具体实施方式

以下，对用于实施本发明的方式进行详细地说明。本发明不限定于以下的实施方式，可以在其主旨的范围内进行各种变形来实施。

本发明的线粒体功能改善剂含有属于香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)或乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的乳酸菌、该乳酸菌的培养物、或该乳酸菌的培养上清液。

本说明书中，关于本发明的线粒体功能改善剂含有属于香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)或乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的乳酸菌(以下，本说明书中，有时总称为“本发明的乳酸菌”。)，只要含有本发明的乳酸菌就没有特别限定。

即，可以在悬浮液的状态下包含本发明的乳酸菌，也可以分离并包含本发明的乳酸菌。

另外，可以包含在培养本发明的乳酸菌时得到的培养上清液。

本发明中，属于香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)或乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的乳酸菌只要是依据国际细菌命名法规分类为香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)或乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的细菌就没有特别限定。

作为香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)，没有特别限定，例如可列举出香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)OLL204082株。

作为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，没有特别限定，例如列举出乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)OB7260株。

香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)OLL204082和乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)OB7260是于2018年2月14日(保藏日)在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)分别作为保藏编号NITE BP-02635、NITE BP-02634而进行了基于布达佩斯条约的国际保藏的乳酸菌。

本说明书中，关于本发明的线粒体功能改善剂含有属于香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)或乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的乳酸菌的培养物(以下，本说明书中，有时总称为“本发明的乳酸菌的培养物”。)，只要含有本发明的乳酸菌的培养物就没有特别限定。

本发明的乳酸菌的培养物中，可以包含本发明的乳酸菌，也可以利用过滤、透析、沉淀、离心分离等公知的方法去除了本发明的乳酸菌。

本发明的乳酸菌的培养物中包含本发明的乳酸菌时，可以以活菌的形式包含，也可以以死菌的形式包含。

另外，本发明的乳酸菌的培养物中，可以包含用于培养本发明的乳酸菌的培养基成分，也可以去除了一部分。

可以直接含有本发明的乳酸菌的培养物，可以进行浓缩并包含，可以以液体的形式包含，可以以固体的形式包含。

作为本发明的乳酸菌的培养物，可以是在培养本发明的乳酸菌时得到的培养上清液。本发明的线粒体功能改善剂可以包含在培养本发明的乳酸菌时得到的培养上清液。

本发明中，本发明的乳酸菌的培养物可以通过培养本发明的乳酸菌而得到。

用于培养本发明的乳酸菌的培养基没有特别限定。另外，本发明的乳酸菌的培养方法也没有特别限定。

本发明的线粒体功能改善剂能够在线粒体功能已经降低的细胞中改善线粒体的功能，由此使细胞活化，因此能够用于代谢功能改善、寿命延长、抗衰老、运动能力降低改善、肌力降低抑制用途、神经系统异常恢复、及认知功能改善等用途。

本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液还可以用于改善线粒体的功能。

本发明可以是让对象摄取本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液来改善该对象中的线粒体的功能的方法。

本发明中，可以以让对象进行摄取而进行该对象中的代谢功能改善、寿命延长、抗衰老、运动能力降低改善、肌力降低抑制用途、神经系统异常恢复、或认知功能改善的目的，来使用本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液。

本发明可以是让对象摄取本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液以进行该对象中的代谢功能改善、寿命延长、抗衰老、运动能力降低改善、肌力降低抑制用途、神经系统异常恢复、或认知功能改善的方法。

本发明可以是让对象摄取本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液来治疗或预防与该对象中的线粒体的功能相关的疾病的方法。

作为与线粒体的功能相关的疾病，可列举出代谢功能异常、低寿命、衰老、运动能力降低、肌力降低、神经系统异常、及认知功能降低等。

本发明的线粒体功能改善剂可以用作饮食品、补充剂、药物或化妆品。

饮食品、补充剂、药物或化妆品可以用于人，也可以用于宠物、家畜。

本说明书中，药物是还包括准药物的概念。另外，本说明书中，化妆品也可以是包含本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液的药用化妆品。

