具体实施方式

本发明提供了一系列用于治疗应用的新颖药剂和组合物。本发明的分子和组合物可用于在受试者中改善、预防或治疗与Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)相关的疾病或增加葡萄糖-6-磷酸酶-alpha(G6P酶-α)的存在或功能。

除非另有说明，技术术语均按惯例使用。分子生物学中常用术语的定义可以在以下中找到：Benjamin Lewin,Genes V[基因V],牛津大学出版社出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑.),The Encyclopedia of Molecular Biology[分子生物学百科全书],由布莱克威尔科学公司(Blackwell Science Ltd.)出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference[分子生物学和生物技术：综合案头参考],由VCH出版公司(VCH Publishers,Inc.)出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为便于查阅本披露的各个实施方案，提供以下对特定术语的解释：

腺相关病毒(AAV)：一种小的、复制缺陷的、无包膜的病毒，可感染人和其他一些灵长类动物。AAV已知不会引起疾病并引发非常温和的免疫应答。利用AAV的基因疗法载体可以感染分裂细胞和静止细胞，并且能以染色体外状态持续存在而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使AAV成为一种有吸引力的基因疗法病毒载体。目前有12种公认的AAV血清型(AAV1-12)。

施用(Administration/Administer)：通过任何有效途径向受试者提供或给予药剂，例如治疗剂(例如，重组AAV)。示例性的施用途径包括但不限于注射(例如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、胆管腔内、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。

密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已被改变的核酸序列，使得密码子对于在特定系统(例如特定物种或物种组)中的表达是最佳的。例如，可以优化核酸序列以在哺乳动物细胞或特定哺乳动物物种(例如人细胞)中表达。密码子优化不会改变编码蛋白质的氨基酸序列。

增强子：通过增加启动子的活性来增加转录速率的核酸序列。

G6PC：位于人染色体17q21上的基因，编码葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6P酶-α)。G6P酶-α是一种357个氨基酸的疏水蛋白，具有9个将其锚定在内质网中的螺旋(Chou等人,Nat RevEndocrinol[自然评论内分泌]6:676-688,2010)。G6P酶-α蛋白在糖异生和糖原分解的最后阶段催化葡萄糖6-磷酸水解为葡萄糖和磷酸盐并且是葡萄糖稳态的关键酶。G6PC基因突变导致Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)，这是一种代谢障碍，其特征是与肝和肾中糖原和脂肪的积累有关的严重的空腹低血糖症。

糖原贮积病(GSD)：由肌肉、肝脏和其他组织内糖原合成或分解过程中的缺陷引起的一组疾病。GSD可以是遗传性的，也可以是获得性的。遗传性GSD是由这些过程中涉及的任何先天性代谢错误引起的。目前有11种公认的糖原贮积病(GSD I、II、III、IV、V、VI、VII、IX、XI、XII和XIII型)。GSD-I由两种常染色体隐性遗传障碍GSD-Ia和GSD-Ib组成(Chou等人,Nat Rev Endocrinol[自然评论内分泌]6:676-688,2010)。GSD-Ia由葡萄糖-6-磷酸酶-α缺陷引起。葡萄糖-6-磷酸转运蛋白(G6PT)的缺陷是GSD-Ib的原因。

Ia型糖原贮积病(GSD-Ia)：GSD-Ia也称为肝糖原累积症，是最常见的糖原贮积病，其发病率约为100,000名活产婴儿中1名。GSD-Ia是一种由葡萄糖-6-磷酸酶-α(G6P酶-α)缺陷引起的遗传疾病。G6P酶-α缺陷会损害肝脏从糖原和糖异生中产生游离葡萄糖的能力。受GSD-Ia影响的患者无法维持葡萄糖稳态并出现空腹低血糖、生长迟缓、肝肿大、肾肿大、高脂血症、高尿酸血症和乳酸性酸血症(Chou等人,Nat Rev Endocrinol[自然评论内分泌]6:676-688,2010)。目前无法治愈GSD-Ia。

内含子：基因中不包含蛋白质编码信息的一段DNA。内含子在信使RNA翻译之前去除。

反向末端重复(ITR)：有效复制所需的腺相关病毒基因组中的对称核酸序列。ITR序列位于AAV DNA基因组的每一端。ITR作为病毒DNA合成的复制起点，并且是载体衣壳化所必需的。

分离的：“分离的”生物组分(例如核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已与生物体的细胞或组织中的其他生物组分或生物体本身(其中组分天然地存在，如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞)基本分离或纯化。已“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。

可操作地连接：当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。

药学上可接受的载剂：可用于本披露的药学上可接受的载剂(媒剂)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,15th Edition(1975)描述了适用于一种或多种治疗性化合物、分子或药剂的药物递送的组合物和配制剂。

一般而言，载剂的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外配制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物，例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载剂可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载剂之外，待施用的药物组合物可包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病(例如GSD-Ia)是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展后改善其体征或症状的治疗性干预。“改善”是指疾病体征或症状的数量或严重程度的降低。

启动子：指导/启动核酸(例如基因)转录的DNA区域。启动子包括靠近转录起始位点的必要核酸序列。

纯化的：术语“纯化的”并不要求绝对纯度；相反，它旨在作为一个相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物是从天然相关蛋白质和其他污染物中完全或部分分离的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指已从细胞、细胞培养基或其他粗制剂中分离并进行分级以除去初始制剂的各种组分(例如蛋白质、细胞碎片和其他组分)的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物。

重组：重组核酸分子是一种具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个在其他情况下分离的序列片段而制成的序列的核酸分子。这种人工组合可以通过化学合成或通过核酸分子的分离片段的人工操作来实现，例如通过基因工程技术。

类似地，重组病毒是包含非天然存在的或通过至少两个不同来源的序列的人工组合制成的序列(例如基因组序列)的病毒。术语“重组”还包括仅通过添加、取代或缺失天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分而改变的核酸、蛋白质和病毒。如本文所用，“重组AAV”是指其中包装了重组核酸分子例如编码G6P酶-α的重组核酸分子的AAV颗粒。

