具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 人源化新冠病毒中和性抗体nCoV-00D的制备及功能

一、材料

1. pcDNA-3.1载体为本实验室保存。菌株Top 10购自中国天根试剂公司。

2. 抗原：新型冠状病毒RBD蛋白由本实验室表达

3. Expi293F细胞、293T细胞、Huh7细胞均由本实验室保存。

二、方法与结果

1. 针对RBD的单克隆抗体的杂交瘤细胞构建和筛选

1.1 RBD动物免疫和免疫情况鉴定

用表达纯化好的RBD蛋白免疫8周龄的BALB/c小鼠，共免疫4次。第一次免疫时RBD蛋白与等量弗氏完全佐剂混匀后免疫，第二次是2周后RBD蛋白与等量弗氏不完全佐剂混匀后免疫，第三次免疫是再过2周用RBD蛋白与等量弗氏不完全佐剂混匀后免疫，第4次免疫是一个月后RBD蛋白与等量弗氏不完全佐剂混匀后免疫。免疫途径均为腹部皮下免疫，免疫剂量为0.5μg/只。融合前3天做加强免疫，用不加佐剂的RBD蛋白腹腔注射，5 mg/只。采集免疫前后的小鼠血清，摸索抗原最佳的包被浓度、最佳包被条件，最佳封闭条件，抗体工作浓度和最佳反应时间等条件建立间接ELISA方法并用该方法检测小鼠的免疫抗体水平。结果表明，免疫后抗体滴度较高，如表1所示。

表1

1.2 杂交瘤细胞的获得和筛选

取未免疫BALB/c饲养细胞，适当的稀释后分装到5～10块96孔细胞板上，100μL/孔。取已经免疫BALB/c脾脏充分的研磨，取细胞悬液进行计数。将脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞按5～10:1的比例融合后接种到铺有饲养细胞的细胞板中。以间接ELISA方法检测细胞分泌至上清中的抗体。待亚克隆前共检测3次。获得一株能够分泌抗体的杂交瘤细胞命名为nCoV-00D。

2. 抗体可变区基因的核酸序列分析及人源化改造

使用Trizol提取选定杂交瘤细胞RNA并反转录，将扩增后产物连接至T载体（takara购买）并测序。经过碱基优化后合成序列，设计引物（重链上游cctgtgggttttgctgCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTCAGGTGCAGCTGCAGCAGA；重链下游gctggctgaggagacggtGGCAGACACTGTCACCAGGG；轻链上游cctgtgggttttgctgCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGATATCGTGCTGACACAGTCTCC；轻链下游gtgcagccacagttcgCTTGATCTCCAGCTTTGTTCCTC）扩增出人源化抗体轻重链可变区基因片段，在κ链5’和3’端，重链5’和3’端引入BamHⅠ/ Xho I酶切位点，分别将轻重链克隆到全抗体表达载体pcDNA3.1载体，获得重链以及轻链重组载体，命名为pcDNA3.1-nCoV-00D VH和pcDNA3.1-nCoV-00D VK。

3. 全抗体重组表达质粒的构建与表达纯化

取构建好表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）溶液按1:5（w/v）混合后，瞬时转染密度为2×10⁶的Expi293F细胞（Invitrogen），37℃孵育120rpm摇床培养4天后，采用GE公司的Protein-A亲和层析柱分别纯化收集上清。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析抗体纯度，用截流量30 kDa的浓缩管（Millipore生产）后使用GE公司的分子筛近一步纯化。结果表明，能够表达纯化出一定浓度及纯度的nCoV-00D抗体（图1）。

4. 抗体nCoV-00D的功能检测

4.1 IBIAcore法测定抗体亲和力

表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种光学物理现象。当一束偏振光在一定的角度范围内入射到棱镜端面，在棱镜与金属薄膜的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。运用SPR技术，可以免标记实时得到分子间互相作用。分析时，先将偶联物偶联到芯片上，然后将分析物流过芯片表面，若偶联物与分析物有结合活性，则会引起金属膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，并以Biacore的响应信号值RU来呈现通过检测SPR角度变化，获得野生型及突变株RBD与nCoV-00D的动力学常数（结合速率常数ka、解离速率常数kd、亲和力常数KD）和特异性等信息。

数据结果处理使用Biacore Insight Evaluation程序软件输出原始数据，并进行1:1 Binding结合模式进行动力学拟合分析。根据拟合结果得到结合速率常数（ka）和解离速率常数（kd）以及亲和力常数（KD）。如表2所示，nCoV-00D针对新冠病毒RBD蛋白野生型的亲和力为5.32×10^-10M；对RBD突变型（N501Y）亲和力为2.46×10^-13M；对RBD突变型（K417TE484K N501Y）亲和力为5.30×10^-13M；对RBD突变型（K417N E484K N501Y）亲和力为7.91×10^-12M（图2）。

