构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法
阅读说明：本技术 构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法 (Method for screening nisin high-producing bacteria by constructing nisin cell molecular sensor ) 是由 肖毅 于 2021-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法,本发明的方法可以响应外界的乳链菌肽,并输出红色荧光,荧光值与乳链菌肽浓度在一定范围内可用公式拟合。该生物传感器被证明可以用于检测生产菌株发酵液上清中的乳链菌肽含量,对乳链菌肽生产菌株ATCC11454进行了常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变和自然突变,并利用生物传感器NZ9000-RFP筛选突变菌株,最终获得效价提升了41.2％和17.0％的突变株A4-2和H4-3。(The invention relates to a method for screening nisin high-yielding bacteria by constructing a nisin cell molecular sensor. The biosensor is proved to be used for detecting the content of nisin in the supernatant of the fermentation liquor of a production strain, normal pressure Room Temperature Plasma (ARTP) mutagenesis and natural mutation are carried out on nisin production strain ATCC11454, and mutant strains are screened by the biosensor NZ9000-RFP, so that mutant strains A4-2 and H4-3 with the titer improved by 41.2 percent and 17.0 percent are finally obtained.)
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，涉及一种构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法；尤其涉及一种基于基因工程手段获得的乳链菌肽细胞分子传感器检测乳链菌肽产生菌效价的方法。背景技术
乳链菌肽(Nisin)是一种含有34个氨基酸的多肽，分子量为3353Da，以二聚体或者四聚体形式存在。对多种革兰氏阳性菌具有抑菌作用，因易降解、无毒性而被允许用作天然防腐剂添加于食品中。乳链菌肽由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)或链球菌生成，现已发现六种类型的Nisin，分别为NisinZ，NisinA，NisinB，NisinC，NisinD，NisinE,且NisinA和NisinZ是天然状态下存在的主要形式，且研究最为深入。NisinA与NisinZ的主要差别在于，NisinA中第27位氨基酸为组氨酸(His)，NisinZ中第27位氨基酸为天冬酰胺(Asn)。Nisin结构中含有5个硫醚键形成的分子内环，其中四个是β-甲基羊毛硫氨酸Ala-S-Aba，另一个是羊毛硫氨酸，即Ala-S-Ala。能够生产Nisin的许多乳酸乳杆菌已从不同来源分离，如发酵食品，人肠道，粪便等。在菌株的生长过程中，乳链菌肽是一种次级代谢产物，但其活性表现为在生长初期难以检测、对数生长期快速积累、平台期趋于稳定，整体呈现出初级代谢产物的生产特征
Nisin的生物合成涉及11个基因，含有三个多顺反子，按顺序排列在约14kb的DNA片段上。在Nisin合成过程中，各基因转录顺序为nisABTCIP，nisRK，nisFEG。在这些基因中，nisA(Z)基因编码由57个氨基酸残基组成的nisinA(Z)前体肽，其中包括23个氨基酸的前导序列，N端前体肽参与指导Nisin前体的修饰和靶向过程。nisB和nisC编码参与细胞内翻译后修饰反应的膜相关蛋白。nisT编码一个ABC转位家族的转运蛋白，该转运蛋白参与了完全修饰的Nisin前体跨细胞质膜的转位。nisP编码一种参与细胞外蛋白水解活化的枯草杆菌素样蛋白酶。在乳链球菌素前体易位期间或之后不久，先导肽被枯草杆菌素样蛋白酶去除，形成细胞外成熟乳链球菌素肽。nisI和nisFEG是参与产生细胞对Nisin免疫的两个系统。nisI编码一种脂蛋白，参与生产菌对Nisin的自我保护，nisFEG编码一种ABC转运蛋白，完全修饰的乳链球菌素前体在细胞质膜上的转运。nisR和nisK是双组分调节基因，其中nisK为Nisin受体，nisR表达的蛋白可以与启动子上特定序列结合，以激活启动子后结构基因的表达。
