具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1饲用益生菌的制备

(1)菌种活化

本发明实施例所用益生菌购自微生物保藏中心，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis CICC 24675)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis CICC 20446)。

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌活化培养基采用LB，配方为：酵母膏0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％，固体培养基加琼脂2％。将菌株接种到平板培养基上，37℃条件下培养24小时，获得活化菌种；

(2)发酵培养

将(1)活化的菌种，分别接种到液体LB培养基中，制备2L的摇瓶种子，进而转接到50L和400L的一、二级发酵罐中，培养12小时。分别转接到三级10T发酵培养基中。

发酵培养基配方为：葡萄糖1％、玉米粉1.5％、酵母粉1％、黄豆粉2.5％、柠檬酸钠0.45％、碳酸钙0.015％、硫酸镁0.002％，在37℃条件下培养48h，待芽孢率达到95％以上即可放罐。

(3)益生菌半成品制备

将(2)发酵液中加入20％的淀粉，经喷雾干燥塔进行喷雾干燥，所得喷雾干粉进行计数，测定含量。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 24675)有效活菌数可达300×10⁸CFU/g，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis CICC 20446)有效活菌数可达500×10⁸CFU/g。

实施例2饲用酶制剂的制备

本发明实施例所用酶制剂异源表达宿主菌均有本实验室完成构建。

(1)种子液制备

于超净工作台挑取饲用酶制剂毕赤酵母宿主菌单菌落，在平板上进行三区划线，活化菌种。待长出单菌落后，挑取单菌落接种于200mLYEPD培养基中，酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％，在30℃，250rpm培养36～38h，直至湿细胞重量达到30g/L。分别使用50升和500升发酵罐进行种子扩大培养，培养基配方为酵母膏1％、蛋白胨2％、甘油2％，30℃，350rpm，添加20％(w/v)氨溶液调节pH≈4.5的条件下发酵，发酵约24小时，直至湿细胞重量达到OD600>30。

(2)产酶发酵

高密度发酵培养基：每升发酵培养基均包含40mL甘油，5.0mL H₂SO₄和基础盐培养基(26.7mL 85％H₃PO₄、0.93g CaSO₄、18.2g K₂SO₄、14.9g MgSO₄·7H₂O，4.13g KOH)，微量矿物混合物(6.0g CuSO₄·5H₂O，0.08g NaI，3.0g MnSO₄·H₂O，0.2g Na₂MoO₄·2H₂O，0.02gH₃BO₃、0.5g CoCl₂、20.0g ZnCl₂、65.0g FeSO₄·7H₂O)和维生素混合物(128mg C₆H₁₂O₆、12.8mg C₁₈H₃₂CaN₂O₁₀、12.8mg C₈H₉NO₃·HCl，64mg K₂HPO₄、3.2mg的维生素B1，0.2g的维生素B3和12.8mg D-生物素)。以30℃，50rpm,利用20％(w/v)氨溶液控制pH≈4.7-5.0的条件下进行发酵，直到湿细胞重量达到64g/L。

发酵过程包括四个步骤，第一步，甘油流加培养步骤，整个过程历时约17小时，控制pH，直到湿重达到47.2g/L。在第二阶段，当溶解氧(DO)含量达到100％饱和，并保持2小时后，以50L/h的流速向培养基中注入250L，50％的甘油，该过程持续5h，直到达到140～150g/L的湿重。整个过程中，溶氧量保持在20％至30％。在第三阶段中，以50L/h的流量将250L的50％甘油和20％甲醇混合物注入，该过程持续5h，直到达到140～160g/L的湿重。在第四阶段，流加15L/h甲醇。分批补料发酵在30℃和大约4.7～5的pH值下进行，同时在恒定的DO(20～30％)下添加20％(v/v)的氨水反应使用DO级联模式进行，搅拌速度调节至150-180rpm，进口空气为1～1.2VVM，整个分批补料培养阶段的物理压力保持在0.05MPa。该阶段持续120～150小时。

(3)饲用酶制剂半成品的制备

将(2)发酵液中加入20％的淀粉，经喷雾干燥塔进行喷雾干燥，所得喷雾干粉进行酶活力测定。木聚糖酶酶活力为100000U/g、淀粉酶酶活力为5000U/g和葡萄糖氧化酶酶活力为5000U/g。

实施例3低聚甘露寡糖的制备

(1)魔芋寡糖的水解液制备

利用β-甘露聚糖酶在酶解罐中60℃、酶活达到50IU/mL水解含有25％的魔芋精粉，搅拌水解1小时后加热升温到80℃，保温10min，进行终止酶解反应，冷却后水解液中粗纤维利用筛网进行过滤截留。