表2

4.2 流式细胞术检测检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与新型冠状病毒RBD蛋白结合活性

取GFP-ACE2蛋白表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)比例混合后，瞬时转染汇合度达80％的Expi293T细胞，置于37℃ CO₂孵箱，培养36h。将细胞消化下来用PBS洗3次，加入Alexa Fluor 647标记的RBD蛋白，检测RBD和ACE2结合能力；将Alexa Fluor 647标记的RBD蛋白500ng和2.5 mg nCoV-00D抗体室温孵育30min后加入消化下来的细胞。用PBS洗3次。用PBS洗3次后用200ul的PBS将细胞重悬，随后上机检测(BD FACSAria^TMII)。结果如图3所示，图中横坐标为GFP-ACE2的荧光强度。与只加入RBD蛋白的对照组相比，与抗体混合RBD蛋白的实验组可见Alexa Fluor-647细胞群百分比明显下降，表明nCoV-00D抗体可与新型冠状病毒RBD蛋白结合抑制RBD蛋白和宿主细胞ACE2的结合。

4.3 抗体nCoV-00D对新型冠状病毒(假病毒)中和试验

首先，包被假病毒，步骤简略如下：将293T（ATCC）铺在六孔板中，每孔1X106个细胞。然后按照相应比例（pEZT-S：psPSX2：plvx-Luciferase=0.75：1.5：2）转染细胞，6-8小时后换液，换成含1.5ml 10%血清的完全培养基。48-72 h后收取病毒上清，重新加入新鲜培养基。将病毒4000 rpm，离心10min，测定毒价后分装保存。然后，在96孔板中均匀接种Huh7细胞，待细胞贴壁后进行假毒抗体中和实验。从最高终浓度1ug/ml起，用无血清DMEM培养基三倍梯度稀释至0.0003ug/ml；用无血清DMEM培养基稀释假毒，取50ul抗体稀释液与50ul假毒稀释液（/孔）涡旋混匀，37℃静置孵育1h，最后加入对应假毒抗体中和液，24h后检测荧光素酶值。结果表明，抗体nCoV-00D可以高效和假病毒结合，阻断假病毒结合宿主细胞，IC₅₀值约为9 ng/ml(图4)，说明nCoV-00D抗体中和活性较强。

4.4 间接免疫荧光检测nCoV-00D对新冠病毒感染宿主细胞的影响

将Huh7细胞铺于共聚焦皿中，将一定浓度的抗体与病毒37度孵育1h（同时设置病毒感染细胞的对照组），然后接种于细胞中，感染16h后，用4%PFA固定30min，0.5%TritonX-100/PBS破膜通透处理25min，用1%BSA/PBS 37℃封闭1h后，加入anti-SARS-CoV-2 Spike一抗37℃孵育2h,然后加入荧光二抗及DAPI染核。PBST清洗之后，用防荧光淬灭剂封片，避光保存于4℃，最后用荧光共聚焦显微镜拍照观察。结果表明，与对照组相比试验组内S蛋白荧光强度和数量都显著下降(图5)，表明nCoV-00D抗体能够抑制新型冠状病毒感染宿主细胞。

4.5 免疫印迹检测nCoV-00D对新冠病毒感染宿主细胞的影响

将Huh7细胞铺于12孔板中，将一定浓度的抗体与病毒37度孵育1h（同时设置病毒感染细胞的对照组），然后接种于细胞中，感染16h后，用RIPA裂解液裂解细胞，利用免疫印迹的方法检测病毒N蛋白的表达情况。结果表明，与对照组相比抗体试验组中细胞内N蛋白表达显著减少(图6)，表明nCoV-00D抗体能够抑制新型冠状病毒感染宿主细胞。

4.6 实时定量PCR检测nCoV-00D对新冠病毒感染宿主细胞的影响

将Huh7细胞铺于12孔板中，将一定浓度的抗体与病毒37度孵育1h（同时设置病毒感染细胞的对照组），然后接种于细胞中，感染16h后，收取感染细胞上清并提取RNA，利用一步法荧光定量的方法检测病毒ORF1 的mRNA表达水平。结果表明，与对照组相比，抗体组细胞上清中的病毒mRNA显著减少(图7)，表明nCoV-00D抗体能够抑制新型冠状病毒感染宿主细胞。

