD+[c]) (1)
其中“F”表示荧光，“[c]”表示血红素或血液的浓度，KD表示解离常数。
由图12和图13可知，解离常数KD值达到108ppm(血液)，2.85μM(血红素)，表明本申请的生物传感器高效和血液或血红素反应，且具备高特异性。
试验例2
本试验例在斑马鱼中验证本申请生物传感器的有效性，过程如图14所示，所有使用斑马鱼的实验都通过了华中农业大学科学伦理委员会的批准。
实验选用AB品系斑马鱼(购自中国科学院水生生物研究所)，在28℃下饲养，光照周期为14小时，黑暗周期为10小时，采用丰年虫喂养，随机选取40条斑马鱼，使用3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸(MS-222，100mg/L)麻醉斑马鱼，随后用微量注射器将4×106CFU的实施例3制备的生物传感器(工程化大肠杆菌)注射到斑马鱼腹部，4天后，随机选取其中20条，用同样的方法将阿司匹林(20mg/mL)注入腹部，剩余20条注射10μL无菌水作为对照，其中阿司匹林(aspirin)是一种炎症药物，高浓度条件下可以引起消化道出血(考虑到阿司匹林在水中的不溶性，先将阿司匹林磨成粉末，再制备成悬浊液)。
4天后，使用设备QPIX420(Molecular Devices Company)对斑马鱼进行成像，激发波长为628nm，发射波长为692nm，荧光图像用ImageJ(National Institutes of Health))进行校正和分析，图像和统计采用Origin 9.0(OriginLab)进行处理，实验过程中，计算工程化大肠杆菌的平均荧光强度时，每个实验重复3次，确保P值<0.05来达到显著性水平，计算P值时，采用双尾学生t检验法，所有误差条代表标准偏差SD(n＝3，实验次数)，结果如图15和图16所示。
图15为斑马鱼成像图，分别为白光通道下成像和红光通道下成像，可见注射阿司匹林的斑马鱼具有明显荧光，由图16可知，使用ImageJ计算，统一斑马鱼的荧光值后，注射阿司匹林的斑马鱼的荧光值明显高于对照组(p<0.01，双尾学生t检验；N＝20)，表明本申请的生物传感器能够有效进行体内检测。
综上所述，本申请的生物传感器，能够高效与血红素反应，且具备高特异性，此外，自身背景荧光较低，因此能够有效进行血红素检测，并能有效检测体内出血。
申请人声明，本申请通过上述实施例来说明本申请的详细方法，但本申请并不局限于上述详细方法，即不意味着本申请必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本申请产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
广州天宝颂原生物科技开发有限公司
<120> 一种生物传感器及其制备方法和应用
<130> BY21DX1761FGPC-CN
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 169
<212> PRT
<213> 拟色球藻PCC 7203（Chroococcidiopsis sp. PCC 7203）
<400> 1
Met Gln Asp Lys Leu Thr Ser Val Ala Lys Asn Cys Asp Leu Thr Gly
1 5 10 15
Ser Ser Leu Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Ser Asn Ala
35 40 45
Ala Glu Ile Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro
50 55 60
Glu Leu Val Ser Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn
65 70 75 80
Met Tyr Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Tyr Cys Ser Tyr Ala
85 90 95
Ile Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly
100 105 110
Leu Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Arg Ser Ile Gln Leu Met Lys Asn Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr
130 135 140
Ala Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Val
145 150 155 160
Val Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
165
<210> 2
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.1
<400> 2
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 3
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.2
<400> 3
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Phe
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Cys Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 4
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.3
<400> 4
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Glu Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Ala Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Cys Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 5
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.4
<400> 5
Ala Asp Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn
1 5 10 15
Ala Ala Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr
20 25 30
Pro Glu Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr
35 40 45
Asn Met Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr
50 55 60
Ala Ile Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Gly Arg Leu Leu Ala
