具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但 不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

本发明涉及抗体的序列：

实施例1 SARS-CoV-2S-RBD蛋白和S1蛋白特异性记忆B细胞分离

将购自义翘神州的CoV-spike RBD(40591-V05H)和CoV-spike-S1 (40591-V08H)用ReadLinkFITC抗体标记试剂盒(AATBioquest,1299)进行 荧光标记，获得荧光抗原S1-RBD-his-FITC和S1-his-FITC。从汕头大学医学院 第一附属医院采集新冠恢复期患者的新鲜血液样本，运用RosetteSep试剂盒 (Cat#：15064，STEMCELL)和Lymphoprep试剂(Cat#：07861， STEMCELL)，富集获得B细胞。在此基础上，经过荧光抗原S1-RBD-his- FITC标记，细胞表面分子染色，单细胞分选新冠RBD特异性记忆B细胞 (CD3^-CD19⁺CD27⁺CD38int S1-RBD⁺)，结果如图1。

为了获得新型冠状病毒除RBD以外的S1特异性记忆B细胞，经富集得到 的B细胞，首先与抗原RBD孵育，再用荧光抗原S1-his-FITC捕获以及细胞表 面分子染色，最终进行流式单细胞分选获得新冠S1特异性记忆B细胞(CD3^- CD19⁺CD27⁺CD38int S1⁺)，结果如图2。所有的抗原特异性B细胞被分选于96 孔板中，用于后续抗体可变区序列获得。

实施例2抗体可变区序列获取

将实施例1中用于抗原特异性B细胞分选的96孔板，每孔预先加入5μl TCL(Qiagen)；单个B细胞分选完成后，每孔加入10μl超纯水和33μl RNA Beads(南京诺唯赞)，吹吸混匀后室温放置10分钟，置磁力架5分钟后弃上清， 用200ul 80％乙醇漂洗磁珠两次，弃上清、风干磁珠后每孔加入10μl Mix A， 吹吸混匀后室温放置5分钟；置磁力架2分钟后每孔转移5μl至新的96孔板， 500g离心10s，运行程序1；程序1完成后每孔加入5μl Mix B(ThermoFisher)， 混匀离心后运行程序2，完成cDNA合成。

Mix A：H₂O、dNTP、Random 6、Oligo_dT按31:5:2:2混合。

Mix B：H₂O、Buffer、DTT、RNase I、RTase IV按17:16:4:2:1混合。

程序1：65℃5min→4℃∞

程序2：23℃10min→50℃30min→80℃10min→4℃∞

采用巢式PCR的方法扩增抗体重链(IgG)以及轻链(IgK)可变区基因。 第一轮PCR以cDNA为模板在一个反应体系中(20μl)同时扩增抗体IgG和 IgK可变区基因；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板在两个反应体系中分 别扩增抗体IgG和IgK可变区基因。DNA聚合酶均用Dream Taq Green (ThermoFisher)，引物序列源自于Human Monoclonal Antibodies书中第114至 115页，反应条件参照该书第130、131页。第二轮PCR产物经琼脂糖凝胶电 泳分析，挑选轻、重链阳性配对的用VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化， 然后进行抗体轻、重链可变区Sanger测序(ThermoFisher)。

实施例3抗体瞬时表达

从一名志愿者的PBMC中提取RNA、合成cDNA并作为模板，用设计好 的正向带有信号肽(MGWSCIILFLVATATGVHS，SEQ ID NO：25)编码序列 的引物分别PCR扩增Human-IgG1和Human-IgK恒定区基因，PCR产物纯化 后分别插入到表达载体pcDNA3.4(ThermoFisher)的多克隆位点处。经转化大 肠杆菌(DH5α)、挑取单菌落、扩大培养、提质粒、测序确认后得到抗体表达 载体pcDNA3.4-hIgG1和pcDNA3.4-hIgK。

