一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法
阅读说明：本技术 一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法 (Haematococcus pluvialis culture medium, preparation method thereof and haematococcus pluvialis culture method ) 是由 刘志媛 朱浩祯 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微藻产生高附加值产品的生物培养技术领域,特别涉及一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法。该雨生红球藻培养基包括基础培养基、江蓠属海藻提取物和赖氨酸芽孢杆菌。本发明通过在雨生红球藻培养过程中添加江蓠属海藻提取物和赖氨酸芽孢杆菌,可显著提升雨生红球藻生物量和虾青素产量。(The invention relates to the technical field of biological culture of microalgae for producing products with high added values, in particular to a haematococcus pluvialis culture medium, a preparation method thereof and a haematococcus pluvialis culture method. The haematococcus pluvialis culture medium comprises a basic culture medium, gracilaria algae extracts and lysine bacillus. According to the invention, the gracilaria algae extract and lysine bacillus are added in the haematococcus pluvialis culture process, so that the biomass and astaxanthin yield of the haematococcus pluvialis can be obviously improved.)
技术领域
本发明涉及微藻产生高附加值产品的生物培养
技术领域
，特别涉及一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法。背景技术
天然虾青素(Astaxanthin)是一种具有高抗氧化活性的类胡萝卜素类的色素，其抗氧化效果是β-胡萝卜素的10倍，维生素E的550倍。虾青素能够清除活性氧和自由基等，增强生物体的免疫力，可辅助心血管疾病、免疫系统、炎症和神经退行性等疾病康复，同时具有抗衰老和修复紫外线损伤的功能，在食品及医药方面有着广泛的应用前景；又可通过动物食用直接贮藏在动物组织中，使鲑鱼和鳟鱼、虾等的肉和壳呈现鲜红色的色素，在水产养殖等方面具有重要应用价值。
虾青素来源有微藻、真菌、甲壳类动物的废弃物以及化学合成等。人工合成虾青素价格昂贵，仅被批准用作如三文鱼等海产品的着色剂；来自甲壳类动物的天然虾青素含量低而且不易规模开发。目前，真菌红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)和微藻雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是公认的较适宜的天然虾青素来源。由于红法夫酵母中的虾青素平均含量仅有0.4％，生产效率较低，而雨生红球藻是已知生物体中虾青素积累量最高的物种，在特定的环境下能大量累积虾青素，其含量可达细胞干重的1.5-4％。因此，利用雨生红球藻为生物材料生产虾青素仍然为国际天然虾青素产业的研究热点。
雨生红球藻的细胞周期大致可分为游动细胞和不动细胞两种，能够根据环境改变自身形态，在适宜生长环境下为绿色游动细胞，在不利环境中则积累虾青素，转变为红色厚壁孢子。在生产上，常采用两步培养法以获取最高虾青素产量：第一步提供藻细胞最适宜生长条件以获取最高的藻细胞生物量；第二步通过逆境诱导雨生红球藻细胞积累虾青素产，以达到最高虾青素产量。
目前，常采用BG11液体培养基培养雨生红球藻，再以限氮、盐或高光诱导雨生红球藻积累虾青素。但现有技术中虾青素产量仍有待进一步提高，以降低生产成本，提高经济效益。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法。该方法可显著提高虾青素的产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种雨生红球藻培养基，包括基础培养基、江蓠属海藻提取物和赖氨酸芽孢杆菌。