序列同一性：两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以用同一性百分比来衡量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以用百分比相似性来衡量(考虑到保守的氨基酸取代)；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高程度的序列同一性/相似性。当直系同源蛋白质或cDNA衍生自更密切相关的物种(如人和小鼠序列)时，与亲缘关系更远的物种(如人和线虫序列)相比，这种同源性更显著。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443,1970:Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene[基因],73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS5:151-3,1989；Corpet等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]16:10881-90,1988；Huang等人Computer Appls.in the Biosciences[生物科学中的计算机应用]8,155-65,1992:和Pearson等人,Meth.Mol.Rio.[数学分子比]24:307-31,1994.Altschul等人.,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10,1990，给出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人.,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10,1990)可从几个来源获得，包括美国国家生物信息中心(NCBI)和互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。更多信息可以在NCBI网站上找到。

血清型：一组密切相关的微生物(如病毒)，以特征抗原组来区分。

填充序列：指包含在较大核酸分子(例如载体)中的核苷酸序列，通常用于在两个核酸特征之间(例如启动子和编码序列之间)产生所需的间距，或延长核酸分子，使其具有所期望的长度。填充序列不包含蛋白质编码信息并且可以是未知/合成来源和/或与较大核酸分子内的其他核酸序列无关。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，这一类别包括人和非人哺乳动物。

合成的：在实验室中通过人工方式产生，例如合成的核酸可以在实验室中化学合成。

治疗有效量：一定量的特定药物或治疗剂(例如，重组AAV)足以在用药剂治疗的受试者或细胞中实现所期望的效果。药剂的有效量将取决于几个因素，包括但不限于被治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的施用方式。

载体：载体是允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包括一种或多种选择标记基因和其他遗传元件。表达载体是包含必要的调控序列以允许插入的一个或多个基因的转录和翻译的载体。在本文的一些实施方案中，载体是AAV载体。

除非另外解释，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。除非上下文另外清楚指出，单数术语“一个(a)”、“一种(an)”、“所述(the)”包含复数指代。“包含A或B”是指包括A、或B、或A和B。进一步应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似的，并提供用于说明。虽然与本披露的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。所有的公开物、专利申请、专利、以及在此提及的其他参考文献以其全文通过引用结合。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的并且不旨在是限制性的。

I.重组核酸

本发明的一个方面提供了重组核酸序列，其包括与野生型GPE相比缺少一个或多个Alu元件的经修饰的G6PC启动子/增强子(GPE)，其中经修饰的GPE能够指导编码G6P酶-α(SEQ ID NO:5)的编码基因的表达。在一些实施方案中，通过从人G6PC基因的内源启动子去除一个或多个Alu元件，例如去除SEQ ID NO:6的连续核苷酸1079-1272(Alu-1)、1633-1968(Alu-2)和2140-2495(Alu-3)中的一个或多个，来获得经修饰的GPE。在一些其他实施方案中，通过从其他哺乳动物例如非人灵长类动物、绵羊、啮齿动物等的G6PC基因的内源启动子去除一个或多个Alu元件来获得经修饰的GPE。在一些实施方案中，与野生型GPE相比，经修饰的GPE不影响G6PC基因表达。在一些实施方案中，与野生型GPE相比，经修饰的GPE能够增强G6PC基因的表达。在一些实施方案中，经修饰的GPE具有与野生型GPE相当的在肝脏中驱动G6PC基因表达的活性，并且在其他组织中驱动G6P酶-α表达的活性非常低。

在一些实施方案中，经修饰的GPE包括核酸序列，所述核酸序列缺少与来自SEQ IDNO:6的连续核苷酸1079-1272(Alu-1)至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，经修饰的GPE包括核酸序列，所述核酸序列缺少与来自SEQID NO:6的连续核苷酸1633-1968(Alu-2)至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，经修饰的GPE包括核酸序列，所述核酸序列缺少与来自SEQ ID NO:6的连续核苷酸2140-2495(Alu-3)至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。

在一些实施方案中，经修饰的GPE包括核酸序列，所述核酸序列缺少与Alu-1至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列和与来自SEQ ID NO:6的Alu-2至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，经修饰的GPE包括核酸序列，所述核酸序列缺少与Alu-1至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列和与来自SEQ ID NO:6的Alu-3至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，经修饰的GPE包括核酸序列，所述核酸序列缺少与Alu-2至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列和与来自SEQ ID NO:6的Alu-3至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，经修饰的GPE包括核酸序列，所述核酸序列缺少与Alu-1序列至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列、与Alu-2至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列、和与来自SEQ ID NO:6的Alu-3至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。

在本发明的一些实施方案中，重组核酸序列包括GPE，其具有与SEQ ID NO:1的连续核苷酸146-2123至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列，其中GPE能够指导编码G6P酶-α的编码序列的表达。在一些实施方案中，重组核酸序列包括GPE，其具有与SEQ ID NO:7至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列，其中GPE能够指导编码G6P酶-α的编码序列的表达。在一些实施方案中，重组核酸序列包括GPE，其具有与SEQ ID NO:8至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列，其中GPE能够指导编码G6P酶-α的编码序列的表达。在一些实施方案中，重组核酸序列包括GPE，其具有与SEQ ID NO:9至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列，其中GPE能够指导编码G6P酶-α的编码序列的表达。在一些实施方案中，重组核酸序列包括GPE，其具有与SEQ ID NO:10至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列，其中GPE能够指导编码G6P酶-α的编码序列的表达。在一些实施方案中，重组核酸序列包括GPE，其具有与SEQ ID NO:11至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列，其中GPE能够指导编码G6P酶-α的编码序列的表达。在一些实施方案中，重组核酸序列包括GPE，其具有与SEQ ID NO:12至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列，其中GPE能够指导编码G6P酶-α的编码序列的表达。