通过对抗体轻、重链可变区序列进行分析、比对、分类(IgBLAST)，选 择合适的引物(Human Monoclonal Antibodies书中第114至115页)以第一轮 PCR产物为模板扩增抗体轻、重链可变区基因，并分别将其克隆入真核瞬时表 达载体pcDNA3.4-hIgK和pcDNA3.4-hIgG1的恒定区编码基因上游，转入大肠 杆菌(DH5α)进行扩增，抽提获得抗体轻、重链质粒。根据Expi293^TM Expression System(ThermoFisher)的操作说明，将抗体的轻、重链质粒转入 Expi293F细胞中进行表达。转染后第三天，收获上清，用Octet Red 96e蛋白互 作仪(ForteBio)测定抗体浓度。

实施例4中和抗体初步筛选

将通过密码子优化后合成的新冠病毒S基因克隆进PiggyBac转座系统转座 子载体(System Biosciences)中的多克隆位点中，构建S蛋白表达载体pMie- Swtd18S。将GFP基因克隆进第二代慢病毒系统转移载体(Addgene,85133) 的多克隆位点中，构建pLV-GFP报告基因载体。将pMie-Swtd18S、pLV-GFP 和第二代慢病毒系统包装载体psPAX(Addgene，12260)共转染至293T细胞 中，分别收获培养48小时和72小时的细胞培养上清，经浓缩纯化后得到新冠 假病毒。

将收获的细胞培养上清的起始浓度分别稀释为10ug/ml、1ug/ml和 0.1ug/ml，将带有GFP报告基因的新冠假病毒稀释为1500TU，取等体积的新 冠假病毒与稀释抗体混匀，37度作用1h后，全部转移至过表达hACE2的 H1299细胞中，培养48小时后，利用PerkinElmer公司OperaPhenix高内涵成 像系统测定每孔全视野下所有表达有GFP荧光的细胞，计算出每株抗体不同浓 度下的抑制率，抑制率＝[(空白对照孔平均GFP阳性细胞数–抗体孔GFP阳性细胞数)/(空白对照孔平均GFP阳性细胞数)]*100。

抑制率结果显示，在0.1ug/ml浓度下，共有4株RBD抗体其抑制率高于 75％，结合非RBD在0.1ug/ml浓度下有5株抗体其抑制率高于50％(表1)。 对结合RBD的抗体进一步测定IC₅₀，结果如表2所示，选出两株中和活性最优 的抗体，其针对新冠假病毒的IC₅₀分别为3.51ng/ml(24G1)和16.45ng/ml (24C7)。针对S1 non-RBD抗体，其中和活性不如结合RBD抗体，但上述筛 选出的5株抗体分别与24G1和24C7以1:1联用后，发现5株结合S1抗体与 24G1联用后可以提高高浓度抗体下的抑制率，另外将24G2与24C7联用后 IC₅₀降至9.66ng/ml，将24G1、24C7和24G2三者以1:1:1比例联用后，IC₅₀为 6.16ng/ml(表3)，提示这三株抗体的联用可有效抑制新冠假病毒的感染。

表1候选抗体不同浓度下抑制率结果

表2结合RBD候选抗体IC₅₀比较

表3不同抗体联用后IC₅₀比较

实施例5：中和抗体亲和力测定

将初筛的抗体克隆表达上清，采用AKTA pure的MabSelectPrismA纯化柱 (Cat:17-5498-53，GE)，进行亲和纯化。应用Fortebio公司的Octet Red96e蛋 白互作仪测定筛选所得抗体与S1-RBD-His及S1-His蛋白抗原(购买自义翘神 州)结合的亲和力。主要步骤如下：

采用AHC探针(Cat:18-5060)捕获抗体Fc段的方法测定抗体与S1-RBD- His和S1-His的结合。测定时将纯化后的24C7、24G1和24G2重组抗体 (4ug/mL)，流经AHC探针表面，时间为120s。不同浓度稀释的S1-RBD-His 和S1-His作为流动相。结合时间为240s，解离时间为240s。实验完毕，扣除 空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，Global减对照线 分析结果，计算抗原抗体结合的动力学常数，结果如表4和图3所示。