65 70 75 80
Gly Leu Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val
100 105 110
Thr Ala Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr
115 120 125
Ile Val Arg Gly Ile Ser Glu Thr Glu Ile
130 135
<210> 6
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.5
<400> 6
Ala Asp Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn
1 5 10 15
Ala Ala Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr
20 25 30
Pro Glu Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr
35 40 45
Asn Met Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr
50 55 60
Ala Ile Val Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Met Leu Ala
65 70 75 80
Gly Leu Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val
100 105 110
Thr Ala Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr
115 120 125
Ile Ala Arg Val Ile Ser Glu Thr Glu Ile
130 135
<210> 7
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.6
<400> 7
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Gly Arg Met Leu Ala Gly Phe
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Cys Pro Ala Ala Arg
100 105 110
Gly Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Val Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 8
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.7
<400> 8
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Gly Arg Met Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Gly Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Val Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 9
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.8
<400> 9
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Lys
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Gly Arg Met Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Val Ala Arg
100 105 110
Gly Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Val Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 10
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BDFP1.9
<400> 10
Met Ala Asn Arg Glu Val Arg Glu Thr Gln Lys Glu Gln Gln Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Arg Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Lys
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Asp Gly Arg Met Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Val Ala Arg
100 105 110
Gly Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Val Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 11
<211> 238
<212> PRT
<213> 鱼腥草PCC 7120 （Anabaena sp. PCC 7120 ）
<400> 11
Met Ser Ser Asn Leu Ala Asn Lys Leu Arg Val Gly Thr Lys Lys Ala
1 5 10 15
His Thr Met Ala Glu Asn Val Gly Phe Val Lys Cys Phe Leu Lys Gly
20 25 30
Val Val Glu Lys Ser Ser Tyr Arg Lys Leu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr
35 40 45
Val Tyr Ser Ala Met Glu Glu Glu Met Glu Lys His Ser Gln His Pro
50 55 60
Ile Val Ser Lys Ile Asn Phe Ser Gln Leu Asn Arg Lys Gln Thr Leu
65 70 75 80
Glu Gln Asp Leu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ala Asn Trp Arg Glu Gln Ile
85 90 95
Gln Leu Ser Pro Ala Gly Glu Ala Tyr Val Gln Arg Ile Arg Glu Ile
100 105 110
Ser Ala Thr Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ala His Ser Tyr Thr Arg Tyr
115 120 125
Leu Gly Asp Leu Ser Gly Gly Gln Ile Leu Lys Asn Ile Ala Val Thr