本发明的另一方面提供了重组核酸序列，其包括本文披露的经修饰的GPE和编码G6P酶-α的编码序列。在一些实施方案中，G6P酶-α包括与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，G6P酶-α包括SEQ ID NO:5或其活性片段或变体。在示例性实施方案中，G6P酶-α包含SEQ ID NO:5或由其组成。

在一些实施方案中，编码G6P酶-α的编码序列掺入了与SEQ ID NO:4至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列。

在一些实施方案中，编码人G6P酶-α的编码序列是为在人细胞中表达而优化的密码子。可以使用OptimumGeneTM密码子优化技术(金斯瑞公司(GenScript)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)对人G6PC cDNA进行密码子优化。可以检查优化的G6PC cDNA序列并进一步修饰，以从理论上可以编码9个或更多个氨基酸长度的肽的内部非框ATG序列中消除潜在的替代阅读框(ARF)。例如，可以对密码子优化的G6PC cDNA序列进行进一步修饰，以避免潜在的细胞毒性T淋巴细胞对ARF产生的转基因产物的应答(Li等人,2009,PNAS[美国国家科学院院刊]106:10770-4)。在一些实施方案中，人G6P酶-α的密码子优化编码序列掺入了与SEQ ID NO:3至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列。

在一些实施方案中，包括如本文所述的经修饰的GPE和编码G6P酶-α的编码序列的重组核酸序列进一步包括内含子和/或聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，内含子位于GPE和G6P酶-α编码序列之间。在一些实施方案中，内含子是嵌合内含子，其增加G6P酶-α转基因表达。内含子可以是由来自人β-珠蛋白基因的第一内含子的5’-供体位点和来自免疫球蛋白基因重链可变区的内含子的分支和3’-受体位点构成，其中供体和受体位点的序列以及分支点位点已被改变以匹配用于剪接的共有序列。在一些实施方案中，内含子包括与SEQ ID NO:13至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列。

聚腺苷酸化信号可置于编码G6P酶-α的编码序列下游，以有效地对G6PC mRNA进行聚腺苷酸化。可以使用多种聚腺苷酸化信号，例如猿猴病毒40(SV40)晚期聚腺苷酸化信号、hGH聚腺苷酸化信号、BGH聚腺苷酸化信号或rbGlob聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是SV40晚期聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号包括与SEQID NO:14至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列。

本发明的另一方面提供了包含经修饰的GPE和编码本文披露的G6P酶-α的编码序列的重组载体。在一些实施方案中，重组载体进一步包括本文所述的内含子和/或聚腺苷酸化信号。载体可以是哺乳动物表达载体、细菌表达载体、酵母表达载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、RNAi载体、Cre-Lox表达载体、CRISPR表达载体、TALEN表达载体等。载体进一步可包括如本文所述的内含子和/或聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，重组载体进一步包括位于GPE和内含子之间和/或内含子和G6P酶-α编码序列之间的填充核酸序列。

在一些实施方案中，重组载体是AAV载体。AAV载体可以是血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12)以及从人和非人灵长类动物组织中分离出的超过100种变体中的任何一种的AAV载体(参见例如Choi等人,Curr Gene Ther.[当今基因疗法],5:299-310,2005；和Gao等人,Curr Gene Ther.[当今基因疗法],5:285-297,2005)。任何血清型的AAV载体均可用于本发明，并且AAV血清型的选择将部分取决于基因疗法靶向的一种或多种细胞类型。对于GSD-Ia的治疗，肝脏是相关的靶器官之一。

在一些实施方案中，重组AAV载体包括AAV ITR序列，当AAV和腺病毒辅助功能以反式提供时，AAV ITR序列既起载体DNA复制起点作用，又起载体基因组的包装信号作用。此外，ITR是大Rep蛋白单链核酸内切的靶，从复制中间体拆分单个基因组。

在一些示例性实施方案中，AAV载体是AAV血清型8(AAV8)载体，并且所述载体包括经修饰的GPE、内含子、编码G6P酶-α的编码序列和本文描述的SV40晚期多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，载体进一步包括两个AAV2反向末端重复(ITR)序列(SEQ ID NO:15)：GPE的5’一个和聚腺苷酸化信号的3’一个。在一些特定的非限制性实施例中，重组载体包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的核酸序列。

II.包含重组核酸的宿主细胞

进一步提供了包含本文披露的重组核酸分子或载体的分离的宿主细胞。可以使用多种宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等。在一些实施方案中，宿主细胞可以是适合于产生重组AAV(rAAV)的细胞(或细胞系)，例如HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5细胞。

可以使用本领域已知的任何合适的方法将重组核酸分子或载体递送到宿主细胞培养物中。在一些实施方案中，产生了具有插入其基因组中的重组核酸分子或载体的稳定宿主细胞系。在一些实施方案中，产生稳定的宿主细胞系，其包含本文所述的AAV载体。将AAV载体转染至宿主培养物后，可以通过多种方法测定rAAV进入宿主基因组的整合，例如抗生素选择、荧光激活细胞分选、蛋白质印迹、基于PCR的检测、荧光原位杂交，如Nakai等人,Nature Genetics[自然遗传学](2003)34,297-302；Philpott等人,Journal of Virology[病毒学杂志](2002)76(11):5411-5421和Howden等人,J Gene Med[基因药物杂志]2008；10:42-50中所述。此外，稳定细胞系可以根据本领域众所周知的方案建立，例如在Clark,Kidney International[国际肾脏杂志]第61卷(2002):S9-S15,和Yuan等人,Human GeneTherapy[人基因疗法]2011年5月；22(5):613-24中所述的那些。