本发明中，线粒体功能改善剂也可以与用于代谢功能改善、寿命延长、抗衰老、运动能力降低改善、肌力降低抑制用途、神经系统异常恢复、及认知功能改善等用途的其它成分组合使用。

作为其它成分，可以进行适宜选择。

本发明的线粒体功能改善剂在用作化妆品时，其形态没有特别限定，可以是乳液、乳霜、水溶液、面膜等。

化妆品组合物中，可以含有化妆品中使用的各种成分，作为各种成分，没有特别限定，例如可列举出油性成分、乳化剂、保湿剂、增稠剂、药用成分、防腐剂、颜料、粉体、pH调节剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂和香料等，其配混量也没有特别限定。

本发明的线粒体功能改善剂用作药物(包括准药物)时，作为药物、药物制剂和/或药物组合物，可以经口或非经口地进行给予。

经口给予中，可以使用片剂、胶囊、包衣片剂、锭剂、溶液或悬浮液等液剂之类已知的给予用剂型。

非经口给予可列举出：通过注射向静脉内、肌肉或皮下进行给予；使用粉末、滴剂、喷雾或气溶胶等经鼻腔、口腔等的经粘膜给予；使用乳霜或栓剂等的直肠给予；使用贴片、擦剂或凝胶等的经皮给予等。

给予途径优选为经口给予或利用注射进行的静脉内给予。

将本发明的线粒体功能改善剂用作药物制剂和/或药物组合物时，可以适宜根据给予形态等包含本领域技术人员众所周知的适合的药学上可接受的载体。

作为药学上可接受的载体，没有特别限定，例如可列举出抗氧化剂、稳定剂、防腐剂、矫味剂、着色料、溶解剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、消泡剂、粘度调节剂、凝胶化剂、吸收促进剂、分散剂、赋形剂和pH调节剂等。

本发明中，本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液的给予量和给予计划可以依赖于每个治疗对象的需要量、治疗方法、疾病或必要程度等进行调整。

给予量具体而言可以根据年龄、体重、一般的健康状态、性别、饮食、给予时间、给予方法、排泄速度、药物的组合和患者的病状等来确定，进而，还可以考虑其它因素来确定。

本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液优选包含可以发挥期望的效果的有效的量。

本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液的1天给予量根据对象的状态和体重、化合物的种类、给予途径等而不同，非经口给予的情况，通常约为0.01～1000mg/人/天、优选为0.1～500mg/人/天，另外，经口给予的情况，通常约为0.01～5000mg/人/天、优选为0.1～3000mg/人/天。

将本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液让需要其的对象摄取时，需要其的对象没有特别限定，为哺乳类(也称为哺乳动物)或鸟类，优选为人，但也可以是宠物、家畜等。

对象也可以患有线粒体功能欠佳或线粒体功能障碍之类的与线粒体功能相关的疾病。

将本发明的线粒体功能改善剂用作饮食品时，其形态没有特别限定。例如，本发明中，将本发明的线粒体功能改善剂用作营养辅助食品、补充剂是适合的。

将本发明的线粒体功能改善剂用作饮食品时，本发明的乳酸菌、其培养物、及其培养上清液的1天给予量根据对象的状态和体重、化合物的种类、给予途径等而不同，通常约为10～1000g/人/天、优选为50～200g/人/天。

饮食品组合物中，可以含有饮食品中使用的各种成分，作为各种成分，没有特别限定，例如可列举出油性成分、乳化剂、保湿剂、增稠剂、药效成分、防腐剂、颜料、粉体、pH调节剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂和香料等，其配混量也没有特别限定。

作为饮食品，例如可以用作发酵茶、发酵乳、酸奶、乳酸菌饮料、发酵香肠、干酪、豆酱、泡菜、咸菜、盐曲之类的发酵饮食品。

本发明中，可以将本发明的线粒体功能改善剂用于宠物用途，用作宠物化妆品、宠物药物、宠物食品、哺乳类或鸟类等动物用的营养辅助食品/补充剂之类的宠物饮食品是适合的。另外，可以将本发明的线粒体功能改善剂用于家畜用途，也可以用作家畜用化妆品、家畜用药物、家畜饲料之类的家畜用饮食品。

本发明中，作为宠物、家畜，没有特别限定，例如可列举出狗、猫、鸟、兔子、豚鼠、羊、牛、马、猪，也可以是爬行类、两栖类。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行进一步具体地说明，但本发明不限定于以下的实施例。另外，在不脱离本发明的技术的思想的范围内可以进行各种变更。

实施例1

(1)乳酸菌的培养物的制备

分别将香肠乳杆菌OLL204082株、乳酸片球菌OB7260株、罗伊氏乳杆菌MEP201805株在利用Aneropack(三菱瓦斯化学株式会社制“Aneropack/Kenki”)实现的厌氧条件下、在MRS液体培养基(Difco Laboratories公司制“Lactobacilli MRS Broth”型号：#288130)中培养18小时。对于培养温度，OLL204082株和OB7260株为30℃、MEP201805株为37℃。将5mL的培养液以2330g进行10分钟离心分离，然后去除上清液4.25mL。用残留的上清液将沉淀悬浮，作为对小鼠的给予物。另外，作为对照，也将MRS液体培养基作为给予物。

(2)动物试验

将依据Cell Metabolism 7,312-320(2008)制作的Ndufs4(NADH dehydrogenaseiron-sulfur protein 4，NADA脱氢酶铁-硫蛋白4)KO小鼠分成如下组。同时标记各组中的n数。

自断奶时(约3周)起至出生后50天为止的4周，对各组进行乳酸菌的培养物或MRS液体培养基的给予。给予量为150μL/只/天，给予频率为每周5-6次，给予方法是使用了胃管的强制经口给予。

1.无给予组(无处置)(n＝11)

2.MRS液体培养基给予组(对照)(n＝6)

3.香肠乳杆菌OLL204082株给予组(n＝8)

4.乳酸片球菌OB7260株给予组(n＝7)

5.罗伊氏乳杆菌MEP201805株给予组(比较例)(n＝6)

(3)评价项目

测定了小鼠直至死亡为止的出生后天数、出现敲击为止的出生后天数。将测定结果分别示于图1和图2。敲击是小鼠伴随神经异常的发展而采取的特征性行为(FoodFunct.,4,1776-1793(2013))。

(4)统计分析

统计分析利用在线网站Oasis2(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)。

结果

通过给予香肠乳杆菌OLL204082株的培养物或乳酸片球菌OB7260株的培养物，从而与MRS液体培养基给予组(对照)相比，Ndufs4 KO小鼠的寿命显著延长(图1、P＝0.0344,0.0844T-TEST)。

另外，通过给予香肠乳杆菌OLL204082株的培养物或乳酸片球菌OB7260株的培养物，敲击的发生时期与MRS液体培养基给予组(对照)相比显著延迟(图2、P＝0.03,0.01T-TEST)。

另一方面，给予罗伊氏乳杆菌MEP201805株的培养物未对寿命的延长和敲击的发生时期产生显著的影响(图1、p＝0.247T-TEST、及图2、p＝0.15T-TEST)。

另外，Ndufs4 KO小鼠是线粒体出现了功能障碍的模型小鼠，通过给予香肠乳杆菌OLL204082株的培养物或乳酸片球菌OB7260株的培养物，从而使小鼠的寿命延长，由此可认为这些乳酸菌株具有改善线粒体功能的效果。

实施例2

确认通过给予多种乳酸菌株对线粒体病模型小鼠的寿命产生的影响。

(1)乳酸菌的培养物的制备

参考实施例1，将各乳酸菌株在利用Aneropack实现的厌氧条件下、在MRS液体培养基中以30℃培养一整夜。将2mL的培养液以2330g进行10分钟离心分离，然后去除上清液1.7mL。用残留的上清液将沉淀悬浮，作为对小鼠的给予物。需要说明的是，在仅OB7260株的前述给予物的基础上，在培养液的离心后去除了全部上清液，用0.3mL的磷酸缓冲生理盐水(PBS)悬浮而制备了给予物(以下记作OB7260株PBS悬浮液)。