由图3可见，三个抗体均对S1重组蛋白有nM级的亲和力，但24G2抗体 跟RBD蛋白没有明显的结合曲线，说明其结合位点在S1蛋白的非RBD区域。

表4候选抗体与S1-RBD-His和S1-His重组蛋白的亲和力结果

实施例6：中和抗体表位竞争结合活性分析

将初筛出的3个抗体克隆24C7、24G1、24G2，利用Octet蛋白互作仪， 采取夹心法(Sandwich)进行表位分析。根据Biotin标记试剂盒EZ-Link^TM NHS-PEG12-Biotin的说明(Cat:A35389，ThermoFisher)，对抗体24C7、24G1、 24G2进行Biotin标记。利用Fortebio公司的Octet Red96e仪器，采用链霉亲和 素(SA)生物探针(Cat:18-5019)捕获Biotin的方法测定不同抗体的识别表位。 测定时，先将SA探针在Kinetics Buffer(PBS+0.02％tween20+1mg/ml BSA， pH 7.4)中平衡60s，然后将Biotin标记的24C7、24G1、24G2重组抗体 (5ug/mL)，流经SA探针表面，时间为90s，每个抗体各loading 4根SA探针。 流动相为100nM的S1-His蛋白(购自义翘神州)，结合180s；再次Kinetics Buffer平衡60s后，更换流动相为重组抗体24C7、24G1、24G2，浓度为100 nM，结合120s。实验完毕，观察各个抗体的识别表位是否存在竞争关系。

实验设计如表5所示，结果如图4所示。由图4可见，24C7结合S1-His 抗原后，不能再次结合24C7抗体，但可以很好的结合24G1和24G2抗体，这 提示24C7与24G1、24G2抗体识别的是不同的抗原表位。同样的情况，也完 全适用于24G1和24G2抗体。这说明，24C7、24G1和24G2这3个抗体识别 的是S1-His抗原上的3个不同表位，且相互之间没有竞争关系。

表5重组抗体结合表位分析的上样顺序

实施例7三株候选抗体分子的识别表位

为进一步探索三株候选中和抗体的表位信息，我们通过冷冻电子三维重构 技术(cryo-EM)解析S蛋白与抗体Fab片段的免疫复合物结构，分析抗体所 识别的表位。具体步骤如下：

(1)将纯化的三株候选抗体(24C7、24G1和24G2)进行木瓜蛋白酶切 制备Fab片段。木瓜蛋白酶与抗体按质量比1:400～1:1600的浓度配比，在37℃ 下反应10～12小时，最终加入碘乙酰胺(终浓度为30mmol/L)避光反应45min， 终止酶切反应。将上述混合液过夜透析至20mM Tris-HCl pH＝8.0的缓冲液，使 用阴离子DEAE-HPLC柱子纯化获得Fab片段。

(2)将纯化获得的Fab片段与S蛋白按质量比1.2:1的比例在37℃下反应 1小时，选用quantifoil商品化Holey Carbon铜网(规格为R2/2或2/1)用于冷 冻样品制备。使用Thermo Fisher Mark IV Vitrobot自动制样机对样品快速冷冻。 吸取3μL左右免疫复合物，滴加在铜网上，用滤纸吸去多余的液滴，滤纸blot 时间设为5s，blot force设为0，吸取残留液滴后，通过Vitrobot快速冷冻至液 态乙烷中，并转移至液氮中保存备用。

(3)将铜网转移至Gatan 626型冷冻样品杆。将冷冻样品杆冷却至接近液 氮温度(-196℃)，在液氮环境中，迅速将样品杆置入Thermo FisherF30冷冻电 镜样品腔室，电镜的放大倍数为93,000倍，pixel size为数据采集的相 机Thermo FisherFalcon3电子直接探测相机，使用Thermo Fisher EPU软件自动 采集冷冻电镜数据。

(4)将采集的数据利用Motioncorr2软件进行图片漂移校正；使用Gctf软 件进行CTF评估，确定欠焦水平和分辨率评估；使用cryoSPARC软件进行颗 粒挑选、2D分类、初始模型重构和三维重构，最终获得复合物的三维结构。

