具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1、研究对象

基于中国太仓市的慢性疾病管理登记制度，进行了前瞻性队列研究，探讨Hcy对高血压患者CVD风险的影响。在注册的高血压患者中，有30379名患者同意参加我们的研究，并书面知情同意。2017年的所有参与者都接受了临床检查，包括个人面试和体检。通过标准问卷收集社会人口统计因素、病史、药物使用和生活方式因素的信息。对所有参与者进行了体格检查，并采集了空腹血样进行实验室测试，包括空腹血糖、脂质和Hcy。本研究方案得到了苏州大学伦理委员会的批准。在基线检查前排除有心血管疾病和癌症史的参与者(即＝3145)后，到2020年底，共有27234名参与者随访新的心血管疾病事件并纳入当前分析中。

2、基线时同型半胱氨酸的测量

太仓市疾病预防控制中心实验室的工作人员在Cobas c501分析仪(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)上使用商业化学酶分析法(Axis Shield DiagnosticsLtd.，Dundee，UK)测定同型半胱氨酸。实验室工作人员对研究参与者的基线特征一无所知。测定的批内和批间变异系数分别小于7.5％和4.5％。高同型半胱氨酸血症(HHcy)定义为Hcy≥15μmol/L。

3、基线时常规危险因素的测量

人口统计学数据(年龄、性别、受教育程度)、药物使用和生活方式(目前吸烟、饮酒)由受过培训的工作人员通过问卷调查获得。当参与者穿着轻薄的衣服，没有穿鞋子时，由受过训练的工作人员的测量体重(kg)和身高(cm)。体重指数(BMI)的计算方法是用体重(单位：千克)除以身高(单位：米)的平方(千克/平方米)。每位参与者在坐着休息至少5分钟后测量三次血压，三次测量的平均值作为收缩压(SBP)和舒张压(DBP)的最终水平。空腹血糖、肌酐、血脂，包括总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用标准方法测定。血细胞分析包括血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、血小板分布宽度(PDW)和平均血小板体积(MPV)，通过BC-3200血液分析仪(迈瑞医疗，深圳，中国)获得。

4、心血管事件的随访与评估

每年由当地社区卫生服务机构的工作人员通过电话或面对面访问对所有参与者进行随访。当发现新的心血管疾病事件或死亡时，工作人员审查了医院记录并填写了标准事件表。根据事件表，终点评审委员会做出最终诊断。心血管事件包括非致命性冠心病(包括急性心肌梗死和不稳定型心绞痛)、非致命性中风和任何心血管疾病引起的死亡。每一事件的发生日期都是从最初的诊断或死亡证明中确定的。

5、统计分析

研究参与者的基线特征是根据血清同型半胱氨酸的四分位数呈现的。对数变换用于Hcy最大化的正态分布(logHcy)。为了检验基线时Hcy与心血管事件之间的前瞻性关联，我们构建了一个Cox比例风险模型，其中心血管事件发生的时间(以天为单位)为因变量，基线时Hcy(连续性Hcy或分类Hcy为四分位数)为自变量，并调整了年龄、性别、教育水平、当前吸烟情况，当前饮酒、体重指数、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、肌酐、收缩压和基线抗高血压药物。在这个模型中，以第一次心血管事件发生的日期为准，对仍无心血管疾病或因其他原因死亡的受试者定义为删失。血小板指数与心血管事件之间的关系也同样被检测，随后通过添加血小板指数×LogHcy的相乘项进行相互作用检验。考虑到MPV的唯一显著交互作用以及为了方便数据的解释，参与者被分为四组：高MPV(≥中位数，即≥9.68fL)或HHcy的参与者，两者都有或没有的参与者，然后研究了这四个组之间(两者都没有的参与者作为参考)和心血管疾病的联系。高MPV和HHcy对CVD的相加交互作用通过三个统计学指标进行评价：相对超额风险(RERI)、归因比例(AP)和协同指数(S)。如果没有相加交互作用，RERI和AP的95％CI将包含0，S的95％CI将包含1。最后，用KaPlan-Meier生存曲线估计四组的CVD累积发生率，并用log-rank检验进行比较。所有统计分析均使用R版本4.0.2进行。小于0.05的双侧P值具有统计学意义。

