一种复合多糖透明质酸钠凝胶及其制备方法
阅读说明：本技术 一种复合多糖透明质酸钠凝胶及其制备方法 (Compound polysaccharide sodium hyaluronate gel and preparation method thereof ) 是由 邹圣灿 姜晓文 王宝群 林莎莎 杨雪 于 2021-01-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种复合多糖透明质酸钠凝胶及其制备方法,属于高分子材料制备技术领域。该方法使用多层次交联方式使海藻酸钠多糖与透明质酸钠同时交联形成复合凝胶,从而得到一种结构稳定的复合物凝胶,具体包括溶解、交联、溶胀、均质等步骤。由本发明技术方案制备的复合多糖透明质酸钠凝胶,具有良好的生物相容性,弹性好,支撑性能高,耐酶解性强,能较好地降低感染、红肿等不良反应。(The invention discloses a compound polysaccharide sodium hyaluronate gel and a preparation method thereof, belonging to the technical field of preparation of high polymer materials. The method uses a multi-level crosslinking mode to simultaneously crosslink sodium alginate polysaccharide and sodium hyaluronate to form composite gel, thereby obtaining the composite gel with stable structure, and the method specifically comprises the steps of dissolving, crosslinking, swelling, homogenizing and the like. The compound polysaccharide sodium hyaluronate gel prepared by the technical scheme of the invention has good biocompatibility, good elasticity, high support performance and strong enzymolysis resistance, and can well reduce adverse reactions such as infection, red swelling and the like.)
技术领域
本发明属于高分子材料制备技术领域，具体涉及一种复合多糖透明质酸钠凝胶及其制备方法。
背景技术
天然透明质酸具有良好的保湿性、润滑性、修复性以及营养作用。天然的透明质酸在体内极易分解、稳定性差，通过先进的交联技术可以使透明质酸具有更加稳定的结构从而获得更好地机械强度及耐酶解性。交联透明质酸凝胶现已成为医学美容中使用最广泛的皮下注射材料，国内外已有多种产品上市，这些产品被用于皮肤抗皱和填充塑型，由于良好的生物相容性和优秀的填充效果，己被越来越多的爱美人士所接受。
现市场上已有的注射用透明质酸钠(HHA)凝胶会在体内代谢，降解时间较短，大多能保持6-12个月的填充效果，需要进行注射，为了维持填充效果，提高其抗酶解性，许多产品选择提高交联剂用量，交联剂本身具有一定毒性，增加交联剂用量也提高了不良反应的发生率，临床应用中的不良反应一般为肿胀、感染、疼痛等。传统的凝胶处理方式为过筛、干燥、制粒，这样形成的凝胶颗粒边缘不够光滑，在注射后易引起红肿等不良反应。因此需要一种有良好的生物相容性、耐酶解性、优异的填充效果以及交联剂含量低的注射凝胶。
多层次交联使用高温交联与低温交联相结合的方式，交联反应中的温度对凝胶成型具有重要作用，高温交联(30-60℃)下制备的凝胶硬，弹性较差。低温交联(4-10℃)下制备的凝胶致密，弹性好，硬度低。这可能是由于温度较低时，凝胶化时间长，聚合体系间物质分布均匀，使得凝胶的拓扑结构完整，从而有更好的弹性。温度高，成胶速度快导致结构分布不均弹性差。温度升高后，使得交联度高，从而得到硬度高的凝胶。所以结合两种温度的优势，可提供一种多层次交联方式，得到机械强度好，粘弹性佳的复合凝胶。
专利CN108774329A提供了一种常规透明质酸钠凝胶的制备方法，制备好的凝胶通过烧结网制成粒径均匀的凝胶颗粒，添加流动相混合后形成双相凝胶，这样制备的凝胶颗粒边缘不平滑，注射部位易发生炎症、感染等。专利CN107522881A制备了一种颗粒均匀平滑的单相透明质酸钠凝胶，单纯以透明质酸钠为原料制备的凝胶不可避免降解周期短这样的问题。专利CN111249172A中提供了一种美容注射凝胶的制备方法，将海藻酸盐溶于水中，作为其中一组分混合其他物质制备了美容注射凝胶用于改善皱纹，皮肤填充等。在这种方法中海藻酸钠不作为主要成分，只是其中一种组分，且制备的凝胶为多组分，在使用前需经比较复杂的步骤混合后才能注射，这样的方式容易混合不均或因其产品污染，不能在最大程度上保证产品能达到的最佳效果及无菌状态。专利CN102911380A提供了一种透明质酸与生物可降解高分子改性材料及制备方法。这种方法中将高分子材料与透明质酸进行接枝形成聚合物，从而使交联结构更加稳固，但这种制备方法繁琐复杂，凝胶中残留试剂很难清除干净，就会引起注射后的一些炎症以及感染等。