NICE系统，即nisin控制表达(nisin controlled expression)系统，可用于开发食品级克隆微生物，生产理想的代谢物、酶和其他蛋白质。细胞外的成熟乳链菌肽作为一种自诱导剂通过NisRK双组分调控系统激活nisA和nisF启动子的诱导。因此，含有nisA或nisF启动子的质粒，再加上可引入感兴趣的基因的克隆位点，以及适合表达nisRK的生产宿主，在生长培养基中加入自诱导剂乳链菌肽来控制编码所需蛋白或酶基因的表达。此外，由一个表达nisRK的质粒和另一个含有乳链菌肽诱导的nisA启动子的质粒组成的可转移双质粒系统的开发，也为NICE系统在乳酸乳球菌以外其他的乳酸菌中的研究提供了条件。有效的NICE系统主要由三个成份构成：(1)携有nisRK基因的革兰氏阳性宿主菌；(2)作为诱导分子的乳链菌肽或其类似物及突变体；(3)含有nisA或nisF启动子片段的质粒，其中含有可导入目的基因的多克隆位点。
目前，乳链菌肽的高产研究主要集中于菌种选育、发酵工艺优化和分离提取工艺等方面。其中菌种选育的目的主要是获得更高产的乳链菌肽生产菌株，目前的主要方法有诱变育种、基因工程技术育种、原生质体融合技术育种等。乳链菌肽具有无残留、无抗药性、无毒副作用以及对环境友好等优点，是一种优秀的生物型食品防腐剂，但目前乳链菌肽的生产菌株生物合成效率低且简便快速检测技术贫乏，制约了乳链菌肽的研究和应用。传统筛菌方法多采用琼脂扩散法，即利用乳链菌肽的抗菌性，以敏感标准菌株(例如藤黄微球菌)为测试参考，通过平板上的抑菌圈大小来判断判断抑菌效果的强弱，并用标准样品做出拟合曲线来计算样品中的乳链菌肽含量。此方法不需要特殊的仪器，但费时费力，特异性低，易与其他抗菌肽混淆，且易受到平板厚度、琼脂浓度等多方面因素影响，测量的平行性较差。
有研究者开发了一种基于发光生物传感器细菌的检测食品样品中超低含量乳酸菌素的方法(IMMONEN N,KARP M.Bioluminescence-based bioassays for rapiddetection of nisin in food[J].Biosensors&bioelectronics,2007,22(9-10):1982-7)。研究者将修饰后的细菌荧光素酶操纵子luxABCDE置于质粒pNZ8048中，受乳链菌肽诱导的nisA启动子的控制下，并将构建的质粒转化入乳酸乳球菌菌株NZ9800和NZ9000中。这些菌株中含有nisRK基因，能够感知乳链菌肽并以此为信号启动PnisA的转录。所产生的荧光可以直接由活细菌检测，而无需添加外源底物。此种方法测定的Nisin的灵敏度在纯溶液中为0.1pg/ml，在牛奶中为3pg/ml。
此外，有研究人员以NICE系统为基础，将表达Nuc蛋白的片段置于Nisin诱导启动的PnisA下游，插入质粒pSec中，通过电击法转入感受态NZ9000细胞中。通过检测Nuc蛋白的表达量计算周围环境中Nisin含量。此方法能够检测0～10ng/ml的Nisin(HU S,KONG J,KONG W,et al.Identification of nisin-producing strains by nisin-controlledgene expression system[J].Current microbiology,2009,58(6):604-8)。
L.lactis NZ9000，来源于将乳链菌肽生物合成过程中的信号转导基因nisR和nisK插入到L.lactis MG1363染色体中，是常见的NICE表达载体的受体菌。该菌株不能产生乳链菌肽，也对乳链菌肽没有抗性。同时，菌株L.lactis ATCC11454是乳链菌肽的生产菌株，含有一整套完整的乳链菌肽生物合成基因。
质粒pNZ8148，是常用于NICE系统的翻译融合型载体。pNZ8148是一种穿梭载体，其复制子来源于乳酸乳球菌质粒pSH71，带有该复制子的质粒既可以在许多革兰氏阳性菌中复制，也可以在recA+的大肠杆菌中复制，具有广泛的宿主范围。pNZ8148上携带氯霉素抗性基因和nisA启动子，可以受到乳链菌肽的诱导。目的基因插入nisA启动子后的Nco I酶切位点，可以使起始密码子和核糖体结合位点的距离合适，保证高效转录状态。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法。
本研究构建了一种新型的生物分子传感器NZ9000-RFP，可以响应外界的乳链菌肽，并输出红色荧光，荧光值与乳链菌肽浓度在一定范围内可用公式拟合。该生物传感器被证明可以用于检测生产菌株发酵液上清中的乳链菌肽含量，对乳链菌肽生产菌株ATCC11454进行了常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变和自然突变，并利用生物传感器NZ9000-RFP筛选突变菌株，最终获得效价提升了41.2％和17.0％的突变株A4-2和H4-3。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种利用构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法，包括以下步骤：
A、将传感器质粒转化到表达宿主L.lactis NZ9000中，产生了乳链菌肽细胞分子传感器；