130 135 140
Ala Met Asn Leu Asn Asp Gly Gln Gly Thr Ala Phe Tyr Glu Phe Ala
145 150 155 160
Asp Ile Ser Asp Glu Lys Ala Phe Lys Ala Lys Tyr Arg Gln Thr Leu
165 170 175
Asp Glu Leu Ala Ile Asp Glu Ala Thr Gly Asp Arg Ile Val Asp Glu
180 185 190
Ala Asn Ala Ala Phe Gly Met Asn Met Lys Met Phe Gln Glu Leu Glu
195 200 205
Gly Asn Leu Ile Lys Ala Ile Gly Met Met Leu Phe Asn Thr Leu Thr
210 215 220
Arg Lys Arg Thr Arg Gly Ala Thr Glu Leu Ala Thr Ala Glu
225 230 235
<210> 12
<211> 1983
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红素跨膜转运蛋白
<400> 12
atgagccgtc ctcagtttac cagcctgcgt ctgagcctgc tggcgttagc agttagcgcg 60
accctgccta cctttgcctt tgcgacggaa accatgaccg ttaccgcaac cgggaatgcc 120
cgcagttcat ttgaggcacc gatgatggtt agcgttattg ataccagtgc accggaaaat 180
cagaccgcca ccagtgccac cgacctgtta cgtcatgttc cgggtattac actggatggt 240
accggtcgca caaatggtca ggatgttaat atgcgtgggt atgatcatag aggggtgtta 300
gttctggttg atggtgttag acaaggtact gataccggtc atctgaacgg tacgtttctg 360
gatcctgcac tgattaaaag agttgaaatt gtacgtggtc cgagcgcatt actgtatggt 420
agtggtgctc tgggtggggt tatttcctat gatacagttg atgcaaaaga cctgctgcag 480
gaaggtcaga gcagcggttt tagagttttt ggtacaggtg gaaccggtga tcatagttta 540
ggtctgggtg cgagtgcatt tggtcgtacc gaaaatctgg atggtattgt tgcctggagc 600
agtcgtgatc gtggtgatct gcggcagagt aatggggaga cagcaccgaa tgatgagagt 660
attaataata tgctggccaa aggtacgtgg cagattgata gcgcacagag tctgagcggg 720
ttagttagat attataacaa cgatgcacgt gaaccgaaaa atccgcagac cgttggtgca 780
tccgagagct ctaatccgat ggttgatcgc agcaccattc agcgtgatgc acagttaagc 840
tataagctgg ccccacaagg taatgattgg ttaaacgcag atgcaaaaat ttattggtcc 900
gaagttcgta tcaatgcgca gaataccgga agcagcggtg aatatcgtga acagattacc 960
aaaggtgcac gtttagaaaa ccgcagcaca ttattcgcgg atagctttgc aagccatctg 1020
ctgacctatg gcggtgaata ctatagacag gaacagcatc cgggtggggc aacaacaggt 1080
tttccgcagg caaaaatcga ttttagctct ggttggctgc aggatgaaat cacactgcgg 1140
gacctgccga ttacccttct gggtggtacc agatatgata gttatagagg cagcagcgat 1200
ggttacaaag atgttgatgc agataaatgg agtagcagag caggaatgac cattaatccg 1260
accaattggt taatgctgtt tgggagctat gcacaggcat tccgggcacc tacaatgggg 1320
gaaatgtata atgatagtaa acatttcagt atcgggagat tttacaccaa ctactgggtt 1380
ccgaatccga atttacgtcc ggaaaccaat gaaacccaag aatatggttt cggcctgcgt 1440
tttgatgacc tgatgctgtc aaatgatgca ttagagttta aggcaagcta ttttgatacc 1500
aaagcaaaag attacatcag taccaccgtt gacttcgcag cagcaaccac aatgtcatat 1560
aatgttccta acgcaaaaat ctggggttgg gatgttatga ccaaatatac cacagatctg 1620
tttagcctgg atgttgcata taatcgtacc cgtggaaaag ataccgacac cggtgaatac 1680
attagcagca ttaacccgga tacagttacc tcaaccctga atattcccat tgcacattct 1740
ggatttagcg ttggttgggt tggtaccttt gcagatcgta gcacacacat tagcagcagc 1800
tatagcaagc agcctggata tggggttaat gatttttatg ttagttacca gggtcagcag 1860
gccctgaaag gtatgaccac aaccctggtg ttaggtaatg catttgataa ggaatattgg 1920
agcccgcaag gtattccgca ggatggtcgt aatggtaaaa tttttgtgag ctatcagtgg 1980
taa 1983
<210> 13
<211> 900
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 13
atgaaacccg acgcacacca ggttaaacag tttctgctca accttcagga tacgatttgt 60
cagcagctga ccgccgtcga tggcgcagaa tttgtcgaag atagttggca gcgcgaagct 120
ggcggcggcg ggcgtagtcg ggtgttgcgt aatggtggtg ttttcgaaca ggcaggcgtc 180