因此，总结来看，现有技术主要存在如下问题：市面上多为使用单一原料制备的透明质酸钠凝胶，因降解时间较短，需进行多次注射维持效果，为延长降解时间添加过量交联剂，交联剂过多会引起多种机体不良反应；现有的通过交联反应制备的凝胶通常固定一种交联温度，粘弹性差，支撑力弱。制备成颗粒均一的处理方式常为过筛制粒，这种方法制备的凝胶颗粒表面不够光滑易引起发炎、感染等临床症状。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种复合多糖透明质酸钠凝胶的制备方法，使用多层次交联方式使海藻酸钠多糖与透明质酸钠同时交联形成复合凝胶，从而得到一种结构稳定的复合物凝胶。
本发明的技术方案如下：
一种复合多糖透明质酸钠凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)溶解
将海藻酸钠溶解于质量分数为1-3％NaOH溶液中，使海藻酸钠在NaOH溶液中的质量分数为1-10％，搅拌均匀，加入透明质酸钠粉末，再搅拌均匀，形成混合溶液，使透明质酸钠在混合溶液中的浓度为10-30wt.％；
(2)交联
向步骤(1)的混合溶液中加入交联剂，充分搅拌均匀直至呈透明状，静置于20-50℃的环境中进行热交联反应，交联1-12h，反应结束后置于4-10℃环境中进行冷交联，交联2-48h，得到交联复合凝胶；
(3)溶胀
将制备好的交联复合凝胶分割成小块，放入PBS缓冲液中溶胀，每隔2-5h更换一次PBS缓冲液，直至凝胶pH为6.8-7.5，渗透压为280-350mOsmol/L，得到溶胀倍数为5-20倍的凝胶；
(4)均质
将溶胀结束的凝胶块取出，去除表面多余水分，均质；均质后的凝胶加入质量分数为0.5-5％的未交联的透明质酸钠溶液，继续均质，混合均匀，既得。
在上述技术方案的基础上，溶解步骤中，透明质酸钠的分子量在100-260万道尔顿。
在上述技术方案的基础上，搅拌过程在高速搅拌机中进行，搅拌速度控制在500-2000转/分钟。
在上述技术方案的基础上，交联剂为二乙烯基砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、三羟甲基丙烷三(3-吖丙啶基丙酸酯)、多聚环氧化合物以及京尼平中的一种或多种。
在上述技术方案的基础上，交联剂用量为透明质酸钠含量的5-30％。
在上述技术方案的基础上，PBS缓冲液配方：氯化钠10g、磷酸氢二钠1.6g、磷酸二氢钠0.6g用水定容至1000mL，既得pH约为7.0的PBS缓冲液。
在上述技术方案的基础上，溶胀时凝胶与PBS缓冲液的体积比为1:30-500。
更换PBS缓冲液的目的在于使凝胶吸水溶胀、调节凝胶pH及渗透压。
在上述技术方案的基础上，使用均质机进行均质，均质速度为3000-15000rpm，线速度为10-50s/m。
在上述技术方案的基础上，均质过程中，所使用的透明质酸钠的分子量为50-200万道尔顿。
一种复合多糖透明质酸钠凝胶由上述方法制备而成。
上述的复合多糖透明质酸钠凝胶在制备医用填充材料中的应用。
一种复合多糖透明质酸钠凝胶的注射剂，是将上述的复合多糖透明质酸钠凝胶灌装至预灌封注射器内，湿热灭菌即得。
本发明的有益效果为：
1、使用海藻酸钠与透明质酸钠为主要成分制备复合凝胶，海藻酸钠在凝胶结构中形成一个致密的结构骨架，能够有效阻止酶等生物分子进入凝胶结构中，增强凝胶支撑性能的同时延缓降解时间。
2、海藻酸钠本身的水溶性及生物相容性极佳，用于制备复合凝胶提高了凝胶的生物相容性。
3、通过调节交联剂种类、交联剂用量、体系酸碱度等，可调节凝胶化速度，使海藻酸钠在凝胶化过程中形成结构骨架穿插于凝胶中，凝胶结构更加紧密，不易使生物大分子及小分子进入，制备出的凝胶拥有更好的粘弹性，更强的耐酶解性。
4、使用热交联与冷交联相结合的多层次交联方式，提高凝胶交联度和结构稳定性，同时增加了粘弹性及注射后的支撑力。
5、使用均质的方式将凝胶制成均匀颗粒状，均质能将颗粒细化，使凝胶更加均匀的相互混合，体系更加均匀；同时，均质过程使凝胶增加了粘弹性，也避免了人为过筛后颗粒边缘不够平滑的缺点，降低了临床应用中感染、红肿等不良反应。
6、在均质过程中加入未交联的透明质酸钠溶液作为流动相，提高了凝胶的生物相容性，同时使在注射过程能够更加顺滑。
附图说明
图1为实施例1所得凝胶的皮肤刺激试验和致敏试验图示。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
不同NaOH用量、交联剂的选择以及用量对复合多糖透明质酸钠凝胶抗酶解的影响
配制质量分数为0.5-2％的氢氧化钠溶液30mL，加入1.5g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入300-1000μLBDDE/DVS，均匀搅拌30min后取出静置于30℃水浴中5h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联20h，得到快状凝胶。将快状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀，每隔两小时换一次缓冲液直至凝胶pH在7.0左右，渗透压约为300mOsmol/L，凝胶重量为250g，此时为溶胀终点。将溶胀凝胶利用200目金属筛网筛分成凝胶颗粒，将凝胶颗粒再通过400目筛网筛分，得到最终凝胶，向凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，搅拌均匀后收集最终产品。将产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
