具体实施方式

[细胞容纳容器]

本发明提供了根据一个实施方式的细胞容纳容器，其包括：神经细胞；和培养基，其中神经细胞粘着于细胞容纳容器的培养表面，神经细胞与培养表面之间的粘着面积为0.5mm²以上/80,000个神经细胞，并且培养基中葡萄糖的浓度为1g/L以上。

如以下实施例中所述，发明人已发现神经细胞的聚集与培养基中的葡萄糖浓度之间存在关系。另外，明确了在根据常规方案培养神经细胞的情况下，培养基中的葡萄糖浓度可以小于1g/L。而且，明确了可以通过将培养基中的葡萄糖浓度保持在1g/L以上来抑制神经细胞的聚集。

当抑制神经细胞的聚集时，可以使用MEA等令人满意地检测和评估神经细胞的动作电位。而且，当抑制神经细胞的聚集时，可以通过其它分析手段(如免疫染色)令人满意地评估神经细胞的状态。

本实施方式的细胞容纳容器是培养容器中神经细胞的培养物。培养容器可以是通常用于细胞培养的容器，并且培养皿(dish)和孔板是其示例性实例。培养皿的直径、孔板中孔的数量等可以根据应用适当地选择。

在本实施方式的细胞容纳容器中，可以将电极阵列放置在容器的培养表面上。即，本实施方式的细胞容纳容器可以是MEA板。MEA等中的电极的数量可以根据应用适当地选择。

以下描述的有机材料和无机材料是培养容器的培养表面的材料的示例性实例。可以单独使用这些中的一种，并且可以组合使用其两种或更多种。

有机材料没有具体限制，并且可以根据目的适当地选择。聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、三乙酰基纤维素(TAC)、聚酰亚胺(PI)、尼农(Ny)、低密度聚乙烯(LDPE)、中密度聚乙烯(MDPE)、氯乙烯、亚乙烯基二氯、聚苯硫醚、聚醚砜、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、丙烯酸材料(如聚氨酯丙烯酸酯)、纤维素、硅酮系材料，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙烯醇(PVA)、金属藻酸盐，如藻酸钙、聚丙烯酰胺、甲基纤维素和凝胶样材料(如琼脂糖)是示例性实例。

无机材料没有特别限制，并且可以根据目的适当地选择，并且玻璃和陶瓷是其示例性实例。

培养容器的培养表面可以用涂覆剂涂覆。可以适当地使用通常用于细胞培养的涂覆剂，并且胶原蛋白、Matrigel(注册商标，Corning)、Geltrex(Thermo FisherScientific)、PLO(Sigma-Aldrich)、PDLO(Sigma-Aldrich)、纤连蛋白、纤维蛋白原、明胶、聚乙烯亚胺(PEI)、层粘连蛋白等是其示例性实例。

本实施方式的细胞容纳容器中容纳的神经细胞可以是从活体收集的细胞或已经建立并培养的细胞。另外，从容易获得含有大量神经细胞的期望的细胞群体的观点出发，可以由干细胞分化细胞。即，神经细胞可以源自干细胞。

胚胎干细胞(ES细胞)、诱导的多能干细胞、间充质干细胞、脐带血衍生的干细胞、神经干细胞等是干细胞的示例性实例。核移植的胚胎干细胞(ntES细胞)、诱导的多能干细胞(iPS细胞)等是诱导的多能干细胞的示例性实例。骨髓间充质干细胞、脂肪组织衍生的间充质干细胞等是间充质干细胞的示例性实例。其中，干细胞优选为iPS细胞。

iPS细胞可以衍生自健康人或患有各种神经系统疾病的患者。另外，可以使用已进行各种基因编辑的细胞。例如，可以使用通过基因编辑已被工程化从而具有作为各种神经系统疾病的病因或危险因素的基因的细胞。

在iPS细胞衍生自患有各种神经系统疾病的患者的情况下，iPS细胞可以用于构建神经系统的疾病模型。神经系统疾病没有具体限制，并且神经退行性疾病、自闭症、癫痫、注意力不集中的过度反应症(ADHD)、精神分裂症、双相性精神障碍等是其示例性实例。阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症等是神经退行性疾病的示例性实例。

衍生神经细胞的动物物种没有特别限制，并且人、猴、狗、牛、马、绵羊、猪、兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠是其示例性实例。其中，人是优选的。

而且，可以单独使用一种神经细胞，或者可以使用两种或更多种神经细胞的混合物。可以将神经细胞粗略地分类为例如外周神经和中枢神经。感觉神经细胞、运动神经细胞和自主神经细胞是外周神经的示例性实例。介入神经细胞和投射神经元是中枢神经的示例性实例。皮质神经元、海马神经元、杏仁核神经元等是投射神经元的示例性实例。另外，中枢神经细胞可以粗略地分为兴奋性神经元和抑制性神经元。主要负责中枢神经系统中的兴奋性传递的谷氨酸操纵的神经元、主要负责抑制性传递的GABA(γ-氨基丁酸)操纵的神经元等是其示例性实例。