aacttttcgc atgtccacgg tgaggcgatg cctgcttccg ccaccgctca tcgcccggaa 240
cttgccgggc gcagtttcga ggcgatgggc gtttcactgg tagtgcatcc gcataacccg 300
tatgttccca ccagccacgc gaatgtgcgg ttttttattg ccgaaaaacc gggtgccgat 360
cccgtctggt ggtttggcgg cggcttcgat ttaacccctt tctatggttt tgaagaagac 420
gccattcact ggcaccgcac cgcccgtgac ctgtgcctgc catttggtga agacgtttat 480
ccccgttaca aaaagtggtg cgacgattac ttctacctca aacatcgcaa cgaacagcgc 540
ggtattggcg ggctgttctt tgatgatctg aacacgccag atttcgacca ctgttttgcc 600
tttatgcagg cggtaggcaa aggctacacc gacgcttatt taccaattgt agagcgacgt 660
aaagcgatgg cctacggcga gcgcgagcgc aattttcagc tctaccgtcg cggtcgttat 720
gtcgagttca atctggtctg ggatcgcggc acgctgtttg gcctgcaaac tggcgggcgc 780
accgagtcta tcctgatgtc aatgccgcca ctggtacgct gggaatatga ttatcagcca 840
aaagatggca gcccagaagc ggcgttaagt gagtttatta aggtcaggga ttgggtgtaa 900
<210> 14
<211> 600
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 14
cgttccattt tgcgtaatca tgggattgat gcgcgtttaa cgcgttctgg cgatacgttt 60
atcccacttt acgatcgcgt tgaaatcgcc cataaacatg gcgcagatct gtttatgtca 120
attcatgccg atggctttac caacccgaaa gctgccggtg cttcggtatt tgccctctct 180
aaccgtgggg caagtagcgc aatggcgaaa tacctgtctg aacgcgaaaa ccgcgccgat 240
gaagttgccg gtaaaaaggc gactgacaag gatcacctat tgcaacaagt gctgtttgat 300
ctggtgcaaa cagataccat taaaaatagt ctgacgctcg gctcgcatat tctgaagaag 360
attaagccgg tgcataaact gcacagccgc aacaccgaac aagcggcatt tgtggtgttg 420
aaatcaccgt cggttccttc ggtgctggtg gaaacctcgt ttatcaccaa cccggaagaa 480
gaacggctgt taggcacggc ggcgtttcgt cagaaaatcg ccacagcgat tgctgaaggc 540
gtgatcagtt atttccactg gttcgacaac cagaaagcac attcgaaaaa gcgataagtt 600
<210> 15
<211> 600
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 15
ctccctcacc cccactcccg catccgctga tgcagcgtca gtgacggctt ctcggaaaac 60
agctgctggt aatccgtggc aaattgcccc agatgccaga atccccactg catggcggcg 120
tcttttaccg tcatactttg cgaccacgga cttatcagtt cgcggcgtac ggcgttcagg 180
cgaatgcgtt tcagccacgc gttcgggcca atgcctaaaa tagcgtgaaa cgcgttttgt 240
agcgtgcggc ggctgacatg cagttgatta cacaaatcca gcaccgtcac cggttcggac 300
atgttttcca gcacatattc acgggcgcgg gaaagcaatc gacggtaact ctgatgactg 360
atgctttccg ccgtcaccat tggttgcgct tcttccagca tggcccccat cgccattagc 420
aaattatccc ccagcacttt tcgcactgca ggctgatgga gattttccgg attctcgcaa 480
aacgtcgcca gcgcctgttg gacaaagccc cacagcgcgg ctttatgctg ctctttcact 540
tccagcgccg actggttacg caacatatgt aatacccgat ccgggttatg caaaaagtta 600
<210> 16
<211> 795
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 16
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FRT位点序列
<400> 17
gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaact 46
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1
<400> 18
ggcatccctc tgggtcccac tgcccggggc 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2
<400> 19
gagggagttg aatgtatccc gcagcccggc 30
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P3
<400> 20
cctggcgggt cggcctatac aacaa 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P4
<400> 21
ggacaccaac tctgggtact cctga 25
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P5
<400> 22
gacctcaact acttcctcag gatgtgt 27
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P6
<400> 23
cctcacacac atgttgtagc gccttgt 27
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