免疫复合物结构解析的结果如图5所示，三个抗体对应的免疫复合物的分 辨率分别为：S:24C7，S:24G1，S:24G2，抗体24C7和 24G1结合RBD，每个S三聚体分别结合三个抗体Fab片段；抗体24G2则结合 NTD，每个S三聚体结合三个24G2 Fab片段。

24C7主要针对表位为S蛋白第444位至第448位氨基酸(aa444-448)以 及第484位至第505位氨基酸(aa484-505)；24G1主要针对表位为S蛋白第 343位至第347位氨基酸(aa343-447)以及第440位至第450位氨基酸 (aa440-450)；24G2主要针对表位为S蛋白第144位至第153位氨基酸 (aa144-153)以及第246位至第255位氨基酸(aa246-255)。从3株候选中和 抗体与S蛋白的复合物结构可以看出，两株RBD抗体24C7和24G1的表位有 一定程度的重叠，但与NTD抗体24G2表位无重叠。

实施例8抗体对新冠病毒中和活性(IC₅₀)测定

利用空斑减少实验对三株中和抗体对新冠真病毒中和活性进行评估。将纯 化得到的抗体起始浓度稀释为63.2ug/ml，进行3.16倍倍比稀释，共10个稀释 度。向上述各个抗体稀释度分别与100PFUSARS-CoV-2病毒等体积混匀后， 37度孵育1小时，空白对照中加入抗体稀释液替代抗体。1小时后，将病毒抗 体混合物全部转移至Vero细胞中，37℃吸附1小时后弃去吸附液，向Vero细 胞中加入半固体培养基(DMEM/0.9％低熔点琼脂糖凝胶)，4℃放置半小时后 转入37℃，5％CO₂倒置培养3天。培养3天后，向细胞中加入4％甲醛固定，2小时后弃去甲醛和半固体培养基，加入0.1％结晶紫染液染色半小时，最后弃去 结晶紫染液，冲洗晾干后，数出每个细胞孔中病毒成斑数，计算每个抗体稀释 度下的病毒抑制率，抑制率(％)＝[(空白对照孔平均成斑数–抗体孔成斑数) /(空白对照孔平均成斑数)]*100。利用Prism 7软件对各个浓度下的抑制率 进行非线性拟合分析计算各抗体的IC₅₀值。

结果如图6和表6所示。结果显示两株针对RBD抗体(24G1和24C7)的 中和活性优于针对S1非RBD抗体24G2，其IC₅₀分别为0.0138ug/ml(24G1)， 0.077ug/ml(24C7)，在6.32ug/ml浓度下抑制率为100％。根据抑制率结果， 24G2在约2ug/ml浓度下抑制率约为50％，在63.2ug/ml浓度下抑制率为100％。

同样利用空斑减少实验对三株中和抗体联用后的中和活性进行评估。将纯 化后的三株抗体进行两两联用以及三个抗体联用，组方抗体均以等比例混合。 结果如图7和表6所示，两个抗体两两组合后其中和活性均出现显著提高，其 主要表现在各抗体组合达到100％抑制率的浓度降低了10～30倍。尽管24G2 中和活性弱于24G1和24C7，但24G2分别与24G1和24C7联用后其中和活性 有所提高。表位竞争结果显示三株抗体结合在三个不同表位，这提示两两组合 后中和活性提高可能是叠加效应所致。

表6各抗体组合中和活性(IC₅₀)比较

实施例9：抗体ACE2阻断活性检测

3株高亲和力抗体中，24C7和24G1结合在S1-RBD抗原上。利用Octet Red96e蛋白互作仪，采用预混法(Pre-mix)来检测这两个抗体是否可以阻断 S1-RBD抗原与SARS-CoV-2受体蛋白ACE2的结合。首先，将浓度为 75μg/mL的抗体24G1、24C7和CR3022(对照抗体)以及PBS跟100nM的 S1-RBD抗原1:1混匀，室温孵育30min。测定时，先将His1K探针(Cat:18-5120)在Kinetics Buffer中平衡60s，然后将浓度为20μg/mL的重组ACE2-His 蛋白(购自义翘神州)流经His1K探针表面，时间为180s；再次在Kinetics Buffer中平衡180s，然后更换流动相为预混的抗体和S1-RBD抗原混合物，结 合180s。实验完毕，观察预混的抗原抗体混合物是否有结合信号。