序列表

<110> 北京鹭飞生物科技

<120> 人源化新冠病毒中和性抗体 nCoV-00D 及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Ile Phe Ile Thr Thr Val Ile Ala Arg Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ser Val Glu Tyr Ser Gly Thr Thr Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

His Gln Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ser

20 25 30

Gly Thr Thr Leu Met Gln Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys His Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Phe Ile Thr Thr Val Ile Ala Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu

<210> 9

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatatcgtgc tgacacagtc tccagcaagc ctggccgtga gcctgggaca gcgggccaca 60

atctcctgca gagccagcga gtccgtggag tactccggca ccacactgat gcagtggttc 120

cagcagaagc ctggccagcc ccctaagctg ctgatctatg ccgcctccaa cgtggagtct 180

ggagtgcctg caaggttctc tggaagcgga tccgaaccga cttttccctg aatatccacc 240

cagtggagga ggacgatgtg gccatgtact tctgtcacca gtctagggag gtgccatgga 300

cctttggcgg aggaacaaag ctggagatca ag 332

<210> 10

<211> 356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggtgcagc tgcagcagag cggagcagag ctggtgaagc caggagcctc tgtgaagctg 60

agctgcaaga cctccggcta cacctttaca cggtactata tctattgggt gaagcagcgg 120

cccggacagg gcctggagtg gatcggcgag atcaacccta acaatggcgg cacaaacttc 180

aatgagaagt ttaagtccaa ggccaccctg acatggacaa gagctccaat accgcctaca 240

tgcagctgtc tagcctgaca agcgaggatt ccgccgtgta ctattgtacc atcttcatca 300

ccacagtgat cgcaagggac tattggggac agggcaccct ggtgacagtg tctgcc 356

<210> 11

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val

35 40 45

Glu Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Met Gln Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu

85 90 95

Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys His

100 105 110

Gln Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 12

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Tyr Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Ile Phe Ile Thr Thr Val Ile Ala Arg Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 13

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggagacgg atacgctgct cctgtgggtt ttgctgctct gggttccagg ttccactgat 60

atcgtgctga cacagtctcc agcaagcctg gccgtgagcc tgggacagcg ggccacaatc 120

tcctgcagag ccagcgagtc cgtggagtac tccggcacca cactgatgca gtggttccag 180

cagaagcctg gccagccccc taagctgctg atctatgccg cctccaacgt ggagtctgga 240

gtgcctgcaa ggttctctgg aagcggatcc ggaaccgact tttccctgaa tatccaccca 300

gtggaggagg acgatgtggc catgtacttc tgtcaccagt ctagggaggt gccatggacc 360

tttggcggag gaacaaagct ggagatcaag cgaactgtgg ctgcaccaag cgtgtttatc 420

ttccctccca gcgacgagca gctgaagagc ggcaccgcca gcgtggtctg tctcctgaac 480

aacttctatc ccagggaggc caaggtccag tggaaagtgg acaacgccct gcaaagcggc 540

aatagccagg agtccgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctgtccagc 600

accctgaccc tcagcaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcttg cgaggtgacc 660

catcagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaaca ggggcgaatg cagctaa 717

<210> 14

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggagacgg atacgctgct cctgtgggtt ttgctgctct gggttccagg ttccactcag 60

gtgcagctgc agcagagcgg agcagagctg gtgaagccag gagcctctgt gaagctgagc 120

tgcaagacct ccggctacac ctttacacgg tactatatct attgggtgaa gcagcggccc 180

ggacagggcc tggagtggat cggcgagatc aaccctaaca atggcggcac aaacttcaat 240

gagaagttta agtccaaggc caccctgaca gtggacaaga gctccaatac cgcctacatg 300

cagctgtcta gcctgacaag cgaggattcc gccgtgtact attgtaccat cttcatcacc 360

acagtgatcg caagggacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtc tgccaccgtc 420

tcctcagcca gcaccaaagg cccgagcgtg tttccgctgg cgccgagcag caaaagcacc 480

agcggcggca ccgcggcgct gggctgcctg gtgaaagatt attttccgga accggtgacc 540

gtgagctgga acagcggcgc gctgaccagc ggcgtgcata cctttccggc ggtgctgcag 600

agcagcggcc tgtatagcct gagcagcgtg gtgaccgtgc cgagcagcag cctgggcacc 660

cagacctata tttgcaacgt gaaccataaa ccgagcaaca ccaaagtgga taaacgcgtg 720

agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg 780

ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga 840

cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca 900

actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt 960

acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg 1020

gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacta 1080

tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg 1140

atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg 1200

acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc 1260

ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca 1320

ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact 1380

acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 1418