具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备(3S)-1,1-二羟甲基-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

往10mL二氯甲烷中加入2g(7.2mmol)L-色氨酸苄酯，充分搅拌使其溶解。冰浴条件下，往溶液中缓慢滴加1mL三氟醋酸。然后再往该溶液中加0.78g(8.6mmol)1,3-二羟基丙酮，室温反应7小时。TLC显示L-色氨酸苄酯消失(二氯甲烷/甲醇：30:1)。冰浴条件下，往溶液中加入50mL饱和NaHCO₃溶液，充分搅拌，然后留下二氯甲烷层，再用饱和NaHCO₃溶液(30mL×3)洗，再用饱和NaCl溶液(30mL×3)洗，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩得到2.03g(77％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/e):367[M+H]⁺。

实施例2制备3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)

往5mL无水丙酮中加入0.2g(0.55mmol)(3S)-1,1-二羟甲基-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)。在冰浴条件下，往里加入100μL浓硫酸，之后，室温搅拌3小时。TLC显示化合物1消失(石油醚/乙酸乙酯，4:1)。冰浴条件下，用饱和NaHCO₃溶液调节反应液pH值为7，得到的溶液减压浓缩除去丙酮，残留液再加乙酸乙酯萃洗3遍，乙酸乙酯层用饱和NaCl溶液洗至中性。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩得到的棕黄色固体，经柱层层析分离(石油醚/乙酸乙酯，4:1)得到0.08g(35.8％)标题化合物，为白色国体。ESI-MS(m/e):407[M+H]⁺。

实施例3制备3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(3)

往10mL甲醇中加入0.20g(0.5mmol)3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)和0.02g Pd/C。搅拌并通12h氢气，TLC显示化合物2消失(石油醚/乙酸乙酯，4:1)。过滤除去钯碳(Pd/C)，滤液减压浓缩。残留物用乙醚磨洗，得到0.14g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):317[M+H]⁺。

实施例4制备3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The-OBzl(4)

往20mL四氢呋喃中加入0.19g(0.6mmol)3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(3)，0.15g(0.72mmol)N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.09g(0.72mmol)1-羟基苯并三唑(HOBt)。冰浴下搅拌30分钟。之后，再向反应液中加入0.20g(0.66mmol)HCl·The-OBzl。之后，向反应液中滴加N-甲基吗啉(NMM)调节反应液的pH值为9。室温搅拌6小时，TLC显示化合物3消失(二氯甲烷/甲醇，30/1)。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩，得到的残留物用30mL乙酸乙酯溶解，溶液再过滤除去DCU。滤液依次用5％NaHCO₃水溶液萃洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，5％KHSO₄水溶液洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，5％NaHCO₃水溶液洗(15mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(15mL×3)，用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩，得到的黄色粉末经硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯，10/1)，得到0.27g(80％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):563[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝10.94(s,1H),8.28(t,J＝7.2Hz,1H),7.79(s,1H),7.37(m,6H),7.07(m,1H),7.02(m,1H),5.16(s,1H),5.12(s,1H),4.40(m,1H),4.21(m,1H),3.99(m,1H),3.75(m,1H),3.61(m,2H),3.02(m,2H),2.12(m,2H),1.82(m,2H),1.65(s,3H),1.42(s,3H),1.22(m,2H),1.01(m,3H)。

实施例5制备3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The(5)

往10mL甲醇中加入0.28g(0.5mmol)3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The-OBzl(4)和0.02g钯碳(Pd/C)。搅拌并通12h氢气，TLC显示化合物4消失(二氯甲烷/甲醇，30/1)。过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩。残留物用乙醚磨洗，得到0.21g(90％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e):473[M+H]⁺，¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝10.98(s,1H),8.18(d,J＝7.5Hz,1H),7.79(s,1H),7.40(dt,J₁＝4.8Hz,J₂＝8.1Hz,2H),7.02(td,J₁＝8.1Hz,J₂＝4.8Hz,2H),4.40(m,1H),4.28(m,1H),4.12(m,1H),4.02(m,1H),3.81(m,1H),3.61(m,1H),3.02(m,2H),2.14(m,2H),1.82(m,2H),1.65(s,3H),1.41(s,3H),1.22(m,2H),1.03(m,3H)。

实施例6制备Boc-Gly-Glu(OBzl)-OBzl

采用实施例4的方法，从0.88g(5mmol)Boc-Gly和2.00g(5.5mmol)Hcl·Glu(OBzl)-OBzl得到1.93g(80％)标题化合物，为无色固体。

实施例7制备HCl·Gly-Glu(OBzl)-OBzl

冰浴下将1.45g(3mmol)Boc-Gly-Glu(OBzl)-OBzl用20mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)溶解并反应4小时。TLC监测显示反应完全(体系为二氯甲烷/甲醇，30/1)。反应混合物减压浓缩，残留物用无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液再减压浓缩。该操作重复3次。得到的白色粉末样物质用无水乙醚充分磨洗，得到1.14g(90％)标题化合物，为无色固体。