(2)动物试验

参考实施例1，自Ndufs4 KO小鼠断奶时(约3周)起至出生后65天为止的4周，对各组进行乳酸菌的培养物或MRS液体培养基的给予。给予量为300μL/只/天，给予频率为每周5-6次，给予方法是使用了胃管的强制经口给予。

1.无给予组(无处置)(n＝20)

2.MRS液体培养基给予组(对照)(n＝13)

3.香肠乳杆菌OLL204082株给予组(n＝12)

4.香肠乳杆菌P1804501株给予组(n＝10)

5.香肠乳杆菌P1804502株给予组(n＝7)

6.乳酸片球菌OB7260株给予组(n＝11)

7.乳酸片球菌P1804503株给予组(n＝9)

8.乳酸片球菌P1804504株给予组(n＝9)

9.乳酸片球菌OB7260株PBS悬浮液给予组(n＝8)

需要说明的是，香肠乳杆菌P1804501株、香肠乳杆菌P1804502株、乳酸片球菌P1804503株和乳酸片球菌P1804504株是株式会社明治从生乳中分离而获得、并保存的乳酸菌株。

(3)评价项目

测定了小鼠直至死亡为止的出生后天数、直至发生敲击为止的出生后天数。将测定结果分别示于图3和图4。

(4)结果

通过给予各乳酸菌株的培养物或OB7260株PBS悬浮液，从而与MRS液体培养基给予组(对照)相比，Ndufs4 KO小鼠的寿命显著延长(图3)。

另外，通过给予各乳酸菌株的培养物或PBS悬浮液，从而敲击的发生时期与MRS液体培养基给予组(对照)相比显著延迟(图4、p<0.05(T-TEST))。

不仅给予香肠乳杆菌OLL204082株和乳酸片球菌OB7260株使小鼠的寿命延长，而且给予香肠乳杆菌和乳酸片球菌的其它乳酸菌株的培养物，也使小鼠的寿命延长，由此可认为属于香肠乳杆菌和乳酸片球菌的乳酸菌具有线粒体功能改善效果。

如前所述，OB7260株培养物给予组和OB7260株PBS悬浮液给予组的寿命均显著长于MRS液体培养基给予组(对照)。此外，培养物给予组的平均寿命为82.6天、PBS悬浮液为72.6天，这两组中，培养物给予组的寿命显著延长(P＝0.096T-TEST)。由以上结果，OB7260使PBS悬浮液给予组的寿命延长，由此可认为将培养物离心分离时的沉淀(以OB7269的活菌体为主成分)具有线粒体改善功能。进而作为沉淀物和上清液的混合物的培养物与PBS悬浮液相比，寿命显著延长，可认为上清液也具有线粒体改善功能。

实施例3

已知线粒体功能障碍与骨骼肌的年龄增长、骨骼肌的异常、肌少症有相关性，因此对健康高龄小鼠的年龄增长对肌力降低的影响进行了确认。

(1)乳酸菌的培养物的制备

与实施例2同样地，将乳酸片球菌OB7260株在由Aneropack实现的厌氧条件下、在MRS液体培养基中以30℃培养一整夜。将2mL的培养液以2330g进行10分钟离心分离，然后去除上清液1.7mL。用残留的上清液将沉淀悬浮，作为对小鼠的给予物。

(2)动物试验

针对22-24个月龄的健康高龄C57BL6J小鼠(雄)，给予乳酸菌的培养物(n＝12)2个月。作为对照，设定了非给予的组。在给予期间结束16天后测定了握力。

(3)评价项目(握力的测定)

对每只的尾巴沿水平方向拉10次，用大鼠/小鼠握力测定器(室町机械株式会社、MK-380CM/F)测定此时的握力，记录最大值。用握力的最大值除以体重，计算出单位体重的握力(kgf/只体重)。将结果示于图5。

(4)结果

与无给予组(无处置)相比，给予了乳酸片球菌OB7260株的培养物的组中，高龄小鼠的单位体重的握力显著提高(p<0.05、T-TEST)。

PCT/RO/134表