B、将所得乳链菌肽细胞分子传感器过夜培养，得到培养后的传感器菌液，并控制OD600值；
C、将步骤B中得到的传感器菌液稀释后，加入至酶标仪板中；
D、将不同浓度的nisin标准溶液加入到步骤C所得酶标仪板中；检测混合溶液荧光前度及OD600值；利用测得数据计算得到响应拟合曲线；
E、将测菌上清稀释液加入到步骤C所得酶标仪板中；检测荧光及OD600值，检测条件与步骤D相同；将所测数据代入至步骤C中的响应拟合曲线，计算得到实际nisin浓度。
作为本发明的一个实施方案，步骤A所述分子传感器质粒包括pNZ8148-RFP和pNZ8148-(nism)RFP-APDR的至少一种。
作为本发明的一个实施方案，所述乳链菌肽细胞分子传感器包括L.lactisNZ9000-RFP和L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR的至少一种。
作为本发明的一个实施方案，所述乳链菌肽细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP构建方法包括：构建质粒pNZ8148-RFP，将其转化进入L.lactis NZ9000菌中，构建初代细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP；质粒pNZ8148-RFP具体方构建方法如下：通过Golden-Gate方法，用Bsa I酶将rfp基因连入pNZ8148质粒中，构建得到质粒pNZ8148-RFP。
作为本发明的一个实施方案，所述乳链菌肽细胞分子传感器L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR构建方法包括：构建质粒pNZ8148-(nism)RFP-APDR，将其转化进入L.lactis NZ9000菌中，构建细胞分子传感器L.lactis NZ9000-(nism)RFP-APDR；质粒pNZ8148-(nism)RFP-APDR构建方法如下：通过Golden-Gate方法，用Bsa I酶将Pnis基因替换为Pnism连入pNZ8148-RFP质粒中，得到质粒pNZ8148-(nism)RFP；之后用Bsa I酶在Pnism的-35区6个核苷酸前插入五核苷酸(TCTGA)序列，得到质粒pNZ8148-(nism)RFP-APDR。
作为本发明的一个实施方案，步骤A中所述转化为电转化。
作为本发明的一个实施方案，步骤B中所述OD600值为0.4～0.6。
作为本发明的一个实施方案，步骤B中所述控制OD600值是将菌液从3mL培养体系中按照2％的体积比转接至5mL培养体系中。
作为本发明的一个实施方案，步骤C中稀释是将菌液稀释10倍，菌液加入量为每孔150μl。
作为本发明的一个实施方案，步骤D中测得数据计算得到响应拟合曲线的方法包括：检测不同浓度的nisin标准溶液24h内的荧光值，筛选出标准溶液的荧光值在相同时间时随标准溶液中nisin浓度的增加逐步增加的浓度值范围，此范围为响应拟合曲线所需的nisin标准溶液浓度范围；同一溶度nisin标准溶液的荧光值随时间增加后保持平稳，选择所得浓度范围内荧光值均处于平稳状态的时间点，通过该时间点的nisin标准溶液的浓度与荧光值的对应关系得到响应拟合曲线。
作为本发明的一个实施方案，根据拟合曲线得到的方程为y＝735×x2.16/(162+x2.16)。该方程拟合程度很高(R2>0.99)，说明这个方程能应用于样品中乳链菌肽的定量测试。
作为本发明的一个实施方案，当乳链菌肽细胞分子传感器包括L.lactis NZ9000-RFP时，步骤D中筛选得到的nisin标准溶液浓度为2-200ng/mL。
作为本发明的一个实施方案，当乳链菌肽细胞分子传感器包括L.lactisNZ9000--(nism)RFP-APDR时，步骤D中筛选得到的nisin标准溶液浓度为0-20ng/mL。
作为本发明的一个实施方案，步骤D中检测条件为在25-35℃、150-250rpm条件下培养并用酶标仪检测荧光及OD600值。
利用传感器检测环境中Nisin含量并通过酶标仪可视化，具有直观、成本低、高通量等优点。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明通过基因工程手段，构建了一种新型的生物分子传感器，具有更加简单易于观察的优点，红色荧光可以直接观察并做定性检测，不需要额外设备。
(2)本发明利用构建的传感器以及拟合的公式，能够在0-20ng/mL范围内，通过简单的红色荧光测量对乳链菌肽样本进行定量分析。这些特性能使乳链菌肽检测流程更加方便、迅速和准确。
(3)通过本发明方法筛选获得的乳链菌肽产生菌A4-2和H4-3的效价分别提高了41.2％和17.0％，具有极大的应用潜力。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP构建示意图；
图2为细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP对不同浓度乳链菌肽的响应；
图3为细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP对不同浓度乳链菌肽的响应拟合曲线；
图4为细胞分子传感器L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR构建示意图；
图5为细胞分子传感器L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR与L.lactis NZ9000-RFP响应乳链菌肽效果比较图
图6为生物传感器检测不同发酵时间ATCC11454、A4-2和H4-3上清荧光值变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例的方法包括：
步骤一，获得细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP；
步骤二，基因工程改造获得在Nisin 0～20ng/mL的浓度范围内检测准确性有所提升的L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR；
步骤三，使用诱变育种的方式提高菌株ATCC11454的乳链菌肽产量，并使用构建的生物分子传感器L.lactis NZ9000-RFP对突变菌株进行检测；
实施例1
(1)构建初代细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP(构建示意图如图1所示)
构建质粒pNZ8148-RFP，将其转化进入L.lactis NZ9000菌中，构建初代细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP。质粒pNZ8148-RFP具体方构建法如下：
通过Golden-Gate方法。用Bsa I酶将rfp基因连入pNZ8148质粒中，构建质粒pNZ8148-RFP，将质粒pNZ8148-RFP通过电击的方法转化进入宿主L.lactis NZ9000中。
(2)测试细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP获得拟合曲线(测试示意图如图2、图3所示)
对于传感器L.lactis NZ9000-RFP，过夜培养，得到培养后的传感器菌液，并控制OD600值0.4～0.6，将得到的菌液稀释10倍后，加入至酶标仪板中，加入了终浓度为0、0.1、1、2、5、10、20、50、100、200、500和1 000ng/mL浓度的乳链菌肽到传感器细胞中，检测其24h内的荧光信号变化。L.lactis NZ9000-RFP的结果当添加的乳链菌肽的浓度范围在0-2ng/mL内时，传感器细胞的荧光信号非常弱，小于30荧光值；而当添加的乳链菌肽浓度达到5ng/mL的时候，可以观察到明显的荧光信号，约100荧光值；随着乳链菌肽浓度的增加，荧光信号逐步增加。当添加的乳链菌肽的浓度范围在50-200ng/mL内时，荧光信号达到最强，约800荧光值；但是当乳链菌肽的浓度达到500ng/mL时，荧光信号没有进一步地上升，甚至L.lactisNZ9000-RFP传感器细胞的生长都会受到影响；当加入浓度为1000ng/mL的乳链菌肽时，可完全抑制传感器细胞生长，此时没有荧光信号。
L.lactis NZ9000-RFP传感器细胞能对在2-200ng/mL浓度范围内的乳链菌肽有响应。由此，可从图2中提取出荧光稳定的第10h的荧光信号，在对应的浓度下用Hillequation作曲线拟合。拟合曲线如图3所示，拟合得到的方程为y＝735×x2.16/(162+x2.16)，拟合程度很高(R2>0.99)，说明这个方程能应用于样品中乳链菌肽的定量测试。
实施例2
(1)基因工程改造优化细胞分子传感器L.lactis NZ9000-RFP得到L.lactisNZ9000--(nism)RFP-APDR(构建示意图如图4所示)
构建质粒pNZ8148-(nism)RFP-APDR，将其转化进入L.lactis NZ9000菌中，构建细胞分子传感器L.lactis NZ9000-(nism)RFP-APDR。具体构建方法如下：
通过Golden-Gate方法。用Bsa I酶将Pnis基因替换为Pnism连入pNZ8148-RFP质粒中，Pnis基因序列如SEQ ID NO.1所示，Pnism基因序列如SEQ ID NO.2所示，构建质粒pNZ8148-(nism)RFP，之后用Bsa I酶在Pnism的-35区6个核苷酸前插入五核苷酸(TCTGA)序列，构建质粒pNZ8148-(nism)RFP-APDR，将质粒pNZ8148-(nism)RFP-APDR通过电击的方法转化进入宿主L.lactis NZ9000中。
(2)测试比较细胞分子传感器L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR与L.lactisNZ9000-RFP响应乳链菌肽效果(测试示意图如图5所示)
对于传感器L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR与L.lactis NZ9000-RFP，分别加入了终浓度为0、2、5、10、20和50ng/mL浓度的乳链菌肽到传感器细胞中，检测其24h内的荧光信号变化。在0-50ng/mL浓度范围内时，两株改造后的菌株荧光响应值相比出发菌株有较为明显的提升。在Nisin浓度为0-20ng/mL的范围内，L.lactis NZ9000--(nism)RFP-APDR传感器菌株随Nisin浓度变化的响应曲线趋势发生明显变化，较L.lactis NZ9000-RFP整体荧光表达水平有所提升，同时在Nisin 0-20ng/mL的浓度范围内的响应曲线发生较显著变化，使得检测的准确性有所提升。