实施例8制备Boc-His(Boc)-Gly-Glu(OBzl)-OBzl

采用实施例4的方法从1.77g(5mmol)Boc-His(Boc)和2.52g(6mmol)HCl·Gly-Glu(OBzl)-OBzl得到2.56g(67％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):722[M+H]⁺。

实施例9制备HCl·His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl

采用实施例7的方法从1.44g(2mmol)Boc-His(Boc)-Gly-Glu(OBzl)-OBzl得到1.03g(92％)标题化合物，为无色固体。

实施例10制备3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl(6)

往30mL无水四氢呋喃中加入0.47g(1mmol)3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The(5)、0.25g(1.2mmol)DCC和0.16g(1.2mmol)HOBt，冰浴下，搅拌30分钟。之后，向反应液中加入0.62g(1.1mmol)HCl·His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl。滴入N-甲基吗啉(NMM)调节反应液的pH值为9。室温反应8小时。TLC显示化合物5消失(二氯甲烷/甲醇，15/1)，滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩。残留物用100mL乙酸乙酯溶解，溶液再过滤除去DCU。滤液依次用5％NaHCO₃水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，5％KHSO₄水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，5％NaHCO₃水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩，得到黄色粉末，经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，15/1)，得到0.71g(70％)标题化合物，为黄色粉末。ESI-MS(m/e):977[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝10.99(s,1H),8.35(m,1H),8.27(m,1H),8,16(m,1H),7.79(m,1H),7.49(m,2H),7.35(m,12H),7.00(m,2H),5.13(s,2H),5.06(s,2H),4.41(m,2H),4.21(m,1H),4.02(m,1H),3.81(m,1H),3.65(m,2H),3.04(m,3H),2.92(m,2H),2.44(m,2H),2.09(m,2H),1.95(m,2H),1.85(m,2H),1.72(m,2H),1.62(s,3H),1.39(s,3H),1.23(m,2H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)。

实施例11制备3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The-His-Gly-Glu(7)

往10mL甲醇中加入0.048g(0.05mmol)3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl的制备(6)和0.005gPd/C，搅拌并通12h氢气，TLC显示化合物6消失(乙酸乙酯:水:冰醋酸，4:1:1)。过滤除去钯碳(Pd/C)，滤液减压浓缩。残留物用乙醚磨洗，得到0.033g(85％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):795[M-H]^-，¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝10.96(s,1H),8.34(m,1H),8.29(m,1H),8,15(m,1H),8.02(m,1H),7.79(m,1H),7.54(s,1H),7.39(m,1H),7.04(m,1H),6.98(m,1H),6.83(s,1H),4.44(m,3H),4.24(m,2H),4.12(m,2H),4.02(m,1H),3.03(m,3H),2.93(m,2H),2.27(m,2H),2.07(m,2H),1.93(m,2H),1.84(m,2H),1.62(s,3H),1.39(s,3H),1.20(m,2H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝173.64,171.83,171.80,171.67,169.31,135.22,120.62,119.33,118.23,111.76,109.32,98.15,64.75,53.92,51.57,42.55,33.80,32.24,30.79,29.60,22.97,22.91,15.17。

实施例12评价化合物7抑制肿瘤增长的活性

实验动物：

ICR小鼠，雄性，20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

给药剂量及给药方式：

本发明的化合物3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The-His-Gly-Glu(化合物7)的口服剂量为0.23μmol/kg，阳性对照阿霉素的注射剂量为2μmol/kg，阴性对照为生理盐水。

实验方法：实验采用S180移植性小鼠肉瘤模型。

实验操作：

于无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1.5×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.1mL/10g/只，制造S180荷瘤小鼠。7天后小鼠右侧腋下长出绿豆大小的实体瘤,按照肿瘤体积将小鼠随机分组,使各组小鼠的肿瘤体积均匀分布。随后开始给药，共给药10次。第17天后，乙醚麻醉小鼠，脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，瘤重用表示，经t-test统计学方法进行组间差异的比较。

实验结果：

实验结果列入表1：

表1.化合物7抑制肿瘤增长的活性

注：n＝12，阿霉素为腹腔注射给药，其他均为灌胃方式给药，经t检验；a)与生理盐水组相比P<0.01且与阿霉素组相比，P>0.05.

结果表明，0.23μmol/kg剂量下口服化合物7治疗的小鼠的体内抗肿瘤瘤重(1.82±0.86g)与阴性对照组生理盐水有显著性差别(3.31±0.73g，P<0.01)；且与阳性对照组阿霉素组没有显著性差别(1.69±0.28g，P>0.05)。可见，化合物7在口服剂量低至0.23μmol/kg时，只有阿霉素腹腔注射剂量的约1/10时，仍具有抑制小鼠肿瘤增长的活性，说明本发明具有突出的技术效果。

实施例13用Transwell小室实验评价化合物7抑制肿瘤细胞迁移的能力

实验方法：

取生长状态良好处于对数生长期的A549细胞，0.25％胰酶消化，镜下观察，加入血清终止消化并3000rpm离心3min，计数，配成单细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入化合物7的溶液，使终浓度为20μM。下室加入600μL的含10％FBS的1640培养基，在37℃和5％CO2培养箱中培养6小时，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色15min，吸除染色液，用PBS洗3次，在每个小室选取9个视野进行拍照并计数，细胞数以表示。

实验结果：

实验结果列入表2：

表2化合物7抑制A549细胞迁移的活性

注：n＝6，给药方式均为灌胃，经t检验，a)表示与PBS组相比P<0.01且与RGDS组相比P<0.01.