III.重组AAV

本发明还提供了包含本文所述的AAV衣壳和AAV载体基因组的rAAV。AAV衣壳可以是血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或rh10)。在一些实施方案中，衣壳是AAV8衣壳。

rAAV可由宿主细胞产生，宿主细胞具有本文披露的AAV载体和AAV Rep和Cap基因功能，以及另外的辅助功能。Rep和Cap基因功能可以通过多种方式提供给宿主细胞，例如，通过质粒或任何类型的包含野生型AAV Rep和Cap基因的载体，以及Rep和Cap mRNA的电穿孔。另外的辅助功能可以由例如腺病毒(AV)感染、携带所有所需AV辅助功能基因的质粒或其他病毒如单纯疱疹病毒(HSV)或杆状病毒提供。宿主细胞产生rAAV所必需的任何基因、基因功能或其他遗传物质可瞬时存在于宿主细胞内，或稳定插入宿主细胞基因组中。适用于本发明方法使用的rAAV生产方法包括以下中披露的那些：Clark等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]6:1329-1341(1995),Martin等人,Human Gene Therapy Methods[人基因疗法方法]24:253-269(2013),Thorne等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]20:707-714(2009),Fraser Wright,Human Gene Therapy[人基因疗法]20:698-706(2009),和Virag等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]20:807-817(2009)。

在示例性实施方案中，HEK293细胞用以下转染：包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列的AAV载体；编码四种野生型AAV2病毒复制(Rep)蛋白和来自血清型8的三种野生型AAV病毒衣壳(cap)蛋白的质粒；以及包含对AAV复制很重要的腺病毒基因组区域(即E2A、E4和VA RNA)的质粒。随后可以从宿主细胞中产生和分离含有AAV8衣壳的rAAV。在一些实施方案中，AAV载体中缺少一种或多种Alu元件的经修饰的GPE增强了从宿主细胞产生的rAAV的包装。在一些实施方案中，在AAV载体中缺少一种或多种Alu元件的经修饰的GPE影响自身互补结构形成并因此提高从宿主细胞产生的rAAV的产量。

AAV感染的细胞的裂解可以通过化学或酶促处理细胞以释放感染性病毒颗粒的方法来完成。这些方法包括使用核酸酶(例如benzonase或DNA酶)、蛋白酶(例如胰蛋白酶)或去污剂或表面活性剂。也可以使用物理破坏，例如均质化或研磨，或通过微流化器压力单元施加压力，或冻融循环。可替代地，可以从AAV感染的细胞中收集上清液，而无需细胞裂解。

可能需要纯化含有rAAV和辅助病毒颗粒的样品，以去除例如细胞裂解产生的细胞碎片。辅助病毒和AAV颗粒的最小纯化方法是本领域已知的，并且可以使用任何合适的方法来制备包含AAV和辅助病毒颗粒的样品以用于本发明的方法。两种示例性纯化方法是基于氯化铯(CsCl)和基于碘克沙醇的密度梯度纯化。Strobel等人,Human Gene TherapyMethods[人基因疗法方法],26(4):147-157(2015)中描述了这两种方法。也可以使用亲和色谱使用例如AVB琼脂糖凝胶亲和树脂(通用健康医疗生物科学公司(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)或POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8、AAV9或AAVX亲和树脂(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，米勒斯堡(Millersburg)，宾夕法尼亚州)来完成最小纯化。使用AVB琼脂糖凝胶亲和树脂的AAV纯化方法描述于，例如，Wang等人,Mol Ther Methods Clin Dev.[分子疗法-方法与临床开发],2:15040(2015)。

可能需要通过加热灭活辅助病毒。热灭活技术基于AAV和辅助病毒颗粒的不同热稳定性。例如，AAV颗粒可以加热到高达56℃的温度并仍然保持完整，而AV颗粒则变得失活。Conway等人,Gene Therapy[基因疗法]6,986-993,1999描述了HSV在含有AAV的样品中的差异热灭活。热灭活可以通过任何已知的方法来完成。在下面描述的实施例中，使用热循环仪快速加热和冷却300μL或更少的样品体积来实现热灭活。选择该系统是因为它依赖于主要是传导性的热传递，使其成为连续流动系统和采用主动混合的更大批量系统的可行模型。连续流动系统的例子包括使样品通过连续流动热交换器，例如用于生物治疗制造的DHX^TM一次性热交换器(赛默飞世尔科技公司，米勒斯堡，宾夕法尼亚州)。这样的系统允许操作者通过控制样品通过热交换器的流速来控制热灭活过程，从而控制加热过程的持续时间和热交换器的温度，从而控制热灭活的温度。

可替代地，可以使用各种尺寸的批量系统来实现热灭活。例如，可以通过将含有AAV的样品放入1L PETG瓶中并将瓶子置于设定为所期望灭活温度的水浴中持续所期望时间，并混合，以1L规模完成热灭活；例如，样品可以加热到47℃ 20分钟。在更大的规模，热灭活可以通过将含有rAAV的样品放入5L生物处理袋中在设置在所期望的灭活温度下的温度控制摇摆平台上持续所期望的时间来实现。例如，可以将摇摆平台设置为49℃，摇摆速度为30RPM，混合角度为12°，持续40分钟。

热灭活可在任何温度下发生，其中rAAV颗粒和辅助病毒颗粒之间的稳定性有足够的差异，辅助病毒颗粒基本上被灭活而活性rAAV颗粒保留。本领域技术人员将理解可能需要更高的温度来实现更大水平的AV减少。在一些实施方案中，热灭活步骤包括使用含有亲液盐和/或二价或三价阳离子的缓冲液。WO/2017/172772中描述了在含有亲液盐和/或二价或三价阳离子的缓冲液存在下热灭活的方法。