实施例3
利用细胞分子传感器筛选诱变的乳链菌肽高产菌(筛选得到的高产菌产量示意图如图6所示)
ARTP诱变流程：
(1)处理前样品准备。接种待测突变菌于5mL GM17培养基中，30℃200rpm过夜培养。将过夜培养的菌液以1％接种到100mL GM17摇瓶中，30℃200rpm培养。将培养至对数期的菌液离心收集，用无菌纯水洗涤2～3次后，用无菌纯水适量稀释制成OD600值在0.8-1.0左右的菌悬液；
(2)在超净台内，将载片置于酒精灯外焰灼烧30s，待冷却后放到已灭菌培养皿中，取10μL菌液均匀涂布在载片表面，在超净台中等待完全吹干。
(3)对操作室进行预消毒。关上操作室门，紫外消毒灭菌15～20min。关闭紫外灯后需等待30～40min再处理样品，防止紫外线照射产生的臭氧对细菌的影响。
(3)将装有样品载片的培养皿移至ARTP诱变育种仪操作室，用无菌镊子将载片依次放到对应凹槽。
(4)设置仪器功率、处理时间、气量，仪器功率设置为120W，处理时间设置为5s，气量设置为10SLM，设置完毕后开始处理样品。
(5)全部样品处理完毕，用无菌镊子将载片分别放至装有1mL无菌GM17培养基的EP管中。关闭ARTP诱变育种仪。
(6)将EP管置于振荡器上振荡1min，把附着在载片上的微生物洗脱到无菌GM17培养基中，形成新的菌悬液。
(7)对新菌悬液进行适当稀释，涂布于含有适当浓度乳链菌肽的GM17平板，30℃培养24h，计数并挑取单菌落接种保藏。取样过程中注意振荡菌液以保持均匀。
自然突变流程：
接种待测突变菌于5mL GM17培养基中，30℃200rpm培养。将培养至对数期的菌液稀释100倍，取100μL涂布于含有适当浓度乳链菌肽的GM17平板上，30℃培养24h，计数并挑取单菌落接种保藏。
以L.lactis ATCC11454为原始菌株，通过ARTP诱变获得了多个突变株，通过自然突变获得了多个突变株。通过传感器L.lactis NZ9000-RFP测试筛选得到两株乳链菌肽高产菌A4-2和H4-3。具体测试方法如下：
接种待测菌于5mL GM17培养基中，30℃200rpm过夜培养。将过夜培养的菌液以1％接种到100mL GM17摇瓶中，30℃200rpm培养。每小时取500μL待测菌菌液与0.2MHCl溶液按体积比1:1混合，充分混匀，12000rpm离心2min，取上清，放入-80℃冰箱保存。接种L.lactisNZ9000-RFP于GM17培养基，30℃200rpm培养过夜。将过夜培养的菌液以2％体积比转接于新鲜的GM17培养基，相同条件培养至OD600＝0.4。将菌液用GM17培养基稀释10倍后，加入150μL到96孔板中。处理后的待测菌菌液同样用GM17培养基稀释10倍，每孔加入1.6μL到NZ9000-RFP菌液中。在30℃200rpm条件下培养并用酶标仪检测荧光及OD600值，记录24h。使用了实施例1所得拟合公式和传统的琼脂扩散法检测获得突变株A4-2和H4-3培养14h时的发酵液上清的效价，效价和浓度是等价的，可以用公式换算，属于领域内常识(40IU/ml＝1μg/ml)，分别为1065IU/mL和882IU/mL。与出发菌株L.lactis ATCC11454发酵液上清效价754IU/mL相比，突变株A4-2和H4-3的效价分别提高了41.2％和17.0％。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 构建乳链菌肽细胞分子传感器筛选乳链菌肽高产菌的方法
<130> KAG47746
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagtcttat aactatactg acaatagaaa cattaacaaa tctaaaacag tcttaattct 60
atcttgagaa agtattggta ataatattat tgtcgataac gcgagcataa taaacggctc 120
tgattaaatt ctgaagtttg ttagatacaa tgatttcgtt cgaaggaact acaaaataaa 180
ttataaggag gcactcacc 199
<210> 2
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagtcttat aactatactg acaatagaaa cattaacaaa tctaaaacag tcttaattct 60
atcttgagaa agtattggta ataatattat tgtcgataac gcgagcataa taaacggctc 120
tgattaaatt ctgaagtttg ttagatacaa tgatttcgtt cgaaggaact acaaaataaa 180
ttattctaga tgattaactt tataaggagg aaaaacat 218
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