结果表明，加入化合物7的组别的细胞迁移数(153.56±22.65)与阴性对照组生理盐水有显著性差别(243.00±44.92，P<0.01)且与阳性对照组RGDS也有显著差别(193.77±14.78，P<0.01)，可见，20μmol/L浓度的化合物7可抑制人非小细胞肺癌细胞A549的迁移，并较同浓度下的RGDS抑制癌细胞迁移活性更好。

实施例14用Transwell小室实验评价化合物7抑制肿瘤细胞侵袭的能力

实验方法：

包被基质胶：预先将保存在-20℃冰箱中呈黄色固态的Matrigel基质胶置于4℃冰箱约12h使之成为粉红色具有良好流动性的液态。尽快取240μL Matrigel基质胶加入到960μL相应肿瘤细胞所需的无血清培养基中，吹打将其稀释5倍分散均匀，上室每孔加100μL后于37℃，5％CO₂的细胞孵箱中孵育5h，使基质胶均匀铺至聚碳酸酯膜小孔中。

水化基底膜：使用移液枪小心吸除上室残液，加入50μL相应无血清培养基，再次于37℃，5％CO2的细胞孵箱中孵育30min后，使用移液枪小心吸除上室残液备用。

取生长状态良好处于对数生长期的A549细胞，0.25％胰酶消化，镜下观察，加入血清终止消化并3000rpm离心3min，计数，配成单细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入化合物7的溶液，使终浓度为20μM。下室加入600μL的含10％FBS的1640培养基，，置于37℃5％CO2的细胞孵箱内培养(A549细胞培养12h)，待各细胞株所需时间过后进行后处理，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色15min，吸除染色液，用PBS洗3次，在每个小室选取9个视野进行拍照并计数，细胞数以表示。

实验结果：

实验结果列入表3：

表3化合物7抑制A549细胞侵袭的活性

注：n＝6，给药方式均为灌胃，经t检验；a)表示与空白对照组相比P<0.01且与RGDS组相比P>0.05.

结果表明，加入化合物7的组别的细胞侵袭数(197.78±26.00)与阴性对照组生理盐水有显著性差别(252.78±17.49，P<0.01)，且与阳性对照组RGDS的抑制细胞侵袭数(205.33±24.78，P>0.05)无显著性差异。可见，20μmol/L浓度的化合物7可抑制人非小细胞肺癌细胞A549的侵袭，并与同浓度下的RGDS的抑制癌细胞侵袭的活性相当。

实施例15评价化合物7抑制小鼠肿瘤转移的活性

实验动物：

C57BL/6小鼠，雄性，20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

给药剂量及给药方式：

本发明的化合物3S-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-The-His-Gly-Glu(化合物7)的口服剂量为0.23μmol/kg，阳性对照RGDS四肽的注射剂量为20μmol/kg，阴性对照为生理盐水。

实验方法：实验采用小鼠Lewis抗肺癌转移模型。

实验操作：

Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养基，其中含10％经灭活的胎牛血清，1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好，处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至2×10⁷个/mL，胎盘蓝(Tryanblue)染色计数，活细胞数>95％。取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液0.2mL/只。小鼠接种后10天可以长出直径约4-5mm的肿瘤，作为瘤源备用。

取接种8-10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，乙醚麻醉，脱颈椎处死，用75％的乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的肿瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g):生理盐水体积(mL)为1:3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目细胞筛制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度为2×10⁷个/mL，胎盘蓝染色计数，活细胞数>95％。

取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液0.2mL/只。接种10天后长出直径约4-5mm的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积随机分组，

从接种肿瘤第10天后开始给药，共给药10次，每隔两天测量并记录肿瘤体积。第22天后，乙醚麻醉小鼠，脱颈椎处死，取出肿瘤称重，并记录肿瘤的肺部转移率和转移瘤结数。

实验结果：

实验结果列入表4：

表4化合物7抑制肿瘤肺转移的活性

注：n＝12，RGDS为腹腔注射给药，其他均为灌胃方式给药，经t检验；a)与生理盐水组相比，P<0.05且与RGDS组相比，P<0.05.

结果表明，0.23μmol/kg剂量下口服化合物7治疗的小鼠的体内抗肿瘤转移瘤结数(2.80±2.53)与阴性对照组生理盐水有显著性差别(9.38±2.62，P<0.05),且与阳性对照组RGDS也有显著性差别(4.50±2.25，P<0.05)可见，化合物7在口服剂量低至0.23μmol/kg时较腹腔注射剂量为20μmol/kg/天的RGDS的抑制肿瘤转移的活性更好。可见,本发明有突出的技术效果。