一旦完成热灭活，就可能需要或希望确定灭活效率。灭活方案的功效由检测复制能力辅助病毒存在的测定法确定，例如噬斑测定。辅助病毒的噬斑测定为本领域技术人员所熟知，包括AV、HSV、杆状病毒等的噬斑测定。可以使用任何合适的细胞类型，例如HeLa或HEK293细胞进行腺病毒的噬斑测定。标准噬斑测定方案描述于例如Current Protocols inHuman Genetics[人遗传学的当前方案],2003。用于测量腺病毒滴度的替代测定包括允许通过使用免疫细胞化学染色检测病毒蛋白(如六邻体蛋白)来鉴定培养物中受感染细胞的方法。此类测定包括QuickTiter^TM腺病毒滴度免疫测定试剂盒(细胞生物实验室(CellBiolabs)，圣地亚哥，加利福尼亚州)。灭活效率通常报告为病毒的对数减少(LRV)。

由于AAV感染不会导致体外细胞病变效应，因此rAAV颗粒的定量变得复杂，因此噬斑测定不能用于确定感染滴度。然而，可以使用多种方法对AAV颗粒进行量化，包括定量聚合酶链反应(qPCR)(Clark等人,Hum.Gene Ther.[人基因疗法]10,1031-1039(1999))或斑点印迹杂交(Samulski等人,J.Virol.[病毒学杂志]63,3822-3828(1989))，或通过高度纯化的载体制剂的光密度(Sommer等人,Mol.Ther.[分子疗法]7,122-128(2003))。可通过热循环仪(例如，iCycler iQ 96孔模块式热循环仪(伯乐公司(Bio-Rad)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)中的实时定量聚合酶链反应(qPCR)(DRP-qPCR)对DNA酶抗性颗粒(DRP)进行定量。在DNA酶I(100U/ml；普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)存在的情况下，将含有AAV颗粒的样品在37℃下温育60分钟，然后在50℃进行蛋白酶K(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)消化(10U/ml)60分钟，然后在95℃变性30分钟。所使用的引物-探针组应特异于AAV载体基因组的非天然部分，例如目的蛋白质的聚(A)序列。基于引物、探针和扩增序列的长度和组成，可以使用任何合适的循环参数组来扩增PCR产物。替代方案披露于例如Lock等人,Human Gene Therapy Methods[人基因疗法方法]25(2):115-125(2014)。

可以使用TCID₅₀(50％的组织培养感染剂量)测定来确定rAAV颗粒的感染性，例如在Zhen等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]15:709-715(2004)中描述。在该测定中，AAV载体颗粒被连续稀释并用于在96孔板中与AV颗粒一起共感染表达Rep/Cap的细胞系。感染后48小时，从感染孔和对照孔中提取总细胞DNA。然后使用带有转基因特异性探针和引物的qPCR测量AAV载体的复制。TCID₅₀感染性/毫升(TCID₅₀/ml)使用方程计算，使用10倍连续稀释的AAV阳性孔的比率。

IV.用于基因疗法的重组AAV

AAV属于细小病毒科(Parvoviridae)和依赖病毒属(Dependovirus)。AAV是一种小型无包膜病毒，其包装线性单链DNA基因组。AAV DNA的有义链和反义链都以相同的频率包装到AAV衣壳中。

AAV基因组的特征是两个反向末端重复(ITR)，它们位于两个开放阅读框(ORB)的侧翼。例如，在AAV2基因组中，ITR的前125个核苷酸是回文，它自身折叠以最大化碱基配对并形成T形发夹结构。ITR的其他20个碱基，称为D序列，保持未配对状态。ITR是对AAV DNA复制很重要的顺式作用序列；ITR是复制起点，并作为DNA聚合酶合成第二链的引物。在此合成过程中形成的双链DNA，称为复制型单体，用于第二轮自引发复制并形成复制型二聚体。这些双链中间体通过链置换机制进行处理，产生用于包装的单链DNA和用于转录的双链DNA。位于ITR内的是Rep结合元件和末端解离位点(TRS)。在AAV复制过程中，病毒调节蛋白Rep使用这些特征来处理双链中间体。除了在AAV复制中的作用外，ITR对于AAV基因组包装、转录、非许可条件下的负调节和位点特异性整合也必不可少(Days和Berns,Clin Microbiol Rev[临床微生物学评论]21(4):583-593,2008)。

AAV的左侧ORF包含Rep基因，其编码四种蛋白质-Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。右侧ORF包含Cap基因，其产生三种病毒衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)。AAV衣壳包含60个病毒衣壳蛋白，它们排列成二十面体对称。VP1、VP2和VP3以1:1:10的摩尔比存在(Daya和Berns,ClinMicrobiol Rev[临床微生物学评论]21(4):583-593,2008)。

AAV是目前基因治疗中最常用的病毒之一。尽管AAV会感染人和其他一些灵长类动物，但它已知不会引起疾病并引发非常温和的免疫应答。利用AAV的基因疗法载体可以感染分裂细胞和静止细胞，并且能以染色体外状态持续存在而不整合到宿主细胞的基因组中。由于AAV的有利特征，本披露考虑将AAV用于本文披露的重组核酸分子和方法。

AAV具有基因疗法载体的几个期望特征，包括结合并进入靶细胞、进入细胞核的能力，在细胞核中长时间表达的能力以及低毒性。然而，AAV基因组的小尺寸限制了可以掺入的异源DNA的大小。为了尽量最小化这个问题，已经构建了不编码Rep和整合效率元件(IEE)的AAV载体。ITR被保留，因为它们是包装所需的顺式信号(Daya和Berns,Clin MicrobiolRev[临床微生物评论],21(4):583-593,2008)。

生产适用于基因疗法的rAAV的方法是本领域众所周知的(参见，例如，美国专利申请号2012/0100606；2012/0135515；2011/0229971；和2013/0072548；和Ghosh等人,GeneTher[基因疗法]13(4):321-329,2006)，并且可以与本文披露的重组核酸分子和方法一起使用。

本披露提供了包含本文披露的rAAV和药学上可接受的载剂的组合物。可在例如美国专利申请公开号2012/0219528中找到用于施用rAAV的合适药物配制剂。可用于本披露的药学上可接受的载剂(媒剂)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences,byE.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,15th Edition(1975)描述了适用于一种或多种治疗性化合物、分子或药剂的药物递送的组合物和配制剂。

在一些实施方案中，rAAV在适合输注人受试者的缓冲液/载剂中配制。缓冲液/载剂应包括成分，所述成分防止rAAV粘附在输液管上，但不会干扰rAAV体内结合活性。各种合适的解决方案可能包括以下中的一项或多项：缓冲盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物(其离子强度被调节至相等于约100mM氯化钠(NaCl)至约250mM氯化钠)、或被调节至相等离子浓度的生理上相容的盐。pH值可以在6.5到8.5、或7到8.5、或7.5到8的范围内。合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可选自泊洛沙姆，即由聚氧丙烯10(聚(环氧丙烷))的中心疏水链和侧翼的两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链构成的非离子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(Macrogol-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。

本发明还提供治疗被诊断患有1a型糖原贮积病(GSD-Ia)的受试者并向所述受试者施用治疗有效量的本文披露的rAAV(或包含rAAV的组合物)的方法。

可以使用任何合适的方法或途径来施用本文所述的rAAV或含有rAAV的组合物。施用途径包括例如全身、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其他肠胃外施用途径。在一些实施方案中，静脉内施用rAAV或包含rAAV的组合物。

施用的特定剂量对于每个患者可以是均一剂量，例如，1.0x10¹³-1.0x10¹⁵个病毒基因组拷贝(GC)/患者。可替代地，患者的剂量可以根据患者的大致体重或表面积进行调整。确定合适剂量的其他因素可包括待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重程度、施用途径以及患者的年龄、性别和医学病症。确定合适的治疗剂量所需的计算的进一步细化由本领域技术人员常规地进行，尤其是根据本文披露的剂量信息和测定。剂量也可以通过使用已知的用以确定剂量的测定结合适当的剂量-应答数据来确定。例如，可以通过评估首次发生低血糖事件(定义为控制禁食期间(这将在当发生低血糖或达到15小时时结束)葡萄糖<60mg/dL(<3.33mmol/L))的时间(以分钟为单位)来确定施用的rAAV的最佳生物剂量。当监测疾病的进展时，也可以调整个体患者的剂量。

在一些实施方案中，rAAV以例如约1.0x10¹¹个基因组拷贝/千克患者体重(GC/kg)至约1x10¹⁴GC/kg、约5x10¹¹个基因组拷贝/千克患者体重(GC/kg)至约5x10¹³GC/kg，或约1x10¹²至约1x10¹³Gc/kg的剂量施用，如通过qPCR或数字液滴PCR(ddPCR)测量。在一些实施方案中，rAAV以约2×10¹²GC/kg的剂量施用。在一些实施方案中，rAAV以约6×10¹²GC/kg的剂量施用。在一些实施方案中，rAAV以约1×10¹³GC/kg的剂量施用。rAAV可以根据所期望治疗结果的需要以单剂量或多剂量(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量)施用。

剂量可以每周、每月或每年给予一次或多次，甚至每2至20年给予一次。例如，每个剂量可以至少相隔1周、相隔2周、相隔3周、相隔一个月、相隔3个月、相隔6个月或相隔1年给予。本领域普通技术人员可以基于测量的停留时间和可靶向构建体或复合物在体液或组织中的浓度容易地估计给药的重复率。

V.提高重组病毒产量和基因疗法功效的方法

本发明还提供了一种提高宿主细胞的重组病毒产量的方法，其中所述方法包括从重组病毒载体中去除一个或多个Alu元件或Alu元件相关序列。在一些实施方案中，Alu元件相关序列与Alu元件(例如选自SEQ ID NO:6的连续核苷酸1079-1272(Alu-1)、1633-1968(Alu-2)和2140-2495(Alu-3))至少50％相同。重组病毒载体可以是例如慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，从病毒载体内的启动子/增强子区域去除一个或多个Alu元件或Alu元件相关序列。在一些实施方案中，从病毒载体内的内含子区域去除一个或多个Alu元件或Alu元件相关序列。在一些实施方案中，去除一个或多个Alu元件或Alu元件相关序列减少了在包装重组病毒颗粒期间形成的自我互补结构，从而提高了来自宿主细胞的病毒产量。

在整个说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含具体化合物的情况下，或在工艺和方法被描述为具有、包括、或包含具体步骤的情况下，考虑到另外地，存在本发明的组合物，其基本上由或由叙述的化合物组成，并且存在根据本发明的工艺和方法，其基本上由或由叙述的加工步骤组成。

在本申请中，当元件或组分被称为包括在和/或选自所列举的元件或组分的列表中时，应理解该元件或组分可以是所列举的元件或组分中的任何一个，或元件或组分可以从由两个或更多个所述元件或组分组成的组中选择。

此外，应当理解，本文描述的组合物或方法的要素和/或特征可以以多种方式组合而不脱离本发明的精神和范围，无论是本文明确的还是隐含的。例如，当提及特定化合物时，除非从上下文另有理解，否则该化合物可用于本发明组合物的各种实施方案和/或本发明方法中。换句话说，在本申请中，已经以能够编写和绘制清晰简洁的应用的方式描述和描绘了实施方案，但是意图是并且将理解实施方案可以在不脱离本申请教导和一个或多个发明的情况下以各种方式组合或分离。例如，应当理解，这里描述和描绘的所有特征可以适用于这里描述和描绘的一个或多个发明的所有方面。

应当理解，除非从上下文和使用中另有理解，否则表述“至少一个”单独地包括表述之后所列举的对象中的每一个以及所列举的对象中的两个或更多个的各种组合。除非根据上下文另有理解，否则与三个或更多个列举的对象相关的表述“和/或”应被理解为具有相同的含义。

应理解术语“包括(include、includes、including)”、“具有(have、has、having)”、“包含(contain、contains或containing)”的使用，包括其语法等价物通常作为开放式和非限制性的，例如，不排除另外的未列举的元件或步骤，除非另有明确说明或从上下文中理解。

