一种基于干细胞的纳米药物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种基于干细胞的纳米药物及其制备方法和应用 (Stem cell-based nano-drug and preparation method and application thereof ) 是由 陶玉 周祥福 李明强 林志钧 刘柏隆 于 2021-07-06 设计创作，主要内容包括：本申请属于医药技术领域,尤其涉及一种基于干细胞的纳米药物及其制备方法和应用。本申请提供了一种基于干细胞的纳米药物,包括：干细胞条件培养基、载体材料和聚阳离子；所述载体材料用于包裹所述干细胞条件培养基形成纳米颗粒；所述聚阳离子修饰在所述纳米颗粒的表面。本申请提供了一种基于干细胞的纳米药物及其制备方法和应用,有效解决现有膀胱内给药治疗膀胱疾病时存在的药物容易被尿液稀释且随尿液外排、驻留时间短且难以穿透膀胱黏膜屏障的技术缺陷。(The application belongs to the technical field of medicines, and particularly relates to a stem cell-based nano-drug, and a preparation method and application thereof. The present application provides a stem cell-based nano-drug comprising: a stem cell conditioned medium, a carrier material, and a polycation; the carrier material is used for coating the stem cell conditioned medium to form nanoparticles; the polycation is modified on the surface of the nanoparticle. The application provides a stem cell-based nano-drug, and a preparation method and application thereof, which effectively solve the technical defects that the drug is easily diluted by urine and is discharged along with the urine, the residence time is short, and the drug is difficult to penetrate through a bladder mucosa barrier when the existing intravesical drug delivery is used for treating bladder diseases.)
技术领域
本申请属于医药
技术领域
，尤其涉及一种基于干细胞的纳米药物及其制备方法和应用。背景技术
间质性膀胱炎又称膀胱疼痛综合征(IC/BPS)，是一种以下腹部疼痛不适为主的慢性非细菌性膀胱炎症，常伴有持续性或复发性下尿路症状，严重影响患者的生活质量。据统计，间质性膀胱炎的发病率为0.01％-2.3％，不同国家和地区略有差异。间质性膀胱炎的病因和发病机制并无定论，目前缺乏有效的治疗手段；常规治疗以非手术治疗为主，如口服药物、膀胱内药物灌注，但疗效均甚微。相较于口服药物而言，膀胱内药物灌注给药是通过导管将药物直接递送到膀胱的一种治疗策略，可增加局部的药物浓度并降低全身毒副作用。然而，由于膀胱内持续的尿液储存和外排易将药物稀释并排出体外，导致药物驻留时间短；此外，药物分子与膀胱内壁的相互作用力有限，导致药物分子难以粘附在膀胱壁；上述原因致使药物分子难以在膀胱内驻留并穿透膀胱通透性屏障进而发挥药效。因此，膀胱内药物灌注的治疗效果仍然有待提高。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种基于干细胞的纳米药物及其制备方法和应用，有效解决现有膀胱内给药治疗膀胱疾病中存在的药物容易被尿液稀释和排出，导致驻留时间短且难以穿透膀胱通透性屏障的技术缺陷。
本申请第一方面提供了一种基于干细胞的纳米药物，包括：干细胞条件培养基、载体材料和聚阳离子；
所述载体材料用于包裹所述干细胞条件培养基形成纳米颗粒；
所述聚阳离子修饰在所述纳米颗粒的表面。
另一实施例中，所述载体材料选自聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物-聚乙二醇-二嵌段共聚物(PLGA-PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚甲基丙烯酸(PMAA)和脂质体中的一种或多种。
具体的，聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)具有封装各种类型的生物活性分子的能力，包括核酸和活性蛋白。
另一实施例中，所述聚阳离子选自N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、壳聚糖(CS)、聚精氨酸(PArg)、聚赖氨酸(PLL)、树枝状聚酰胺胺(PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)中的一种或多种。
具体的，聚阳离子修饰在所述纳米颗粒的表面，所述基于干细胞的纳米药物的表面带有正电荷，可增强膀胱上皮粘附和渗透的功效。
另一实施例中，所述干细胞条件培养基来源于人或鼠的脐带间充质干细胞、脐带血造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞中的一种或多种。
另一实施例中，采用复乳法将所述载体材料包裹所述干细胞条件培养基形成纳米颗粒。
另一实施例中，所述所述干细胞条件培养基中的蛋白质浓度为10～1000μg/mL。
具体的，本申请提供的基于干细胞的纳米药物为纳米颗粒，所述基于干细胞的纳米药物的粒径为100～500nm；所述基于干细胞的纳米药物的多分散性指数(PDI)为0.13～0.30；所述基于干细胞的纳米药物的Zeta电位为16～27mV；所述基于干细胞的纳米药物的蛋白质负载率为1.0％～10.0％。
本申请第二方面提供了一种基于干细胞的纳米药物的制备方法，包括：
步骤1、将载体材料溶于适量有机溶剂中，按比例加入干细胞条件培养基的水相溶液，通过超声或震荡等方法进行处理，获得状态稳定的W/O初级乳液；
步骤2、在步骤1所得到的W/O初级乳液中，加入含有聚阳离子的水相溶液进行第二次乳化处理，得到W/O/W复乳；所述W/O/W复乳经搅拌挥发和反复离心洗涤除去溶剂后，得到基于干细胞的纳米药物。
另一实施例中，所述载体材料溶液的溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、环己烷、正己烷、二氯乙烷和玉米油中的一种或多种；所述聚阳离子溶液的溶剂选自水、生理盐水、5％葡萄糖中的一种或多种。
具体的，基于干细胞的纳米药物的制备方法的干细胞条件培养基的包封率为22％～57％。
本申请第三方面公开了所述基于干细胞的纳米药物或所述制备方法制得的基于干细胞的纳米药物在制备治疗膀胱疾病的药物中的应用。
本申请第四方面提供了一种膀胱内灌注的治疗膀胱疾病的药物，包括所述基于干细胞的纳米药物或所述制备方法制得的基于干细胞的纳米药物，以及药物上可接受的物质。
具体的，所述药物上可接受的物质可为膀胱内灌注用辅料。
本申请的基于干细胞的纳米药物可作为膀胱内灌注药物，聚阳离子修饰在基于干细胞的纳米药物的表面，使其表面带有正电荷，能够增加纳米颗粒及其负载的生物活性分子的上皮渗透能力。本申请发现，在膀胱内灌注基于干细胞的纳米药物，可降低环磷酰胺(CYP)诱导的膀胱炎模型动物的膀胱中的促炎细胞因子和BDNF/TrkB信号的表达，同时使KCC2表征水平正常化。此外，膀胱内灌注基于干细胞的纳米药物后，机械痛敏和排尿功能的症状得到了明显改善。可见，本申请的基于干细胞的纳米药物具有治疗膀胱疾病，尤其是膀胱炎的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。
图1为本申请实施例提供的干细胞条件培养基的制备流程图。
图2为本申请实施例提供的PLGA包裹干细胞条件培养基(CM)形成纳米颗粒(PLGA/CM NPs)，在颗粒表面修饰N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)，形成阳离子化纳米颗粒(PLGA/CM-TMC NPs)的制备过程流程图。
图3为本申请实施例提供的膀胱内灌注基于干细胞的纳米药物以提高IC/BPS治疗效率的示意图。
图4为本申请实施例提供的PLGA/CMNPs和PLGA/CM-TMC NPs的表征，其中，A为PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的扫描电子显微镜(SEM)图像，B为PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的平均粒径和Zeta电位，C为PLGA/CMNPs和PLGA/CM-TMC NPs的蛋白质累积释放曲线。
图5为本申请实施例提供的载体PLGA NPs和载体PLGA-TMC NPs与人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1细胞)共孵育后的细胞存活率结果。
图6为本申请实施例提供的PLGANPs和PLGA-TMC NPs的黏膜滞留性和穿透性情况，其中，A为冷冻切片实验的示意图，B为以异硫氰酸荧光素(FITC)标记牛血清白蛋白(BSA)[BSA-FITC]溶液、PLGA包裹BSA-FITC[PLGA/(BSA-FITC)]纳米颗粒溶液和PLGA包裹BSA-FITC且表面修饰TMC[PLGA/(BSA-FITC)-TMC]纳米颗粒溶液进行膀胱灌注，膀胱灌注后3小时、12小时和24小时对膀胱壁进行荧光显微镜成像；其中，蓝色表示DAPI；绿色表示FITC，U表示尿路上皮，D表示逼尿肌；C为使用ImageJ软件对BSA-FITC、PLGA/(BSA-FITC)-TMC纳米颗粒和PLGA/(BSA-FITC)纳米颗粒进行膀胱内灌注后的FITC荧光强度进行半定量分析(n＝5)的结果，**p<0.01，***p<0.001。
图7为本申请实施例提供的在CYP诱发的膀胱炎大鼠中膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后的机械痛敏阈值试验结果，其中，A为采用CYP诱发构建膀胱炎大鼠模型的流程图；B为Von Frey纤毛针测试流程图；C为采用干细胞条件培养基、PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗CYP诱发的膀胱炎大鼠后机械性疼痛阈值的变化(n＝10)；与CYP组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与CYP+PLGA/CM-TMC NPs组相比，$p<0.05，$$p<0.01，$$$p<0.001。
图8为本申请实施例提供的在CYP诱发的膀胱炎大鼠中膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后的膀胱排尿功能情况，其中，A为五组大鼠的膀胱内压力曲线结果，B为五组大鼠的膀胱内基础压力，最大压力和排尿频率的统计分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图9为本申请实施例提供的在CYP诱发的膀胱炎大鼠中膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后的膀胱组织病理学分析，其中，A为五组大鼠的膀胱大体解剖结果，膀胱黏膜水肿、充血和溃疡情况；B为不同组的苏木精和伊红(H&E)染色；C为在不同组中用甲苯胺蓝将肥大细胞(红色箭头)染色；(D-E)统计图显示各组的上皮损伤评分和肥大细胞浸润数量统计，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，D代表逼尿肌，U代表尿路上皮。
图10为本申请实施例提供在CYP诱发的膀胱炎大鼠中膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后的膀胱中促炎细胞因子的水平，其中，(A-C)为量化炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的mRNA水平；(D-F)为炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白质印迹，膀胱内施用PLGA/CM-TMC NPs治疗后；与CYP组相比，IL-1β、TNF-α和IL-6的表达下降，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图11为本申请实施例提供在CYP诱发的膀胱炎大鼠中膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后BDNF/TrkB信号传导水平和膀胱KCC2水平，其中，A为膀胱中的BDNF的Westernblots条带及相应的半定量分析；B为KCC2的Westernblots条带及相应的半定量分析；C为TrkB的Westernblots条带及相应的半定量分析；D为p-TrkB的Western blots条带及相应的半定量分析，n＝5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
本申请提供了一种基于干细胞的纳米药物及其制备方法和应用，用于解决现有技术中膀胱内给药治疗膀胱疾病中存在的药物容易被尿液稀释且随尿液外排、驻留时间短且难以穿透膀胱黏膜屏障的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。
以下实施例的PLGA聚合物(丙交酯/乙交酯的摩尔比为50:50，分子量为30kDa)和TMC(N-三甲基壳聚糖氯化物，三甲基取代度为50％)购自上海舜纳生物科技有限公司。BSA-FITC购自北京金克隆生物技术有限公司。聚乙烯醇(PVA)由阿拉丁生化技术有限公司(中国)提供。
中山大学附属第三医院研究伦理委员会授权人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的分离程序。
人脐带间充质干细胞条件培养基(CM)是从中山大学附属第三医院生物治疗中心实验室获得。
以下实施例的PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的流体动力学大小，Zeta电位和多分散性指数(PDI)通过纳米粒度电位仪(安东帕，Litesizer 500)进行检测。
以下实施例的PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的形态是通过扫描电子显微镜(SEM，Phenom ProX，荷兰)检测。
以下实施例的PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的蛋白质包封率和负载率是通过颗粒裂解后进行评估。
实施例1
本申请实施例提供了干细胞条件培养基的制备方法，具体包括：
请参阅图1，图1为本申请实施例提供的干细胞条件培养基的制备流程图，使用含10％胎牛血清(FBS)的低葡萄糖DMEM培养基培养hUC-MSC，培养传代至第4代，换为无FBS的低葡萄糖DMEM培养基培养hUC-MSC，获得干细胞条件培养基，具体如下：当hUC-MSC细胞生长汇合度达到80％时，将培养基置换为无FBS的低葡萄糖DMEM培养基。48小时后，收集来自hUC-MSC的条件培养基，然后离心(1500×g，10分钟)以除去细胞碎片。之后，在4℃(4000×g，40分钟)条件下，使用离心超滤器(3kDa截留值，Millipore，Billerica，MA)进行离心，得到50倍浓缩的干细胞条件培养基。浓缩的干细胞条件培养基用0.22μm的滤器过滤灭菌，并保存在-80℃直至使用。
对比例
本申请实施例提供了一种基于干细胞的对照纳米药物，为PLGA/CMNPs，具体制备方法包括：
通过复乳法制备。具体包括：将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基加入到包含20mgPLGA聚合物的1mL二氯甲烷(DCM)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述溶液倒入4mL的1％(w/v)PVA水相中，在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CMNPs保存在低温条件下备用。
实施例2
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，为PLGA/CM-TMC NPs，具体制备方法参照对比例。
请参阅图2，图2为本申请实施例提供的PLGA/CM-TMC NPs的制备流程图。具体包括：将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg TMC)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC NPs保存在低温条件下备用。
实施例3
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，为PCL/CM-TMC NPs，具体制备方法如下：
PCL聚合物(分子量为60kDa)购自阿拉丁生化技术有限公司(中国)。将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PCL聚合物的1mLDCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg TMC)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PCL/CM-TMC NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PCL/CM-TMC NPs保存在低温条件下备用。
实施例4
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，为PLA/CM-TMC NPs，具体制备方法如下：
PLA聚合物(分子量为60kDa)购自阿拉丁生化技术有限公司(中国)。将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLA聚合物的1mLDCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg TMC)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLA/CM-TMC NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLA/CM-TMC NPs保存在低温条件下备用。
实施例5
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为壳聚糖(CS)修饰的PLGA/CM-CS NPs，具体制备方法包括：
壳聚糖(CS)，粘度100-200mpa.s，购自阿拉丁生化技术有限公司(中国)。将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg CS)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-CS NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-CS NPs保存在低温条件下备用。
实施例6
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为聚精氨酸(PArg)修饰的PLGA/CM-PArg NPs，具体制备方法包括：
聚精氨酸(PArg)，分子量为70kDa，购自西格玛(Sigma)。将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mLDCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg PArg)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-PArgNPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-PArgNPs保存在低温条件下备用。
实施例7
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为聚赖氨酸(PLL)修饰的PLGA/CM-PLL NPs，具体制备方法包括：
聚赖氨酸(PLL)，分子量为4kDa，购自阿拉丁生化技术有限公司(中国)。将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg PLL)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-PLLNPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-PLLNPs保存在低温条件下备用。
实施例8
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为树枝状聚酰胺胺(PAMAM)修饰的PLGA/CM-PAMAM NPs，具体制备方法包括：
树枝状聚酰胺胺(PAMAM)G4.0购自上海舜纳生物科技有限公司。将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg PAMAM)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-PAMAMNPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-PAMAM NPs保存在低温条件下备用。
实施例9
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为聚乙烯亚胺(PEI)修饰的PLGA/CM-PEI NPs，具体制备方法包括：
聚乙烯亚胺(PEI)，分子量为10kDa，购自阿拉丁生化技术有限公司(中国)。将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含1.6mg PEI)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-PEI NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-PEINPs保存在低温条件下备用。
实施例10
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)和壳聚糖(CS)修饰的PLGA/CM-TMC/CS NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.8mg TMC和0.8mg CS)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/CS NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/CS NPs保存在低温条件下备用。
实施例11
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)和聚精氨酸(PArg)修饰的PLGA/CM-TMC/PArgNPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.8mg TMC和0.8mg PArg)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PArgNPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PArgNPs保存在低温条件下备用。
实施例12
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)和聚赖氨酸(PLL)修饰的PLGA/CM-TMC/PLLNPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.8mg TMC和0.8mg PLL)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PLLNPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PLLNPs保存在低温条件下备用。
实施例13
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)和树枝状聚酰胺胺(PAMAM)修饰的PLGA/CM-TMC/PAMAM NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.8mg TMC和0.8mg PAMAM)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PAMAMNPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PAMAM NPs保存在低温条件下备用。
实施例14
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的PLGA/CM-TMC/PEI NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.8mg TMC和0.8mg PEI)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PEINPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PEINPs保存在低温条件下备用。
实施例15
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、壳聚糖(CS)和聚精氨酸(PArg)修饰的PLGA/CM-TMC/CS/PArgNPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg CS和0.5mg PArg)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/CS/PArg NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/CS/PArgNPs保存在低温条件下备用。
实施例16
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、壳聚糖(CS)和聚赖氨酸(PLL)修饰的PLGA/CM-TMC/CS/PLLNPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg CS和0.5mg PLL)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/CS/PLL NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/CS/PLLNPs保存在低温条件下备用。
实施例17
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、壳聚糖(CS)和树枝状聚酰胺胺(PAMAM)修饰的PLGA/CM-TMC/CS/PAMAM NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg CS和0.5mg PAMAM)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/CS/PAMAM NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/CS/PAMAM NPs保存在低温条件下备用。
实施例18
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、壳聚糖(CS)和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的PLGA/CM-TMC/CS/PEINPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg CS和0.5mg PEI)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/CS/PEI NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/CS/PEI NPs保存在低温条件下备用。
实施例19
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、聚精氨酸(PArg)和聚赖氨酸(PLL)修饰的PLGA/CM-TMC/PArg/PLLNPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg PArg和0.5mg PLL)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PArg/PLL NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PArg/PLL NPs保存在低温条件下备用。
实施例20
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、聚精氨酸(PArg)和树枝状聚酰胺胺(PAMAM)修饰的PLGA/CM-TMC/PArg/PAMAM NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg PArg和0.5mg PAMAM)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PArg/PAMAM NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PArg/PAMAM NPs保存在低温条件下备用。
实施例21
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、聚精氨酸(PArg)和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的PLGA/CM-TMC/PArg/PEI NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg PArg和0.5mg PEI)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PArg/PEI NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PArg/PEI NPs保存在低温条件下备用。
实施例22
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、聚赖氨酸(PLL)和树枝状聚酰胺胺(PAMAM)修饰的PLGA/CM-TMC/PLL/PAMAM NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg PLL和0.5mg PAMAM)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PLL/PAMAM NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PLL/PAMAMNPs保存在低温条件下备用。
实施例23
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、聚赖氨酸(PLL)和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的PLGA/CM-TMC/PLL/PEI NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg PLL和0.5mg PEI)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PLL/PEI NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PLL/PEI NPs保存在低温条件下备用。
实施例24
本申请实施例提供了一种基于干细胞的纳米药物，表面为N-三甲基壳聚糖氯化物(TMC)、树枝状聚酰胺胺(PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的PLGA/CM-TMC/PAMAM/PEI NPs，具体制备方法包括：
将0.2mL浓缩的干细胞条件培养基添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述W/O初级乳液倒入4mL的1％(w/v)PVA水溶液(含0.5mg TMC、0.5mg PAMAM和0.5mg PEI)中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，得到W/O/W复乳液。随后，将W/O/W复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/CM-TMC/PAMAM/PEI NPs，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将重新分散在1mL超纯水中的PLGA/CM-TMC/PAMAM/PEI NPs保存在低温条件下备用。
实施例25
本申请实施例提供了PLGA/CMNPs和PLGA/CM-TMC NPs的表征试验，具体包括：
1、通过扫描电子显微镜(SEM，PhenomProX，荷兰)在10kV的电压条件下检测PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的形貌，结果如图4A所示。
2、通过纳米粒度电位仪(安东帕，Litesizer 500)检测PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的流体动力学尺寸、Zeta电位和多分散性指数(PDI)，在25℃条件下测定三次，结果如图4B所示。
3、将1mg PLGA/CM NPs或PLGA/CM-TMC NPs分别悬浮在1mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，并在37℃条件下温和摇动(100rpm)孵育。在指定的时间点(2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时)，将其离心(1500×g)10分钟，从每个样品中收集100μL上清液进行蛋白含量测定。为了保持恒定的体积，往原体系中加入相同体积的PBS(100μL)。用BCA试剂盒检测上清液的蛋白质释放量。所有实验均重复三次，结果如图4C所示。
4、分别将1mg的PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs完全分散在含2.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的1mL 0.04M NaOH水溶液中，并在37℃条件下震荡1小时。通过BCA试剂盒检测蛋白质浓度，所有实验均重复三次。蛋白质包封率(％)＝纳米颗粒负载的蛋白质质量/投入的蛋白质质量×100％；蛋白质负载率(％)＝纳米颗粒负载的蛋白质质量/负载蛋白质的纳米颗粒的总质量×100％。
通过上述的颗粒裂解法评估PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的蛋白质包封率和负载率，结果如表1所述。
表1
从图4和表1可知，图4为本申请实施例提供的PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的表征，其中，A为PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的SEM图像，B为PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的平均粒径和Zeta电位，C为PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的蛋白质累积释放曲线。PLGA/CM NPs或PLGA/CM-TMC NPs的SEM图像证实了纳米颗粒的成功制备(图4A)。使用纳米粒度电位仪测量了PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的流体动力学尺寸分布和Zeta电位。如图4B所示，PLGA/CM-TMC NPs的平均粒径比PLGA/CM NPs的平均粒径大约130nm。PLGA/CMNPs的表面为负电，但经表面修饰TMC后，PLGA/CM-TMC NPs的表面带正电荷。PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的蛋白质包封率和负载率无明显差异(表1)。从蛋白质释放曲线观察到，PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs的蛋白质释放速率没有明显差异(图4C)。
实施例26
本申请实施例提供了空载体PLGANPs和空载体PLGA-TMC NPs的细胞毒性试验，具体包括：以1×104/孔的细胞密度将SV-HUC-1细胞接种在96孔板中，每孔加入100μL Ham’sF-12K培养基(含10％FBS)，将其培养于37℃，5％CO2的培养箱中，当细胞生长汇合度达到70％～80％。更换为含有不同浓度PLGANPs和PLGA-TMC NPs的培养基(PLGANPs和PLGA-TMCNPs浓度范围在1μg/mL～1000μg/mL)，共培养24小时。弃培养基，每孔加入20μL 0.5％(w/v)MTT的PBS溶液，37℃培养箱中，5％CO2条件下继续培养4小时。弃MTT溶液，每孔加入150μLDMSO。应用酶标仪检测490nm的吸收光，并根据结果计算细胞存活率。结果如图5。药物递送系统的细胞毒性是其转化应用的重要参数。因此，通过MTT试验测定了不同浓度的纳米材料与SV-HUC-1细胞共培养的细胞毒性。如图5所示，PLGANPs和PLGA-TMC NPs在1000μg/mL浓度以下，细胞均保持良好的存活情况。结果表明，PLGA NPs与PLGA-TMC NPs载体系统的细胞毒性低，具有较好的生物相容性。
实施例27
本申请实施例提供了膀胱炎大鼠模型的构建方法，具体包括：
所有程序均得到中山大学动物管理和使用委员会的授权。
将自由进食的成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重为200±20g)分隔在单独的动物饲养单位喂养，保持环境恒定(24℃，昼夜周期为12小时)。通过在第1天、第4天和第7天对大鼠腹膜内注射CYP(50mg/kg)诱导慢性膀胱炎模型。为了确认膀胱炎大鼠模型的成功建立，CYP首次给药后第8天，对大鼠进行尿动力检查以及对大鼠膀胱进行H&E染色，验证是否成功构建CYP诱导的大鼠膀胱炎模型。
实施例28
本申请实施例提供了在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，向膀胱炎大鼠的膀胱内灌注PLGA/(BSA-FITC)NPs和PLGA/(BSA-FITC)-TMC NPs后，其膀胱组织滞留性和屏障通透性试验，即测定PLGA/(BSA-FITC)NPs和PLGA/(BSA-FITC)-TMC NPs对膀胱肌层的粘附和渗透能力，具体包括：
1、通过上述复乳化法将BSA-FITC封装在PLGANPs或PLGA-TMC NPs中。具体方法包括：将BSA-FITC溶液加入到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述溶液加入4mL的1％(w/v)PVA水溶液中，在超声处理下(60秒，100W，冰浴)，得到W/O/W复乳液。随后，将复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/(BSA-FITC)纳米颗粒，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将其重新分散在1mL超纯水中，制得PLGA/(BSA-FITC)纳米颗粒。
将BSA-FITC添加到包含20mg PLGA聚合物的1mL DCM中，并在冰浴中超声处理60秒(100W)，以获得W/O初级乳液。然后，将上述溶液倒入含1.6mg TMC的4.0mL 1％(w/v)PVA溶液中，在超声处理下(60秒，100W，在冰浴上)，得到W/O/W复乳液。随后，将复乳液滴加到30mL的1％(w/v)PVA水溶液中，然后在室温下搅拌至少3小时以除去DCM。最后，通过离心30分钟(15000×g，4℃)收集PLGA/(BSA-FITC)-TMC纳米颗粒，并用超纯水重悬，离心重悬重复两次。将其重新分散在1mL超纯水中，制得PLGA/(BSA-FITC)-TMC纳米颗粒。
2、如图6A所示，用CYP诱导大鼠的膀胱炎模型，用乌拉坦(1g/kg)麻醉大鼠后，分别向大鼠的膀胱内灌注BSA-FITC溶液、PLGA/(BSA-FITC)NPs溶液和PLGA/(BSA-FITC)-TMCNPs溶液(0.5mL)，灌注后的3小时、12小时和24小时，将大鼠膀胱分离，用PBS洗涤，然后包埋在OCT中以制备冷冻切片。将样品切成8微米厚的切片，并用DAPI染色。通过荧光显微镜(Eclipse 90i，Nikon，Japan)和拍摄软件NIS-Elements D 3.10(Nikon，Japan)记录图像并测量，用ImageJ软件进行半定量分析。结果如图6B和图6C所示。
如图6所示，图6为本申请实施例提供的PLGANPs和PLGA-TMC NPs的膀胱组织滞留性和渗透性情况，其中，A为冷冻切片实验的示意图，B为以BSA-FITC、PLGA/(BSA-FITC)-TMCNPs和PLGA/(BSA-FITC)NPs进行膀胱灌注，灌注后的3小时、12小时和24小时，分别收集膀胱组织、冷冻切片、并进行膀胱壁的荧光显微镜成像，其中，蓝色，DAPI；绿色，FITC；U，尿路上皮；D，逼尿肌，C为使用ImageJ软件对BSA-FITC、PLGA/(BSA-FITC)-TMC纳米颗粒和PLGA/(BSA-FITC)纳米颗粒进行膀胱内灌注后的FITC荧光强度进行半定量分析，**p<0.01，***p<0.001。荧光显微镜成像所示(图6B)，灌注后的3小时，在用单纯BSA-FITC处理的大鼠膀胱中几乎没有观察到BSA-FITC的荧光。与之形成鲜明对比的是，在用PLGA/(BSA-FITC)-TMC纳米颗粒处理的大鼠的膀胱壁的所有三个时间点都观察到了明显的BSA-FITC荧光。此外，在PLGA/(BSA-FITC)-TMC组中，在12小时和24小时的时间点，在膀胱的肌肉层中观察到了少量的BSA-FITC荧光。这些结果表明，PLGA/(BSA-FITC)-TMC纳米颗粒可以显著提高蛋白质的黏膜滞留和渗透能力。
可见，PLGA-TMC NPs作为蛋白质传递的载体系统可以增强尿路上皮的滞留性和渗透性(图6)。具有表面正电荷的PLGA-TMC NPs增强了黏膜附着，并且干细胞条件培养基从PLGA-TMC NPs中释放出来，然后通过开放的上皮细胞之间的紧密连接进入黏膜下固有层。PLGA-TMC NPs可以增强干细胞条件培养基在尿路上皮的递送效果，从而提高治疗效果。
实施例29
本申请实施例提供了在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，向膀胱炎大鼠的膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs以减轻CYP引起的机械痛敏试验，具体方法包括：
请参阅图7，图7A为采用CYP诱发膀胱炎大鼠模型的流程图，图7B为Von Frey纤毛测试流程图，图7C为采用干细胞条件培养基、PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗CYP诱发的大鼠膀胱炎后机械性疼痛阈值的变化。与CYP组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与CYP+PLGA/CM-TMC NPs组相比，$p<0.05，$$p<0.01，$$$p<0.001。
由图7A和图7B可知，将大鼠(n＝100，成年雌性SD大鼠的体重为200±20g)随机分为五组，通过注射CYP的方式在7天之内成功诱导了慢性膀胱炎大鼠模型，第一组为对照组(不注射CYP)；第二组为第1、4和7天注射CYP的CYP组；第三组为第1、4和7天注射CYP后，第8、10和12天膀胱灌注0.5mL干细胞条件培养基的CYP+CM组；第四组为第1、4和7天注射CYP后，第8、10和12天膀胱灌注0.5mLPLGA/CM NPs的CYP+PLGA/CM组；第五组为第1、4和7天注射CYP后，第8、10和12天膀胱灌注0.5mL PLGA/CM-TMC NPs的CYP+PLGA/CM-TMC组。最后三组的治疗方式为膀胱内灌注，即在麻醉下，使用与注射器相连的20号静脉留置针头通过尿道直接将药物递送到膀胱内。并且，固定静脉留置针头1小时以防止药物经尿道流出。
对上述五组大鼠进行VonFrey纤毛针试验，Von Frey纤毛针试验包括：
(1)在进行机械痛敏检测前1天，对大鼠下腹区域进行备皮，以避免大鼠的毛发影响检测结果。为了检测的准确性，检测前一天，提前让大鼠适应检测架环境，把大鼠置于测试架上适应30分钟。
(2)每次测试前，提前将大鼠放置在痛敏行为学测试架上，保持环境的安静，让大鼠安静至少30分钟。
(3)待大鼠安静后，开始测试。使用“up-down”法进行测试，具体操作如下：选用0.6、1.4、2、4、6、8、15g的Von Frey纤毛针进行测试。开始先选用0.6g开始刺激大鼠下腹区域，记录大鼠的反应。若出现以下体征则为阳性体征，记录为“×”，如卷曲身体、抬高身体、舔下腹、漏尿、甚至应激跳起等；反之，记录为“o”。若出现“o”，则选取更大一号重量的纤毛针进行测试，直至出现“×”；若选用15g纤毛针进行刺激，大鼠未出现阳性体征，则测试结束。当出现“×”时，需选取更轻一号重量的纤毛针进行测试，未出现阳性体征，则选用大一号纤毛针进行刺激，反复多次，直至出现连续“o、×、o、×、o”，则测试结束。
(4)用纤毛针刺激大鼠下腹区域时，需注意技巧。首先，每次刺激前，先把纤毛针捋直，避免因上次操作折弯纤毛针影响下一次检测准确性。其次，刺激大鼠下腹区域时，让纤毛针纤毛接触大鼠皮肤，后慢慢施加力量，把纤毛针压至“S”型，刺激时间至少5秒，然后轻轻抽离纤毛针。间隔至少3分钟后选用下一根纤毛针进行测试。
(5)为了机械痛敏的测试准确性，若机械痛敏的测试与其他操作(如腹腔注射、膀胱灌注等)安排在同一天，先进行机械痛敏的测试。结果如图7C所示，与对照组和CYP模型组相比，3个治疗组(CYP+CM组、CYP+PLGA/CM组以及CYP+PLGA/CM-TMC组)在第13天、第16天、第19天的机械疼痛阈值均有回调。而3个治疗组之间的对比，CYP+PLGA/CM-TMC组从第13天开始，能有效的回调机械疼痛阈值。在实验第19天，CYP+PLGA/CM-TMC组的机械疼痛阈值与control对照组无统计学差异。说明了PLGA/CM-TMC NPs治疗可减轻机械性痛敏症状。
骨盆疼痛是IC/BPS的典型综合征，与膀胱相关的疼痛和神经炎症有关。作为治疗手段的干细胞条件培养基可以有效减轻神经性疼痛。间充质干细胞的条件培养基通过生物活性因子如抗炎细胞因子、生长因子和抗氧化剂细胞因子发挥抗伤害作用。上述数据表明，在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，施用PLGA/CM-TMC NPs后，机械阈值的降低在第13天可有效逆转(图7C)。说明在PLGA/CM-TMC NPs给药系统的帮助下，局部施用干细胞条件培养基能够改善机械痛敏反应。
实施例30
本申请实施例提供了在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后的排尿功能试验，具体方法包括：
实施例29的五组大鼠注射CYP第19天时，用20％(w/v)乌拉坦(1g/kg，腹膜内注射)对五组大鼠进行麻醉。将大鼠固定在仰卧位置。将硬膜外导管经尿道置入膀胱中，并使用压力传感器(Delphis，Laborie Medical Technologies，加拿大)记录膀胱内压力。在每次测量开始时，必须对压力传感器进行校准。接下来，将无菌盐水通过硬膜外导管以恒定速率(6mL/h)注入膀胱。使用尿流动力学测量系统(Laborie Medical Technologies)记录连续的尿流动力学曲线，并分析尿流动力学参数，包括基础压力，最大压力和排尿频率，以评估膀胱排尿功能。结果如图8所示，图8为本申请实施例提供的在CYP诱发的大鼠膀胱炎模型中通过膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后的膀胱排尿功能情况，其中，A为五组大鼠的膀胱内压力结果，B为五组大鼠的膀胱的基础压力、最大压力和排尿频率的统计分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
如图8A所示，在CYP诱导的膀胱炎大鼠模型中，CYP组的大鼠表现出不规律的排尿模式，并且排尿间隔(MI)显著小于对照组和CYP+PLGA/CM-TMC组。CYP组具有最高的基础压力和最大压力(图8B)。经过PLGA/CM-TMC NPs治疗后，CYP+PLGA/CM-TMC组的基础压力和最大压力明显降低。此外，与CYP组，CYP+CM组和CYP+PLGA/CM组相比，CYP+PLGA/CM-TMC组的排尿频率(MF)显著降低(图8B)。这些结果表明，PLGA/CM-TMC NPs可改善CYP诱导的膀胱炎模型中，膀胱炎大鼠的排尿功能。
实施例31
本申请实施例提供了在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，向膀胱炎大鼠的膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后膀胱组织病理学分析，具体包括：
实施例29中，在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，五组大鼠分别给予不同治疗，在注射CYP后的第19天时，分别从五组大鼠切下膀胱以进行组织学分析。对膀胱进行大体检查以检查水肿和出血的程度。切除膀胱并半切以通过显微镜以10倍放大率检查。然后，将另一半在4％多聚甲醛中固定24小时，然后切成3μm的厚度。切片用H&E染色以进行组织评估，并用甲苯胺蓝染色以观察肥大细胞浸润情况。通过H&E染色，在10个切片中对每张玻片的上皮损伤等级进行如下计算：0(无)、1(≤10％)、2(11–25％)、3(26–45％)、4(46–75％)和5(≥76％)。每张玻片的肥大细胞数在400倍放大倍数下，统计20个高倍视野的肥大细胞数量(20个视野的总面积为4.7mm2)。将另一半冷冻保存以供进一步分析。结果如图9所示，图9A为五组大鼠的膀胱经大体解剖后，膀胱黏膜内的水肿、充血和溃疡情况，图9B为不同组的H&E染色，图9C为在不同组中用甲苯胺蓝将肥大细胞(红色箭头)染色，图9(D-E)统计图显示各组的上皮损伤评分和肥大细胞浸润次数，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，D代表逼尿肌，U代表尿路上皮。
图9A中CYP组大鼠膀胱黏膜有明显的溃疡、充血和水肿迹象，而膀胱内灌注PLGA/CM-TMC NPs治疗后，膀胱黏膜内的水肿、充血和溃疡得到改善，可见PLGA/CM-TMC NPs可改善总体炎症迹象。图9B和图9C显示，在CYP组大鼠中观察到尿路上皮缺损和肥大细胞(MC)浸润(图9B-C)，这是IC/BPS患者的典型膀胱组织表型。在三个治疗组(CYP+CM组、CYP+PLGA/CM组和CYP+PLGA/CM-TMC组)中，膀胱内灌注CM、PLGA/CM NPs或PLGA/CM-TMC NPs对膀胱损伤均有一定的修复和治疗效果。在用PLGA/CM-TMC NPs进行膀胱内治疗后，CYP+PLGA/CM-TMC组大鼠的尿路上皮完整性与对照组没有明显差异(图9B，图9D)。而且，与CYP组相比，在CYP+PLGA/CM-TMC组的大鼠中观察到膀胱固有层上MC浸润的明显减少(图9C，图9E)。这些数据表明PLGA/CM-TMC NPs的膀胱内灌注可有效改善组织学损伤。
实施例32
本申请实施例提供了在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，向膀胱炎大鼠的膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后膀胱中促炎细胞因子水平测定，具体包括：
本实施例采用RT-PCR和蛋白质印迹分析在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，向膀胱炎大鼠的膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs治疗后，膀胱的促炎细胞因子水平。样本选择来源于实施例29，在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，五组大鼠分别给予不同治疗，选择在注射CYP后的第19天时的大鼠膀胱。
1、通过一步反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达，方法如下：使用Trizol试剂(美国，Invitrogen)从膀胱组织中提取总RNA。对反应曲线进行一步法RT-PCR：50℃持续3分钟，95℃持续30秒，95℃持续10秒循环40次，60℃持续30秒，95℃持续15秒，60℃持续60秒，95℃持续15秒。ΔΔCT方法用于相对定量。用GAPDH作为内参。其中，一步法RT-PCR试剂盒购自HiScript II(Vazyme Biotech，中国)。按照步骤2的方法测定膀胱组织的IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白含量。结果如图10所示。
2、将膀胱样品在裂解缓冲液中匀浆。通过BCA试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶上，并电印迹到PVDF膜上。封闭后，将膜与一抗在4℃条件下孵育过夜。一抗包括：脑源性神经营养因子(BDNF)(NB100-98682，Novus Biological)、酪氨酸蛋白激酶B(TrkB)(#4603，细胞信号技术)、K+-Cl-协同转运蛋白2(KCC2)(ab49917，Abcam)、磷酸TrkB(p-TrkB，Tyr515，AF3462，Affinity Biosciences)、IL-1β(ab9722，Abcam)、IL-6(DF6087，Affinity Biosciences)、TNF-α(Bioworld Technology，Inc.)和β-actin(#3700，CellSignaling Technology)。将膜在山羊抗兔或山羊抗小鼠抗体溶液中染色1小时。使用化学发光试剂盒(ECL)检测印迹。通过ImageJ软件分析蛋白质条带的灰度值。结果如图10所示。
图10和图11的RT-PCR和蛋白质印迹分析可显示主要促炎细胞因子的水平，可评估膀胱内灌注PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs后的抗炎作用效果。根据RT-PCR数据(图10A-图10C)，与对照组相比，未治疗的膀胱炎大鼠表现出IL-1β、TNF-α和IL-6mRNA转录水平的上调。在用PLGA/CM-TMC NPs治疗后，促炎细胞因子的水平降低了。另外，根据蛋白质印迹分析可知，与对照组相比，患膀胱炎大鼠的膀胱组织上的IL-1β、TNF-α和IL-6表达上调(图10D-图10F)。显然，PLGA/CM-TMC NPs治疗明显降低了促炎细胞因子的表达(图10D-图10F)。与CYP组相比，CYP+PLGA/CM-TMC组的IL-1β下降约4倍，与TNF-α和IL-6的结果相似。这表明PLGA/CM-TMC NPs的膀胱内灌注治疗能够在CYP诱导的膀胱炎中发挥抗炎疗效。
为了研究干细胞条件培养基的抗炎机制，评估了干细胞条件培养基、PLGA/CM NPs或PLGA/CM-TMC NPs在CYP诱导的膀胱炎大鼠模型中，对膀胱组织的BDNF/TrkB信号激活和KCC2表达的影响。如图11所示，在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，膀胱炎大鼠的膀胱组织上，BDNF、TrkB和p-TrkB的水平明显升高，而在KCC2中的表达显着降低。向膀胱炎大鼠的膀胱内灌注PLGA/CMNPs和PLGA/CM-TMC NPs后，可观察到BDNF/TrkB表达下调，而KCC2的表达却相反(图11A-图11D)。CYP+PLGA/CM-TMC组中，BDNF的表达相对于CYP组降低约3倍，这与TrkB和p-TrkB的结果相似。与CYP组相比，CYP+PLGA/CM-TMC组的KCC2升高约4倍。
BDNF作为主要的神经营养因子之一，在内脏痛的发病机理中引起了越来越多的关注。TrkB是BDNF的高亲和力受体，BDNF-TrkB途径通过激活中枢神经系统的神经炎症在痛觉调节中起关键作用。BDNF促进了神经胶质细胞的活化，从而促进了机械性痛敏。此外，BDNF-TrkB信号参与了膀胱痛觉过敏的机制，参与了中枢神经和周围神经的病理改变。在膀胱炎病理状况的膀胱中检测到BDNF和TrkB的上调。在CYP诱导的大鼠膀胱炎模型中，BDNF-TrkB信号通路通过炎症因子介导膀胱痛觉过敏；在膀胱炎大鼠的膀胱组织，其BDNF和TrkB的水平更高，p-TrkB的激活更明显。上述实验结果表明，膀胱内灌注PLGA/CM-TMC NPs可以抑制BDNF-TrkB信号传导，改善内脏疼痛症状。
KCC2通过神经系统中细胞内低氯浓度介导突触后的γ-氨基丁酸(GABA)受体兴奋性的抑制，当KCC2蛋白表达受抑制时，GABA受体兴奋性抑制降低，疼痛出现。BDNF-TrkB信号传导介导的KCC2的下调导致脊髓疼痛回路的兴奋性增加，这导致了神经性疼痛。重要的是，在包括膀胱在内的主要外周器官中发现了KCC2的高表达，这表明GABA信号参与了外周神经系统与中枢神经系统之间信号转导的功能表征。本申请实施例试验表明CYP组显示出膀胱中KCC2的水平明显降低，而CYP+PLGA/CM-TMC组则上调了KCC2的表达，并减轻了机械性痛敏症状。细胞条件培养基通过上调KCC2表达来调节GABA受体，以抑制过度兴奋。因此，在CYP诱导的膀胱炎模型中，局部施用细胞条件培养基的治疗机制包括但不仅限于抗炎作用和KCC2表达的上调作用。
综上所述，将干细胞条件培养基封装到PLGA聚合物纳米颗粒中，通过TMC修饰在PLGA/CM NPs的表面，得到的基于干细胞条件培养基的纳米药物是一种有效的膀胱内药物输送药物，可提高膀胱黏膜上皮的滞留性和渗透性。与干细胞条件培养基或无TMC修饰的PLGA/CM NPs相比，直接将PLGA/CM-TMC NPs进行膀胱内灌注可显着减轻机械异常性疼痛，改善排尿功能，并修复CYP诱发的膀胱炎大鼠的膀胱组织损伤。干细胞条件培养基通过下调IL-1β、TNF-α和IL-6的抗炎疗效，可在CYP诱导的膀胱炎的治疗中发挥关键作用。此外，BDNF/TrkB途径的上调可以被逆转，从而导致KCC2表达的增加。综上，PLGA/CM NPs和PLGA/CM-TMC NPs，通过抗炎作用和调节BDNF/TrkB途径减轻膀胱炎大鼠的机械痛敏和膀胱组织损伤。结果证明了PLGA/CM-TMC NPs在CYP诱导的膀胱炎模型中具有治疗潜力。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。