6、结果

这项研究包括27234名高血压患者(平均年龄63岁，52％女性)，在基线检查时没有明显的心血管疾病。其中，5793人(21％)被认为患有HHcy。根据血清同型半胱氨酸的四分位数，其基线特征如表1所示。如预期的那样，血清同型半胱氨酸水平较高的受试者更可能是年龄较大、男性、目前吸烟、饮酒的人，并且BMI、血压、空腹血糖、血脂和肌酐水平较高(P<0.05)。在血小板活化指数方面，Hcy升高的高血压患者MPV和PCT明显升高(P<0.05)。

表1根据血清Hcy四分位数研究参与者的基线特征(N＝27,234)

All results are exPressed with mean±SD unless otherwise noted.

Hcy:homocysteine；LDL:low-density liPoProtein；HDL:high-densityliPoProtein.

(2)基线同型半胱氨酸与心血管事件的前瞻性关联

在平均3年的随访中，1063人出现了新的心血管事件，累计发病率为3.9％。基线血清同型半胱氨酸与心血管事件风险的前瞻性关联如表2所示。校正年龄、性别、教育水平、吸烟、饮酒、体重指数、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、肌酐、收缩压和抗高血压药物后，基线时血清同型半胱氨酸水平越高，患心血管疾病的风险越高(HR＝1.85，P<0.001)。以血清同型半胱氨酸四分位数作为预测指标的回归分析也发现了类似的关联。与血清同型半胱氨酸水平最低的受试者相比，第二第三第四分位数有更高的的心血管疾病风险，分别为30％(HR＝1.30，P＝0.012)、40％

(HR＝1.40，P<0.001)和57％(HR＝1.57，P<0.001)。与预期一样，有HHcy的受试者患CVD的风险是无HHcy的受试者的1.29倍(HR＝1.29，P<0.001)。

表2基线血清Hcy与CVD事件之间的前瞻性关联

^*adjusting for age,sex,education level,smoking,drinking,body massindex,low-and high-density liPoProtein cholesterol,fasting glucose,creatinine,systolic blood Pressure,and antihyPertensive medication atbaseline.

Hcy:homocysteine；CVD:cardiovascular disease；HHcy:hyPerhomocysteinemia.

(3)通过MPV对亚组基线Hcy与CVD发病率的前瞻性关联

以各血小板指数作为预测指标的回归分析发现，MPV(HR＝1.07，P<0.001)和PCT(HR＝23.63，P<0.001)与心血管疾病的发生风险显著相关(表3)，而在多变量调整后，只有MPV与Hcy在影响心血管疾病风险方面存在相互作用(P＝0.030)。此外，我们还进行了亚组分析，以检查血小板指数是否可以改变同型半胱氨酸与心血管疾病之间的关系。结果显示了相似的现象，即在高MPV组中血清Hcy与CVD的相关性显著高于低MPV组(HR＝2.71vs.1.32，P＝0.029，图1，其中，A为低MPV亚组，B为高MPV亚组)。我们没有发现其他血小板指数在同型半胱氨酸和心血管疾病之间的相关性存在任何组间差异(表4)。

表3与CVD相关的血小板指数基线水平及其与血清Hcy的相互作用

^*adjusting for age,sex,education level,smoking,drinking,body massindex,low-and high-density liPoProtein cholesterol,fasting glucose,creatinine,systolic blood Pressure,and antihyPertensive medication atbaseline.

表4血小板指数高低亚组中基线血清Hcy与CVD的相关性

^*adjusting for age,sex,education level,smoking,drinking,body massindex,low-and high-density liPoProtein cholesterol,fasting glucose,creatinine,systolic blood Pressure,and antihyPertensive medication atbaseline.