测试结果如表1所示：
表1
由表1可知，DVS相较于BDDE毒性较高，所以选择BDDE为交联剂。氢氧化钠过高或过低都会加快凝胶降解。交联剂有一定毒性所以选择适量的交联剂，不能过高。
实施例1
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，加入0.3g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于30℃水浴中5h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联20h，交联完成得到块状凝胶。将块状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀，每隔两小时换一次缓冲液直至凝胶pH在7.0左右，渗透压约为300mOsmol/L，凝胶重量为250g，此时为溶胀终点。溶胀后的凝胶使用均质机均质成颗粒均匀、具有一定粘弹性的复合凝胶，均质时间为30min，均质机速度为7000rpm，线速度为10m/s。向均质后的凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，继续均质20min后收集最终产品。将最终产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
实施例2
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，加入1.5g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于30℃水浴中5h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联20h，交联完成得到块状凝胶。将快状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀，每隔两小时换一次缓冲液直至凝胶pH在7.0左右，渗透压约为300mOsmol/L，凝胶重量为250g，此时为溶胀终点。溶胀后的凝胶使用均质机均质成颗粒均匀、具有一定粘弹性的复合凝胶，均质时间为30min，均质机速度为7000rpm，线速度为10m/s。向均质后的凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，继续均质20min后收集最终产品。将最终产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
实施例3
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，加入1.5g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于30℃水浴中5h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联10h，得到块状凝胶。将块状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀，每隔两小时换一次缓冲液直至凝胶pH在7.0左右，渗透压约为300mOsmol/L，凝胶重量为250g，此时为溶胀终点。溶胀后的凝胶使用均质机均质成颗粒均匀、具有一定粘弹性的复合凝胶，均质时间为30min，均质机速度为7000rpm，线速度为10m/s。向均质后的凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，均质20min后收集最终产品。将最终产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
实施例4
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，加入1.5g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于30℃水浴中10h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联20h，得到块状凝胶。将块状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀，每隔两小时换一次缓冲液直至凝胶pH在7.0左右，渗透压约为300mOsmol/L，凝胶重量为250g，此时为溶胀终点。溶胀后的凝胶使用均质机均质成颗粒均匀、具有一定粘弹性的复合凝胶，均质时间为30min，均质机速度为7000rpm，线速度为10m/s。向均质后的凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，继续均质20min后收集最终产品。将最终产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
实施例5