作为优选，江蓠属海藻选自但不限于细基江蓠(Gracilaria tenuistipitata)、细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tunuistipitata V.liui)、帚状江蓠(Gracilaria edulis)。
作为优选，基础培养基为BG11液体培养基。其它适合雨生红球藻扩增的基础培养基也在保护范围之内。
作为优选，BG11液体培养基的配方为：
在本发明提供的具体实施例中，BG11液体培养基的配方为：
在本发明提供的具体实施例中，硫酸镁为七水合硫酸镁。
在本发明提供的具体实施例中，磷酸氢二钾为三水合磷酸氢二钾。
在本发明提供的具体实施例中，柠檬酸为一水合柠檬酸。
在本发明提供的具体实施例中，硫酸锌为七水合硫酸锌。
在本发明提供的具体实施例中，钼酸钠为二水合钼酸钠。
在本发明提供的具体实施例中，硫酸铜为五水合硫酸铜。
本发明还提供了一种上述雨生红球藻培养基的制备方法，包括以下步骤：
将江蓠属海藻与水混合研磨，所得浆液经过滤、煮沸、冷却，得到江蓠属海藻提取物；
基础培养基、江蓠属海藻提取物和赖氨酸芽孢杆菌组成雨生红球藻培养基。
作为优选，江蓠属海藻与水的体积比为1：(5～50)。
在本发明提供的具体实施例中，江蓠属海藻与水的体积比为1：20。
本发明还提供了一种雨生红球藻的培养方法，包括以下步骤：
向基础培养基中添加江蓠属海藻提取物，得到雨生红球藻培养基；将雨生红球藻藻种接种于雨生红球藻培养基中，进行扩增培养；
向扩增培养体系中添加赖氨酸芽孢杆菌，在逆境条件下对雨生红球藻进行诱导培养。
作为优选，江蓠属海藻提取物与基础培养基的体积比为1：(100～1000)；
优选地，江蓠属海藻提取物与基础培养基的体积比为1：500。
作为优选，扩增培养的条件为：温度为25±1℃，每日的光暗周期(12～24)h:(0～12)h，光照条件为30～40μmoL/m2·s；静止培养或通气培养；培养5～14天。
优选地，扩增培养的条件为：每日的光暗周期12h:12h。
作为优选，静止培养过程中，每日摇藻1～5次。
作为优选，通气培养为采用通气设备进行通气培养。
作为优选，赖氨酸芽孢杆菌的菌液OD500为0.3～0.7，菌液添加量为0.5％～2％。但本发明并非限定于此种添加方法。
优选地，赖氨酸芽孢杆菌的菌液OD500为0.5，菌液添加量为1％。
作为优选，诱导培养的条件为：温度为23±1℃，培养5～20d。
作为优选，逆境条件为：1‰～10‰盐和/或10000～20000Lux高光。
在本发明提供的具体实施例中，盐为氯化钠。
本发明提供了一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法。该雨生红球藻培养基包括基础培养基、江蓠属海藻提取物和赖氨酸芽孢杆菌。本发明有益效果如下：
(1)江蓠属海藻分布广泛，材料易获得且成本较低，在雨生红球藻的绿色营养阶段添加0.2％的江蓠提取液可以获得高于对照15％以上的生物量。另外，江蓠提取液在制备过程中无任何化学成份添加，剩余藻渣还可用作高等植物的生物肥。所以雨生红球藻培养基中添加江蓠提取液是一种性价比高，且环境友好可持续的方法。
(2)雨生红球藻积累虾青素的过程必须要经过逆境诱导，而在这一过程中，部分藻细胞会因胁迫而死亡，从而降低虾青素的最终产量。在逆境诱导过程中，向藻液中添加1％赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macroides)，可显著降低细胞死亡率，而单细胞的虾青素含量并未受显著影响，从而可提高虾青素产量约两倍。1％赖氨酸芽孢杆菌经浮游动物实验无毒。
附图说明
图1为添加海藻提取液对雨生红球藻144(A)和721(B)细胞密度的影响；
图2为雨生红球藻144(A)和721(B)10d时细胞数目；其中，1：光暗比为12h:12h，加菌；2：光暗比为16h：8h，加菌；3：光暗比为20h：4h，加菌；4：持续光照，加菌；5：光暗比为12h:12h，不加菌；6：光暗比为16h：8h，不加菌；7：光暗比为20h：4h，不加菌；8：持续光照，不加菌。
具体实施方式
本发明公开了一种雨生红球藻培养基及其制备方法和雨生红球藻培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例以两株红球藻为试验材料：雨生红球藻721(Haematococcuspluvialis FACHB-721)；雨生红球藻144(Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144)。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1利用海藻提取液和菌液促进雨生红球藻生物量和虾青素产量的方法