(4)高MPV和HHcy对事件CVD的交互作用

当Hcy的上四分位数与高MPV共存时，发生CVD的风险急剧增加(图2)提示同型半胱氨酸与MPV在心血管疾病发生风险方面具有协同作用。在MPV或HHcy高的个体中，CVD事件的不均匀分布，以及有和没有两者的个体表现出相似的现象(Log-rank检验P<0.001，图3)。在MPV和HHcy均较高的受试者中，CVD的累积发病率最高(6.38％)，在基线检查时两种情况均无的受试者中，CVD的累积发病率最低(3.39％)。与基线检查时无HHcy和无高MPV的受试者相比，调整协变量后，两种情况下的受试者患CVD的风险显著增加(HR＝1.50，P<0.001)，而在两种情况下的受试者均无此风险(表5)。

表5为基线时血清Hcy、血小板指标与2年内心血管事件(心肌梗死、心绞痛、心衰、脑卒中)发生风险的关系，可知Hcy与平均血小板体积对心血管病的发病风险具有协同作用，两者均升高的高血压患者发生心血管病的风险显著大于单独升高的患者，约26％的心血管风险可归因于Hcy与血小板的协同作用。

表5高Hcy和高血小板体积对心血管病的交互作用

^*adjusting for age,sex,education level,smoking,drinking,body massindex,low-and high-density liPoProtein cholesterol,fasting glucose,creatinine,systolic blood Pressure,and antihyPertensive medication atbaseline.

CVD:cardiovascular disease；HHcy:hyPerhomocystainemia；MPV:meanPlatelet volume；HR:hazard ratio；CI:confidence intervals.

高MPV×HHcy的相乘项与CVD事件显著相关(P＝0.037)。检验相加交互作用的三个统计数据在多变量调整前具有统计学意义(表6)，提示HHcy和MPV均高的受试者发生CVD的HR似乎明显高于两种情况的受试者的HR之和。

表6用于检验高MPV和HHcy与CVD事件相关的加性交互作用的统计数据

^*adjusting for age,sex,education level,smoking,drinking,body massindex,low-and high-density liPoProtein cholesterol,fasting glucose,creatinine,systolic blood Pressure,and antihyPertensive medication atbaseline.

RERI:the relative excess risk because of the interaction；AP:theattributable ProPortion because of the interaction；S:the synergy index.

实施例2

根据实施例1的研究结果，我们发现，血小板过度激活与Hcy对心血管病的发生风险可能具有协同作用。为了验证这一研究假设，我们进行了一项RCT试验，在太仓市招募了1000例高血压患者(SBP≥150 mmHg)，随机分为四组，分别给予常规管理、常规管理+叶酸0.8 mg每天、常规管理+阿司匹林100 mg每天、常规管理+叶酸(0.8 mg每天)+阿司匹林(100mg每天)不同的干预措施，在第6个月时监测血压水平，评估各组血压水平的差异，然后继续随访2年，评估各组心血管事件的发病率是否存在差异。

结果1：治疗6个月时的血压水平

如图4所示，干预6个月后，单独用药组SBP水平略低于常规治疗组，未见显著的统计学差异，但联合用药组SBP水平最低，显著低于其余3组(P<0.001)。同样的，联合用药组DBP水平也显著低于其余3组(P<0.001，图5)。

结果2：治疗2年时的心血管事件

如表7所示，干预2年后，常规治疗组、单独加用叶酸组、单独加用阿司匹林组和联合用药组心血管事件发病率分别为6.8％、6.0％、5.6％、3.6％，与常规治疗组相比，单独加用叶酸组和单独加用阿司匹林组心血管发病风险未见统计学显著降低，但联合用药组心血管病发生风险是常规治疗组的53％，即心血管病发生风险降低了47％。我们的实验结果表明，用叶酸联合阿司匹林每治疗31例高血压患者即可减少1例心血管事件的发生。

表7治疗2年时的心血管事件发病率比较

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。