如果术语“约”的使用在数量值之前，则本发明还包括特定数量值本身，除非另有特别说明。如本文所用，除非另有说明或推断，术语“约”是指标称值的±10％变化。

应当理解，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是无关紧要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

此处使用的任何和所有示例或示例性语言，例如“例如”或“包括”仅旨在更好地说明本发明，除非声明，否则不对本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。

实施例

现在通过参考以下实施例，将更容易理解正总体上描述的本发明，仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的包括这些实施例，而不意在限制本发明。

实施例1-AAV载体和从载体产生的rAAV

AAV载体

构建了包含由两个AAV2反向末端重复(ITR，SEQ ID NO:15)包围的G6PC表达盒的AAV载体。G6PC表达盒在其G6PC启动子/增强子(GPE)5’末端以Yiu等人,2010,MolecularTherapy[分子疗法]18(6):1076-84中列出的引物序列“1S”及其相关的KpnI限制性内切核酸酶位点界定。通过与SV40基因组和相关的SalI限制性内切核酸酶位点的比对，G6PC表达盒在3’末端以其SV40晚期多聚腺苷酸化信号界定。所有G6PC表达盒都包含GPE、内含子、密码子优化的人G6PC基因和SV40晚期聚A尾，如图1A所示。产生了不同版本的G6PC表达盒，每个版本包含野生型GPE或经修饰的GPE，如图1B所示。G6PC表达盒的元件描述如下。

野生型G6PC启动子/增强子(GPE，SEQ ID NO:6)来自智人，并由RefSeq NG_011808定义。该序列是人G6PC基因的内源性启动子，在肝脏中几乎具有独有活性，而在肾脏中的活性极低。野生型GPE包含3个Alu元件，位于SEQ ID NO:6的连续核苷酸1079-1272(Alu-1)、1633-1968(Alu-2)和2140-2495(Alu-3)处。AAV载体DTC161包含G6PC表达盒，其中包含野生型GPE。AAV载体DTC175包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中缺失了Alu-1和Alu-2序列的GPE。AAV载体DTC176包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中Alu-1和Alu-2的取向是反向的GPE。AAV载体DTC177(由SEQ ID NO:1表示)包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中缺失了Alu-1、Alu-2和Alu-3序列的GPE。AAV载体DTC178含有G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中缺失了Alu-3序列的GPE。AAV载体DTC179包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中Alu-3序列的取向是反向的GPE。

嵌合内含子(SEQ ID NO:13)由来自人β-珠蛋白基因第一内含子的5’-供体位点和来自免疫球蛋白基因重链可变区的内含子的分支和3’-受体位点构成。供体和受体位点的序列以及分支点位点已被更改以匹配用于剪接的共有序列(CI-neo MammalianExpression Vector Technical Bulletin[CI-neo哺乳动物表达载体技术通报]TB215，Promega Life Sciences Corporation[普洛麦格生命科学公司])。嵌合内含子的目的是提高基因表达。

G6PC cDNA(SEQ ID NO:4)来自智人，并且针对在人细胞中的表达进行了密码子优化。可以使用专有的OptimumGene^TM密码子优化技术(金斯瑞公司(GenScript)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)对人G6PC cDNA进行密码子优化。可以检查优化的cDNA序列并进一步修饰，以从理论上可以编码9个或更多个氨基酸长度的肽的内部非框ATG序列中消除潜在的替代阅读框(ARF)。例如，密码子优化的G6PC cDNA由SEQ ID NO:3表示。

猿猴病毒40(SV40)晚期聚腺苷酸化信号(Genbank#J02400，SEQ ID NO:14)提供了顺式序列，用于G6PC mRNA的有效聚腺苷酸化。该元件用作新生转录物3’末端特定切割事件并添加长聚腺苷酸尾的信号。

每个G6PC表达盒都被克隆到AAV载体中。所有AAV载体都具有编码卡那霉素抗性基因的骨架。AAV载体DTC161(pDTX.hG6PCco.401)示于图2中为例。

rAAV病毒粒子

AAV载体基因组是单链DNA基因组。只有ITR序列之间的和包含ITR序列的序列被包装到AAV病毒粒子中。病毒粒子是通过将三种质粒转染到人胚胎肾293(HEK293)细胞中产生的，这些细胞提供E1a和E1b基因产物。第一质粒是本文所述的AAV载体。第二质粒是pAAV2-8.KanR(p2123-FH)，其是包含野生型AAV2 rep和AAV8 cap基因的包装质粒。第三质粒是pAdDeltaF6(Kan)，其是辅助腺病毒质粒。

腺相关Rep/Cap质粒pAAV2/8.KanR(p2123-FH)(8354bp)编码四种野生型AAV2病毒复制(Rep)蛋白和来自血清型8的三种野生型AAV VP衣壳(cap)蛋白。pAAV2/8.KanR(p2123-FH)质粒的图解显示于图3中。在质粒中，通常驱动Rep基因表达的AAV p5启动子已从Rep区域的5’末端移动到AAV8 cap区域的3’末端。这种排列在启动子和Rep基因之间引入了间隔区(即，质粒骨架)，导致Rep表达的下调和支持高滴度rAAV生产的能力的增加。卡那霉素抗性基因和MB1起点都被包括用于大肠杆菌中的质粒生产。

质粒pAdDeltaF6(Kan)包含对AAV复制很重要的腺病毒基因组区域，即E2A、E4和VARNA(图4)。腺病毒E1功能也是必需的，但由HEK293宿主细胞提供。所述质粒不包含其他腺病毒复制、结构基因或对腺病毒复制至关重要的顺式元件，例如腺病毒ITR，因此，预计不会产生感染性腺病毒。卡那霉素抗性基因和MB1起点都被包括用于大肠杆菌中的质粒生产。