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，加入1.5g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于30℃水浴中5h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联30h，得到快状凝胶。将快状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀，每隔两小时换一次缓冲液直至凝胶pH在7.0左右，渗透压约为300mOsmol/L，凝胶重量为250g，此时为溶胀终点。将溶胀凝胶利用200目金属筛网筛分成凝胶颗粒，将凝胶颗粒再通过400目筛网筛分，得到最终凝胶，向凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，搅拌均匀后收集最终产品。将产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
对比例1
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，向溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于30℃水浴中5h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联20h，交联完成得到块状凝胶。将快状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀。溶胀后的凝胶使用均质机均质成颗粒均匀、具有一定粘弹性的复合凝胶。向均质后的凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，继续均质均匀后收集最终产品。将最终产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
对比例2
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，加入1.5g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于25℃水浴中交联30h，交联完成得到块状凝胶。将块状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀。溶胀后的凝胶使用均质机均质。向均质后的凝胶中加入25mL浓度为2％的未交联的透明质酸钠溶液(溶剂为PBS缓冲液)，均质均匀后收集最终产品。将最终产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
对比例3
配制质量分数为1％的氢氧化钠溶液30mL，加入1.5g海藻酸钠搅拌均匀，再向混合溶液中加入5.4g透明质酸钠粉末，搅拌均匀至透明状。向上述溶液中加入500μL BDDE，均匀搅拌30min后取出静置于25℃水浴中交联水浴中5h，热交联完成后转移至4℃环境中继续交联20h，交联完成得到块状凝胶，交联完成得到块状凝胶。将块状凝胶分成均匀的小块状，加入800mL已配制好的PBS缓冲液溶胀。溶胀后的凝胶使用均质机均质。均质均匀后收集最终产品，将最终产品灌装至预灌封注射器内，121℃湿热灭菌。
试验测试
(1)复合多糖透明质酸钠凝胶的性能测试
透明质酸钠含量的检测方法来自行标YY/T0962-2014整形手术用交联透明质酸钠。
弹性模量和粘性模量的检测方法如下：使用流变仪，检测温度为25℃，流变仪设定频率为0.25Hz，测定凝胶的弹性模量与粘性模量。
酶降解性能测试检测方法如下：选用透明质酸酶进行降解实验。取复合多糖透明质酸钠凝胶5g，加入30mL的200U/mL的透明质酸酶溶液，加入pH为7.0的PBS缓冲液20mL，置于37℃条件下进行酶解，酶解时间为0-12h，酶解结束后取出离心取上清液，加入30mLPBS缓冲液，采用咔唑法测定葡萄糖醛酸含量，利用公式计算降解透明质酸的含量，取降解透明质酸含量与未降解透明质酸含量的比值为降解率。
溶胀度具体检测方法来自行标YY/T0962-2014整形手术用交联透明质酸钠。分别将约0.2g交联透明质酸钠凝胶置于两个培养皿上。将两个培养皿放入干燥箱中，80℃下恒重后称量，记作m1。滴加水至膨胀，除去多余水分后称量，记作m2。根据以下溶胀度公式计算溶胀度：
测试结果如表2所示：
表2
由表2可知，添加海藻酸钠后凝胶的粘弹性有所提升，交联度好，溶胀度低。同时，还有助于延长凝胶降解时间。
(2)复合多糖透明质酸钠凝胶的皮肤刺激试验和致敏试验
上述实施例2所得的复合多糖透明质酸凝胶依据GB/T 14233.2-2005、GB/T16886.10-2005《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》进行试验。
具体为：按照0.1g/mL的比例加入浸提介质(浸提介质：生理盐水和植物油)浸提，在(37±1)℃，(72±2)h制备实验液，取实验液GB/T 16886.10-2005中规定的试验方法进行。将实验液样品单次直接接触雄鼠背部皮肤24h，将纱布块同法接触作为对照。与接触后(1±0.1h)、(24±2)h、(48±2)h、和(72±2)h，对接触部位红斑、水肿记分，甲酸原发性刺激指数(PII)。试验如图1。结果显示，该复合多糖透明质酸凝胶样品雄鼠原发性刺激指数(PII)为0.0，说明实施例2所制备复合多糖透明质酸凝胶试验液无皮肤致敏反应。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
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