结果如图8所示，重组抗体24C7与S1-RBD抗原混合后，再跟ACE2蛋白 结合，没有明显的结合信号，说明24C7抗体阻断了S1-RBD与ACE2的结合； 而重组抗体24G1和对照抗体CR3022跟S1-RBD结合后，跟ACE2蛋白出现了 明显的结合信号，说明这两个抗体不能阻断S1-RBD与ACE2的结合。上述结 果表明，虽然24C7和24G1都结合在S1-RBD抗原上，但只有24C7可以阻断 S1-RBD与ACE2的结合。

实施例10三株候选抗体分子的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)

ADCC是利用抗体介导清除被感染细胞(靶细胞)的理想机制。抗体与靶 细胞表面上的目标抗原结合，如果抗体的Fc段同时结合到效应细胞(主要为 自然杀伤细胞，NKcells)表面的Fc g RIIIa(CD16)受体上，两种类型的细胞 即发生反应，导致ADCC作用机制通路的激活。

为了检测三株候选分子的ADCC效应，我们选择过表达ACE2受体的 H1299细胞，并与S抗原共孵育作为靶细胞。抗体24G1、24C7、24G2以 300ug/ml的起始浓度，3倍梯度稀释九个稀释度后分别与5×10⁴个/孔H1299-S 细胞共同孵育1小时，再加入1×10⁵个/孔Jurkat细胞作为效应细胞，共同培养 10小时。取上清检测效应细胞的激活情况。效应细胞中由NFAT(活化T细胞 核因子)通路介导的基因转录的激活是ADCC作用机制通路激活过程中较早的事件。此外，Jurkat细胞稳定表达了Fc g RIIIa(CD16)受体(和由NFAT应答 元件驱动表达的萤火虫萤光素酶。抗体在ADCC作用机制中的生物活性通过 NFAT通路活化产生的萤光素酶定量，而效应细胞中的萤光素酶活性通过生物 发光读数定量。我们以不加入抗体组荧光信号作为背景值，从而计算出相应抗 体不同浓度下荧光信号增加的倍数。

结果如图9所示。我们发现24G2比24G1和24C7有更强的ADCC作用， 尤其是在较低浓度抗体水平下依旧能够维持其ADCC作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市福田区格物智康病原研究所

<120> 一种抗新型冠状病毒刺突蛋白的全人源单克隆抗体及其应用

<130> 2021.04.28

<160> 25

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Ala Arg Gly Trp Val Val Pro Ala Ala Ile Pro Tyr Asn Trp Phe Asp

1 5 10 15

Pro

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Trp Val Val Pro Ala Ala Ile Pro Tyr Asn Trp Phe Asp

100 105 110

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Ala Ala Ser

1

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Gln Gln Ser Glu Thr

1 5

<210> 8

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Thr Phe Gly Gln

85 90 95

Gly Thr Lys Val Glu Val Lys

100

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Ile Asn Thr Tyr Asn Gly His Thr

1 5

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 11

Ala Arg Val Glu Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Cys Asp Pro

1 5 10 15

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly His Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Glu Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Cys Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 13

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 14

Ile Ala Ser

1

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 15

His Gln Ser Tyr Ser Ser Pro His Thr

1 5

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ile Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Tyr Ser Ser Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 17

Gly Tyr Thr Leu Ile Glu Leu Ser

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 18

Phe Asp Pro Glu Lys Gly Glu Thr

1 5

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 19

Ala Ala Ser Pro Ala Ile Tyr Ser Asn Tyr Pro Gln Thr Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Tyr Gly Met Asp Val

20

<210> 20

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Ile Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Lys Gly Glu Thr Ile His Ala Gln Asn Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Pro Ala Ile Tyr Ser Asn Tyr Pro Gln Thr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 21

Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 22

Lys Ile Ser

1

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 23

Thr Gln Ala Thr Gln Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 24

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 25

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser