利用生物酶解制备芹菜素的方法
阅读说明：本技术 利用生物酶解制备芹菜素的方法 (Method for preparing apigenin by biological enzymolysis ) 是由 肖业成 魏有何 刘冬敏 廖深刻 吴爱燕 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用生物酶解制备芹菜素的方法,S1、酶解：向反应容器中加入野漆树苷与水或低级醇溶液,混合均匀,加热升温至70℃以上保温,再冷却至60℃以下,加入酸调节pH值,加入复合酶进行酶解反应,复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶,检测野漆树苷是否反应完全,酶解反应完成后升温将复合酶灭火,获得反应液；S2、分离：将反应液过滤,获得芹菜素粗晶,将芹菜素粗晶与醇溶液混合并搅拌至芹菜素粗晶完全溶解,获得复溶液；S3、纯化：复溶液冷却结晶,过滤,获得芹菜素。本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法采用生物酶催化,将野漆树苷水解成芹菜素,操作简单方便,绿色无污染,适合大规模生产。(The invention discloses a method for preparing apigenin by biological enzymolysis, which comprises the following steps of S1: adding rhoifolin and water or a lower alcohol solution into a reaction container, uniformly mixing, heating to a temperature higher than 70 ℃, preserving heat, cooling to a temperature lower than 60 ℃, adding acid to adjust the pH value, adding a complex enzyme to perform an enzymolysis reaction, detecting whether the rhoifolin completely reacts, heating after the enzymolysis reaction is finished, and extinguishing the complex enzyme to obtain a reaction solution, wherein the complex enzyme comprises rhamnosidase and glucosidase; s2, separation: filtering the reaction liquid to obtain apigenin coarse crystals, mixing the apigenin coarse crystals with an alcohol solution, and stirring until the apigenin coarse crystals are completely dissolved to obtain a compound solution; s3, purification: and cooling and crystallizing the redissolution, and filtering to obtain the apigenin. The method for preparing the apigenin by utilizing the biological enzymolysis adopts the biological enzyme catalysis to hydrolyze the rhoifolin into the apigenin, has simple and convenient operation, is green and pollution-free, and is suitable for large-scale production.)
技术领域
本发明涉及芹菜素领域，特别地，涉及一种利用生物酶解制备芹菜素的方法。
背景技术
芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，以植物黄色素的形式存在于多种植物中，主要来源于伞形科植物旱芹，其他植物如洋甘菊、蜜蜂花、紫苏、马鞭草、西洋蓍草中也发现有它的存在。芹菜素的分子式为C15H10O5，分子量为270，熔点345℃～350℃，难溶于水，易溶于热乙醇、二甲基亚砜、稀碱等溶剂。具有舒张血管，降压降脂、抗肿瘤、消炎、抗氧化、预防多种癌症等生物活化。由于芹菜素具有良好的生物活化，故而在功能性食品、医药和化妆品领域具有很广泛的应用前景。
现有的芹菜素制备方法主要有两种：一是直接从植物中提取，二是以黄烷酮为原料半合成。植物提取工艺工序复杂，植物中芹菜素含量低，芹菜素纯化困难，产品是纯度和收率低，从而造成了原材料的过度消耗与浪费，成本太高，不适合规模化生产，因此，在应用过程中因纯度较低，治疗与保健效果不理想。半合成芹菜素是以柚皮素脱氢氧化或者野漆树苷酸解产生。柚皮素脱氢氧化是在碱性环境下，以柚皮素作为原料，在溶剂1,4-二氧环己烷、二甲亚砜、吡啶、二甲基甲酰胺中，50℃～130℃温度下与氧化剂碘反应，脱氢生成芹菜素。该方法使用有毒的有机溶剂和氧化剂，产生有害废水，污染环境，不符合绿色化学理念。野漆树苷酸解是高温条件下发生酸水解反应，具有不易控制、收率较低、能耗高、消耗水量大等缺点。
发明内容
本发明提供了一种利用生物酶解制备芹菜素的方法，以解决现有的芹菜素制备方法工艺复杂、收率低、能耗高的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：S1、酶解：向反应容器中加入野漆树苷与水或低级醇溶液，混合均匀，加热升温至70℃以上保温，再冷却至60℃以下，加入酸调节pH值，加入复合酶进行酶解反应，复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，检测野漆树苷是否反应完全，酶解反应完成后升温将复合酶灭火，获得反应液；S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，将芹菜素粗晶与醇溶液混合并搅拌至芹菜素粗晶完全溶解，获得复溶液；S3、纯化：复溶液冷却结晶，过滤，获得芹菜素。
进一步地，步骤S3中的过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得芹菜素。
进一步地，步骤S1中复合酶先进行活化，再进行酶解反应；复合酶活化包括：将鼠李糖苷酶溶于水中进行活化获得鼠李糖苷酶液，将葡萄糖苷酶溶于水中进行活化获得葡萄糖苷酶液，将鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液混合，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为10000～20000∶10000；复合酶的体积与野漆树苷的质量比为2～6∶40。
进一步地，复合酶的酶解反应时间为0.5h～72h，酶解反应温度为20℃～75℃。
进一步地，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为20％～100％，野漆树苷的质量与低级醇溶液的体积比为1∶5～40。
进一步地，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与水，野漆树苷的质量与水的体积比为1∶5～40。
进一步地，步骤S1中加热升温的温度为70℃～100℃，保温的时间为1min～60min，再冷却至30℃～60℃。
进一步地，步骤S1中酸采用盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸中的一种；步骤S1中酸调节的pH至为2～8。
进一步地，检测野漆树苷是否反应完全具体步骤包括：复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液在薄层层析色谱上点样，观察野漆树苷的斑点是否消失，消失判定反应完成；或者，复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成。
进一步地，步骤S2中醇溶液采用低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为70％～100％；芹菜素粗晶的质量与醇溶液的体积比为1∶10～20。
进一步地，步骤S3中复溶液冷却结晶包括：复溶液冷却至室温，搅拌析晶10h～20h。
本发明具有以下有益效果：
本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，通过复合酶酶解入野漆树苷，再进行芹菜素粗晶分离，再采用醇溶液对芹菜素进行重结晶，获得纯度较高、晶型较均匀的新枳属苷，且采用醇溶液进行重结晶，其操作简单，容易实现工业化生产。复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，利用鼠李糖苷酶与葡萄糖苷酶的水解功能，将鼠李糖基和葡萄糖基切下以水解糖苷键，使得野漆树苷脱去鼠李糖与葡萄糖，制备成芹菜素。本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，对现有芹菜素提取技术易污染、得率低，半合成使用有害试剂，废水量大，不适合大规模工业化生产的缺点，本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法采用生物酶催化，将野漆树苷水解成芹菜素，操作简单方便，绿色无污染，适合大规模生产。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明的芹菜素标品的液相色谱图；以及
图2是本发明优选实施例1的芹菜素的液相色谱图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
图1是本发明的芹菜素标品的液相色谱图；图2是本发明优选实施例1的芹菜素的液相色谱图。
本实施例的利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入野漆树苷与水或低级醇溶液，混合均匀，加热升温至70℃以上保温，再冷却至60℃以下，加入酸调节pH值，加入复合酶进行酶解反应，复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，检测野漆树苷是否反应完全，酶解反应完成后升温将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，将芹菜素粗晶与醇溶液混合并搅拌至芹菜素粗晶完全溶解，获得复溶液；
S3、纯化：复溶液冷却结晶，过滤，获得芹菜素。
本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，通过复合酶酶解入野漆树苷，再进行芹菜素粗晶分离，再采用醇溶液对芹菜素进行重结晶，获得纯度较高、晶型较均匀的新枳属苷，且采用醇溶液进行重结晶，其操作简单，容易实现工业化生产。复合酶包括鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，利用鼠李糖苷酶与葡萄糖苷酶的水解功能，将鼠李糖基和葡萄糖基切下以水解糖苷键，使得野漆树苷脱去鼠李糖与葡萄糖，制备成芹菜素。本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法，对现有芹菜素提取技术易污染、得率低，半合成使用有害试剂，废水量大，不适合大规模工业化生产的缺点，本发明的利用生物酶解制备芹菜素的方法采用生物酶催化，将野漆树苷水解成芹菜素，操作简单方便，绿色无污染，适合大规模生产。利用生物酶解制备芹菜素的方法的反应方程式如下：
本实施例中，步骤S3中的过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得芹菜素。上述利用生物酶解制备芹菜素的方法，不使用有害溶剂和有毒试剂，其产生的废水或滤液可以重复利用，操作方便简单，反应条件温和可控。将过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得含量较低的芹菜素，从而将废水或滤液的芹菜素回收，以提高芹菜素的回收率
本实施例中，步骤S1中复合酶先进行活化，再进行酶解反应；复合酶活化包括：将鼠李糖苷酶溶于水中进行活化获得鼠李糖苷酶液，将葡萄糖苷酶溶于水中进行活化获得葡萄糖苷酶液，将鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液混合，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为10000～20000∶10000；复合酶的体积与野漆树苷的质量比为2～6∶40。上述复合酶包括葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶共同催化作用，以将野漆树苷的鼠李糖基和葡萄糖基去除，获得芹菜素。在酶解反应之前，需要将葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶进行活化，将鼠李糖苷酶溶于水中进行活化获得鼠李糖苷酶液，将葡萄糖苷酶溶于水中进行活化获得葡萄糖苷酶液，将活化后的酶液加入到野漆树苷与水或低级醇溶液的混合液中，使活化后的酶充分反应，使得酶解完全。通过前期预实验，单因素试验和正交试验，确定鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶的酶比活力。将野漆树苷与鼠李糖苷酶、葡萄糖苷酶与芹菜素-7-O-葡萄糖苷测试其反应速率确定两种酶的真实酶活力，确定两种酶共同参加酶解反应的最佳酶的比活力。本实施例中，复合酶的酶解反应时间为0.5h～72h，酶解反应温度为20℃～75℃。上述复合酶在含有野漆树苷溶液中进行酶解反应，反应时间为0.5h～72h，反应温度为20℃～75℃，以使得鼠李糖苷酶与葡萄糖苷酶水解糖苷键充分。
本实施例中，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为20％～100％，野漆树苷与低级醇溶液的体积比为1∶5～40。野漆树苷易溶于甲醇、乙醇等低级醇，充分溶解后增加野漆树苷与复合酶的接触面积，加速酶解反应进行，然而，长碳链醇的非极性增加，使得野漆树苷溶解度变小。而且，低含量的甲醇、乙醇等低级醇对鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶生物活性影响较小，其他多碳链醇、高级元醇或高浓度的低级醇可能导致鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶失活，因此采用Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，并且低级醇溶液中低级醇的浓度为20％～100％，野漆树苷与低级醇溶液的体积比为1∶5～40，以适应复合酶酶解反应的发生。优选地，低级醇溶液中低级醇的浓度为30％，野漆树苷与低级醇溶液的体积比为1∶15。野漆树苷在30％乙醇溶液溶解度更大，对酶活性影响较小，有利于芹菜素生成。
本实施例中，步骤S1中向反应容器中加入野漆树苷与水，野漆树苷的质量与水的体积比为1∶5～40。上述野漆树苷也溶于水中，可在含有野漆树苷的水溶液中进行酶解反应。
本实施例中，步骤S1中加热升温的温度为70℃～100℃，保温的时间为1min～60min，再冷却至30℃～60℃。上述加热升温的温度为70℃～100℃，温度升高有利于野漆树苷与水或低级醇充分溶解，高温杀菌减少外来微生物对鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶活性影响。冷却至30℃～60℃，调节pH至为2～8，以进行酶解反应。优选地，加热升温的温度为80℃，保温的时间为10min，再冷却至55℃。
本实施例中，检测野漆树苷是否反应完全具体步骤包括：复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液在薄层层析色谱上点样，观察野漆树苷的斑点是否消失，消失判定反应完成；或者，复合酶的酶解反应时间为4h～12h，酶解反应2h～6h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成。酶解反应完全后可加热至80℃将复合酶灭活，停止反应，加热80℃不影响芹菜素的生成。
本实施例中，步骤S1中酸采用盐酸、硫酸、冰醋酸或甲酸中的一种。步骤S1中酸调节的pH至为2～8。优选地，采用冰醋酸，调节的pH至为4，以适应鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶的水解发生环境。鼠李糖苷酶的最适反应温度为35℃～50℃，最适反应pH值为4.0～6.0，有催化活性温度范围为10℃～80℃，有催化活性pH范围为2～9；葡萄糖苷酶的最适反应温度为20℃～65℃，最适反应pH值为4.0～5.0，有催化活性温度范围为10℃～110℃，有催化活性pH范围为2～8。为适应鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶酶解，扩大反应环境的pH值为2～8。