本发明实施例包括以下步骤：
1、雨生红球藻细胞培养
(1)江蓠属海藻提取液的制备：
本实施例所用江蓠属藻体为细基江蓠(Gracilaria tenuistipitata)和帚状江蓠(Gracilaria edulis)。取江蓠属新鲜藻体，与自来水按照1:20比例混合研磨，纱布过滤后获得液体煮沸冷却后即为江蓠提取液。
(2)雨生红球藻培养基的制备：
在基础培养基中添加江蓠提取液(添加浓度为江蓠提取液:雨生红球藻基础培养液＝1：500)，基础培养基的组成如表1：
表1 BG11液体培养基配方
名称
添加量mg/L
硝酸钠
1500
七水合 硫酸镁
75
三水合 磷酸氢二钾
40
一水合 柠檬酸
6.6
氯化钙
27.2
柠檬酸铁胺
6.6
乙二胺四乙酸二钠EDTA-2Na
1.1
硼酸
2.86
硫酸锰
1.8
七水合 硫酸锌
0.22
二水合 钼酸钠
0.39
五水合 硫酸铜
0.08
氯化钴
0.04
碳酸钠
20
(3)雨生红球藻的培养：
取适量藻种接种于上述培养基中，培养的温度为25±1℃，每日的光暗周期12h:12h，光照条件为30-40μmoL/m2·s。静止培养，每日定期摇藻三次。培养14天。
江蓠提取液能促进雨生红球藻绿色游动细胞生长，提高绿色营养阶段的细胞产量，比对照细胞产量提高15％以上。
2、通过逆境诱导雨生红球藻细胞积累虾青素
诱导雨生红球藻积累虾青素的逆境条件是：5‰盐和10000-20000Lux高光。温度为23±1℃，培养5～20d。在这一阶段，向培养基中添加1％赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)(OD500为0.5左右)菌液，能够显著提高细胞耐受性，降低诱导过程中细胞死亡率，最终提高虾青素总产量约两倍。
试验例1海藻提取液对雨生红球藻生长的影响
取指数生长期的两种雨生红球藻，接种于250mL的锥形瓶中，每瓶含有200mL BG11培养基。设4个处理：分别添加细基江蓠提取液(j)、两种硅藻提取液(G、g)、小球藻提取液(x)各2mL；以不加藻液的为对照(d)放入培养箱持续培养14天。每隔2天，利用血细胞计数板计数。
图1结果表明，两株雨生红球藻在添加江蓠提取液后，细胞密度从第二天开始均显著高于其他处理(P<0.05)，而添加硅藻与小球藻液的雨生红球藻表现了先促进后抑制的现象。藻细胞初始密度为5×104/mL，添加江蓠提取液的雨生红球藻144与721在静置培养14天后，藻细胞密度分别达到了6.0×105/mL和5.9×105/mL；比对照提高了17.6％和15.7％。
试验例2赖氨酸芽孢杆菌提高雨生红球藻虾青素产量
诱导细胞初始密度为5×105/mL，光照强度为20000Lux；盐度为5psu；处理组每瓶添加2mL以赖氨酸芽孢杆菌为主要菌种的菌液(OD500为0.5左右)；温度为23±1℃，培养10d，血球计数板测定细胞数目，分光光度计法测定虾青素产量。
两种雨生红球藻在10d诱导后的细胞数目均下降。但是添加菌液的实验组(1-4号)细胞数目极显著(P＜0.01)高于不加菌液组(5-8号)，表明添加菌液可显著提高雨生红球藻的抗逆性(图2)。添加菌液的红球藻单细胞虾青素含量在10天诱导期显著低于不加菌液，但单位体积的藻细胞虾青素产量显著提高，加菌比不加菌的对应诱导条件下的红球藻虾青素产量提高了约2倍。藻株144在高光、高盐、光周期为12h的诱导条件下，10天虾青素产量是不加菌同样诱导条件下的1.89倍。
表2雨生红球藻144A诱导10d虾青素含量
表3雨生红球藻721诱导10d虾青素含量
试验例3海藻提取液对雨生红球藻生长的影响
取指数生长期的两种雨生红球藻，接种于250mL的锥形瓶中，每瓶含有200mL BG11培养基。设2个处理：添帚状江蓠(Gracilaria edulis)提取液(j)2mL；以不加藻液的为对照(d)放入培养箱持续培养14天。每隔2天，利用血细胞计数板计数。
结果表明，两株雨生红球藻在添加江蓠提取液后，细胞密度从第二天开始均显著高于对照处理(P<0.05)。添加江蓠提取液的雨生红球藻144与721在培养14天后，藻细胞密度分别达到了5.8×105/mL和6.1×105/mL；比对照提高了16.1％和18％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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