(2)过滤浓缩

首先，通过8000rpm高速离心去除寡糖液中的淀粉、粗纤维颗粒和残渣，再用0.2μm孔径的陶瓷膜截留寡糖液中少量的蛋白、可溶性淀粉、纤维等微粒物质，管道设置压力0.3MPa，中间加水不断循环洗滤至滤出的液体糖度低于1°Bx为止。最后，将陶瓷膜过滤后的寡糖液加入超滤膜设备中，设置过滤压力为0.3MPa，开始过滤分离。将超滤液倒入纳滤缓冲设备中，设置浓缩压力为1.5MPa，启动设备，开始浓缩。

(3)喷雾干燥

将经过纳滤膜提纯浓缩完成的魔芋寡糖液通过喷雾干燥塔进行喷雾干燥。启动干燥塔引风机，再启动干燥塔加热装置对塔内加热升温，待塔内温度升到180℃时打开雾化器设备，转数为2000r/min，再打开进料泵电源，设置蠕动泵流速为5L/h，启动蠕动泵开始寡糖液喷雾干燥。

实施例4酶菌元复合饲料添加剂的的制备

利用实施例1饲用益生菌、实施例2饲用酶制剂、实施例3饲用魔芋甘露寡糖半成品配制酶菌元复合饲料添加剂，每公斤含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 24675)166.7g、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis CICC 20446)100g、木聚糖酶100g、淀粉酶100g、葡萄糖氧化酶200g、魔芋低聚甘露寡糖150g和玉米淀粉183.3g，使用混合机将其混合均匀。最终枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 24675)含量为50×10⁸CFU/g和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis CICC 20446)含量为50×10⁸CFU/g，木聚糖酶酶活力为10000U/g、淀粉酶酶活力为500U/g和葡萄糖氧化酶酶活力为1000U/g，魔芋低聚甘露寡糖含量为15％。

实施例5仔猪养殖实验

1)仔猪饲料的制备

仔猪替抗饲料在基础日粮中添加500g/t的本发明的酶菌元复合饲料添加剂，正对照组为有抗饲料在基础日粮基础上添加复合抗生素，负对照组为喂食基础日粮。上述三种日粮经混合机混合均匀、并制粒，形成3种不同的仔猪日粮。各组日粮中粗蛋白质、钙和总磷等营养水平保持一致，营养水平参照NRC(2012)和中国猪饲养标准(2004)。各处理配方见表1，配方营养水平见表2。

表1各处理组配方(％)

表2配方养分指标

2)实验方案

采用全封闭式猪舍，舍内温度、湿度、通风强度、二氧化碳和氨浓度自动化控制，试验期间舍温保持在24～26℃，试验仔猪分栏饲养，饲养于1.5×1.5m²的圈内，漏缝喷塑地板，不锈钢可调式料槽，乳头式饮水器。颗粒料饲喂，自由采食和饮水。在试验开始，1天，28天时，分别称量断奶仔猪个体重及饲料重量，计算平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed:gain，F/G)。猪只死淘时记录死淘猪体重和该重复剩余料重，用于校正生长性能数据。

每天两次(上、下午)定点记录仔猪腹泻情况，并计算每个处理组的腹泻率和腹泻评分。

正常、圆柱形(0分)；

轻度腹泻：稀软、有形(1分)；

中度腹泻：粘稠、不成形、水份含量高(2分)；

重度腹泻：液态、不成形、水样稀粪(3分)。

其中，2分(含2分)以上记为腹泻，并详细记录治疗情况。

平均日增重(ADG)＝(试验末重-试验初重)/试验天数平均日采食量(ADFI)＝(试验期内供料量-试验期内饲料剩余量)/试验天数；饲料转化率(FCR)＝平均日采食量/平均日增重；腹泻率＝腹泻猪头次/(试验猪头数*总天数)*％；腹泻评分＝粪便评分总和/(试验猪头数*总天数)。

实验结果：由图1可知，与无抗日粮组相比，喂食500g/t的本发明的酶菌元复合饲料添加剂+基础日粮的仔猪可使料肉比下降4.52％，且差异显著(P<0.05)；日增重提高11.46％，日均采食量提高6.73％，且差异显著(P<0.05)；与有抗日粮正对照组相比，料肉比差异不显著(P>0.05)，日均采食量和日增重分别提高5.32％和4.39％，且差异显著(P<0.05)。由图2可知，替抗方案的腹泻率较负对照组降低了61.54％，且差异极显著(P<0.01)。

综上，本发明通过合理的优化和配伍，通过益生菌、酶制剂和益生元的组合，发明了一种可替代仔猪日粮中抗生素的复合微生态饲料添加剂，这种复合微生态饲料添加剂能够增加仔猪养殖过程中的日采食量、日增重，降低料肉比和腹泻率，从而增加仔猪饲养过程中的生产性能和经验效益，同时起到环保的作用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。