本实施例中，步骤S2中醇溶液采用低级醇溶液，低级醇溶液采用含碳数为Cl～C6的一元醇，二元醇或三元醇，低级醇溶液中低级醇的浓度为70％～100％。芹菜素粗晶的质量与醇溶液的体积比为1∶10～20。芹菜素属于黄酮类化合物极性较小，依据相似相容原理，芹菜素不易溶于低浓度的醇或水，而易于溶解在70％～100％的低级醇中，从而芹菜素在低级醇的浓度为70％～100％溶液中可以充分溶解，搅拌和加热80℃以上，以辅助加快芹菜素粗晶的溶解。优选地，低级醇溶液中低级醇的浓度为80％，野漆树苷的质量与低级醇溶液的体积比为1∶10。
本实施例中，步骤S3中复溶液冷却结晶包括：复溶液冷却至室温，搅拌析晶10h～20h。芹菜素在常温条件下，在低级醇溶液中溶解度较小，芹菜素从低级醇溶液中析出，析出芹菜素精制晶体后再过滤、干燥，即获得芹菜素。
实施例
芹菜素标品购自中国药品检验总所20mg 99.6％芹菜素标准品。
以上试剂均为市销。
实施例1
利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入100g野漆树苷与2L 25％乙醇溶液，混合均匀，水浴加热升温至80℃，保温10min，再冷却至60℃，加入冰醋酸酸调节pH值4.5，加入10mL复合酶进行酶解反应，复合酶包括活化的鼠李糖苷酶液和活化的葡萄糖苷酶，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为12000∶10000，复合酶的酶解温度为55℃，酶解反应时间为4h，酶解反应2h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成，升温至80℃将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，加入芹菜素粗晶质量10倍体积80％乙醇溶液，加热至80℃搅拌至完全溶解，获得复溶液；，
S3、纯化：复溶液冷却至室温，搅拌析晶12hr，过滤，干燥，获得芹菜素，过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得少量芹菜素，收集获得芹菜素。
获得39.6g的芹菜素纯品，HPLC纯度99.1％，收率39.6％。
实施例2
利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入100g野漆树苷与1.5L 30％乙醇溶液，混合均匀，水浴加热升温至80℃，保温15min，再冷却至60℃，加入冰醋酸酸调节pH值4，加入12mL复合酶进行酶解反应，复合酶包括活化的鼠李糖苷酶液和活化的葡萄糖苷酶，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为10000∶10000，复合酶的酶解温度为50℃，酶解反应时间为12h，酶解反应6h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成，升温至80℃将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，加入芹菜素粗晶质量15倍体积70％乙醇溶液，加热至80℃搅拌至完全溶解，获得复溶液；
S3、纯化：复溶液冷却至室温，搅拌析晶12hr，过滤，干燥，获得芹菜素，过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得少量芹菜素，收集获得芹菜素。
获得42.8g的芹菜素纯品，HPLC纯度91.7％，收率42.8％。
实施例3
利用生物酶解制备芹菜素的方法，包括以下步骤：
S1、酶解：向反应容器中加入120g野漆树苷与1.5L 30％乙醇溶液，混合均匀，水浴加热升温至80℃，保温10min，再冷却至60℃，加入冰醋酸酸调节pH值4.5，加入15mL复合酶进行酶解反应，复合酶包括活化的鼠李糖苷酶液和活化的葡萄糖苷酶，鼠李糖苷酶液与葡萄糖苷酶液的酶比活力为12000∶10000，复合酶的酶解温度为60℃，酶解反应时间为6h，酶解反应2h后，每间隔1h将酶解反应液进行高效液相色谱检测，野漆树苷吸收峰面积低于1％，判定反应完成，升温至80℃将复合酶灭火，获得反应液；
S2、分离：将反应液过滤，获得芹菜素粗晶，加入芹菜素粗晶质量20倍体积70％乙醇溶液，加热至80℃搅拌至完全溶解，获得复溶液；
S3、纯化：复溶液冷却至室温，搅拌析晶12hr，过滤，干燥，获得芹菜素，过滤后的滤液进行旋转蒸发至无醇味，获得浓缩液，将浓缩液进行冷冻干燥，获得少量芹菜素，收集获得芹菜素。
获得53.4g芹菜素纯品，HPLC纯度94.9％，收率44.5％。
实施例1、2和3的芹菜素的收率计算如下：
实施例1、2和3的芹菜素的HPLC纯度，通过高效液相软件对图谱进行分析，样品的峰面积占所有出峰面积的百分比为获得芹菜素的纯度。
以实施例1为例，进行芹菜素HPLC测定：
(1)芹菜素标样溶液：精密称取芹菜素标准样品18.26mg，用无水乙醇溶于100mL容量瓶中，定容、摇匀后备用。
(2)色谱条件色谱柱Diamonsil C18柱(150mm×.6mm，5μm)；流动相为乙腈∶水＝45∶55，流速1.0mL/min；检测波长270nm；柱温25℃；进样量10μL。
取实施例1制备的芹菜素以及购买的相应的标准品进行液相色谱分析。分析结果如图1和图2、表1和表2所示。其中，图1为芹菜素标准品的液相谱图，表1为芹菜素标准品的峰结果，图2为实施例1制备的芹菜素液相谱图，表2为实施例1制备的芹菜素的峰结果，芹菜素标准品的保留时间为6.150，实施例1制备的芹菜素的保留时间为6.147，二者的保留时间相近，可初步判断实施例1中利用生物酶解制备芹菜素的方法制备的产物为芹菜素。而且实施例1制备的芹菜素对应的峰面积百分数为99.18％，可见其纯度较高。
表1芹菜素标准品的峰结果
表2实施例1的芹菜素的峰结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。