实施例2-Alu元件缺失提高rAAV产量

含有野生型GPE或经修饰的GPE的AAV载体用于用上述Rep/Cap质粒和辅助质粒转染HEK293细胞。

经修饰的GPE中Alu元件缺失(在DTC175、DTC177和DTC178载体中)或Alu元件在方向上反向(在DTC176和DTC179载体中)。DTC175病毒载体包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中缺失了Alu-1和Alu-2序列的GPE，DTC176病毒载体包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含GPE，其中所有三个Alu元件均存在，但Alu-1和Alu-2序列的取向是反向，DTC177病毒载体包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中缺失了Alu-1、Alu-2和Alu-3序列的GPE，DTC178病毒载体包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含其中缺失了Alu-3序列的GPE，以及DTC179病毒载体包含G6PC表达盒，所述G6PC表达盒包含GPE，其中所有三个Alu元件均存在，但Alu-3序列的取向是反向)。

共转染后第5天，将感染的细胞在含有脱氧胆酸钠和的裂解缓冲液中于37℃裂解2小时。然后将样品上清液依次用DNA酶I和蛋白酶K消化以释放rAAV基因组DNA。然后使用TaqMan qPCR扩增AAV载体的BGH-聚A编码区，以根据rAAV质粒标准曲线确定rAAV基因组拷贝数(GC)。图5是显示转染各种AAV载体后从宿主细胞产生的rAAV滴度的柱形图。如、图5显示了通过qPCR测量的rAAV滴度，并且表明与包含野生型GPE的DTC161相比，从GPE(在DTC175、DTC177和DTC178载体中)中缺失一个或多个Alu元件显著增加了rAAV产量。然而，与DTC161相比，使一个或多个Alu元素反向(在DTC176和DTC179载体中)并没有提高rAAV产量。病毒产量的量化总结在表1中。如表1所示，从GPE中缺失一个或多个Alu元素可显著提高rAAV产量。显示作为载体基因组大小的函数作图的所产生的rAAV滴度的第二分析呈现为图6中的图。如图6显示具有最小大小的载体基因组DTC177(由SEQ ID NO:1表示)产生最高滴度。

表1：转染AAV载体(DTC161、DTC175、DTC176、DTC177、DTC178或DTC179)后HEK293细胞产生的病毒产量的定量总结。

实施例3-Alu元件缺失改善rAAV包装

为了评估缺失一个或多个Alu元件是否影响rAAV的包装，收获如实施例2中所述产生的rAAV并从每个rAAV(从对照病毒载体DTC161、DTC175、DTC176、DTC177、DTC178或DTC179产生)中分离总DNA。大约7.12x10¹⁰总量的每个rAAV GC进行琼脂糖凝胶电泳，然后用SYBRGold染色。本实验中使用的对照病毒载体是AAV8-LSP-hFIXco3-WPRE-pA(在威洛克公司(Virovek)生成，定制纯化，目录/批号061015的150282)，它提供了凝胶上已知的DNA大小迁移，并确认了实验方法能够破坏AAV衣壳的完整性并释放包装的DNA。

如图7所示，全长病毒DNA在3.8kb-5kb之间。“*”表示衣壳降解和用十二烷基硫酸钠(SDS)处理后从对照病毒载体中分离的全长DNA的完整基因组。

观察到从GPE中缺失了一个或多个Alu元件的DTC177、DTC175和DTC178的rAAV中分离的全长DNA的染色强度更高(参见图7)。这一结果表明，缺失至少一个Alu元件可提高全长病毒基因组的rAAV包装。此外，针对DTC161和DTC177颗粒的超速离心机迹线分析了空(出现在大约60S)和包含全载体DNA的颗粒(出现在大约100S)，分别表明缺失Alu元件的构建体产生了更高百分比的完整颗粒(参见图8A-8B)。图8A是显示来自HEK293细胞中产生的DTC161载体制剂的颗粒密度的分析超速离心迹线的图。图8B是显示来自HEK293细胞中产生的DTC177载体(由SEQ ID NO:1表示)制剂的颗粒密度的分析超速离心迹线的图。

这些数据表明在缺乏Alu序列的载体中出现了提高的包装。

实施例4-GPE中Alu元件的缺失不影响启动子效力

为了评估一个或多个Alu元件的缺失是否影响GPE在体内指导G6PC基因表达的效力，使用衍生自不同载体的rAAV(如表2所示)感染HuH7肝脏细胞。感染48小时后，裂解细胞并收获总mRNA。通过定量RT-PCR分析G6PC mRNA表达。图9A-9B显示了对于衍生自DTC161和DTC177(由SEQ ID NO:1表示)的rAAV在HuH7肝细胞中rAAV剂量和G6PC mRNA表达水平之间的示例性剂量应答曲线。图9A是在感染含有DTC161的rAAV后诱导的G6P酶-α表达的剂量-应答曲线。图9B是在感染包含DTC177(由SEQ ID NO:1表示)的rAAV后诱导的G6P酶-α表达的剂量-应答曲线。为了计算测试样品的相对效力，将参考标准(衍生自开发批次生产的DTC161载体的rAAV)和测试样品在每个感染复数(MOI)下的RNA值(基因组拷贝数/μg总RNA)为添加到GraphPad Prism文件模板。所述模板使用数据的对数-对数变换和线性拟合，所述线性拟合受到约束，因此曲线具有共享斜率。Y轴对应于RNA值，X轴对应于样品的MOI。GraphPadPrism模板生成的Y截距和斜率数据用于通过实施以下公式来确定参考标准和测试样品的X截距：X Int＝(0-[Y截距])/斜率。最终的相对效力值通过使用以下公式比较X截距来确定：10^{[X截距参考]-[X截距样品]。

表2.在每个rAAV样品中GPE的相对效力总结。

该结果表明，缺失GPE中的一个或多个Alu元件(在DTC175、DTC177和DTC178载体中)不会损害GPE在体内驱动G6PC基因表达的效力。

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