胆碱能神经元、多巴胺能神经元、去甲肾上腺素能神经元、5-羟色胺能神经元、组胺能神经元等是释放神经调节剂的其它神经元的示例性实例。

本实施方式的细胞容纳容器可以连同神经细胞一起容纳星形胶质细胞、小胶质细胞等。神经细胞与培养容器的培养表面之间的粘着面积为0.5mm²以上，优选0.949mm²以上，更优选3mm²以上，仍更优选3.14mm²以上/80,000个神经细胞。而且，神经细胞与培养容器的培养表面之间的粘着面积的上限优选为约28.2mm²。

另外，根据目的，优选神经细胞是成熟的。例如，优选的是微管蛋白β3、MAP2、NeuN、160kDa神经丝、200kDa神经丝、NSE、PSD93和PSD95中的一种标记基因的表达为阳性。

作为本实施方式的细胞容纳容器中容纳的培养基，可以适当地选择和使用适于所使用的细胞的培养基，只要培养基中葡萄糖的浓度为1g/L以上。

必需组分添加至基础培养基的培养基是培养基的具体示例性实例。DME培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)、Ham F12培养基(Ham营养混合物F12)、D-MEM/F12培养基、McCoy氏5A培养基、伊格尔氏MDM培养基(伊格尔氏基本必需培养基，EMEM)、αMEM培养基(α改良的伊格尔氏基本必需培养基，αMEM)、MEM培养基(基本必需培养基)、RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)培养基、Iscove改良Dulbecco氏培养基(IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E、IPL41培养基、Fischer氏培养基、M199培养基、高性能培养基199、StemPro34(由Thermo Fisher Scientific制造)、X-VIVO 10(由Chembrex制造)、X-VIVO 15(由Chembrex制造)、HPGM(由Chembrex制造)、StemSpan H3000(由Stem Cell Technologies制造)、StemSpan SFEM(由Stem Cell Technologies制造)、Stemline II(由Sigma-Aldrich制造)、QBSF-60(由Quality Biological制造)、StemProhESC SFM(由Thermo Fisher Scientific制造)、Essential8(注册商标)培养基(由ThermoFisher Scientific制造)、mTeSR1或mTeSR2培养基(由Stem Cell Technologies制造)、Repro FF或Repro FF2(由Reprocell制造)、PSGro hESC/iPSC培养基(由SystemBiosciences制造)、NutriStem(注册商标)培养基(由Biological Industries制造)、CSTI-7培养基(由Cell Science Laboratory制造)、MesenPRO RS培养基(由Thermo FisherScientific制造)、MF-Media(注册商标)间充质干细胞生长培养基(由Toyobo Co.,Ltd.制造)、Sf-900II(由Thermo Fisher Scientific制造)、Opti-Pro(由Thermo FisherScientific制造)是基础培养基的示例性实例。可以单独使用这些中的一种，也可以混合使用其两种或更多种。

另外，要添加至基础培养基中的添加剂的实例包括通常用于培养神经细胞的那些。组分N(Elixirgen Scientific)、组分G2(Elixirgen Scientific)、N2补充剂(ThermoFisher Scientific)、iCell神经元补充剂B(CDI)、iCell神经系统补充剂、B-27plus(Thermo Fisher Scientific)等是其示例性实例。

[用于生产细胞容纳容器的方法]

本发明提供了用于生产根据一个实施方式的细胞容纳容器的方法，该方法包括以下步骤：在培养条件下培育包括神经细胞和培养基的容器，同时在预定时间更换培养基，其中培养基中葡萄糖的浓度在1g/L以上保持预定的时间段。

上述细胞容纳容器可以通过本实施方式的生产方法来生产。另外，如以下将在实施例中所述，可以通过本实施方式的生产方法来生产抑制神经细胞聚集的细胞容纳容器。

在本实施方式的生产方法中，容器(培养容器)、神经细胞和培养基与上述相同。具体地，例如，可以将电极阵列放置在细胞容纳容器的培养表面上。另外，神经细胞可以源自干细胞。此外，干细胞可以是人细胞。

每周更换按培养基的总量的体积计10％至100％1至10次是在预定时间更换培养基的示例性实例。培养基更换的时间可以是例如每周1至8次、每周1至5次或每周1至3次。优选的是，从培养基更换至下一次培养基更换的时间段是基本上恒定的。

进一步，在一个培养基更换中更换的培养基的量可以为按培养基的总量的体积计10％至80％、按培养基的总量的体积计10％至50％以及按培养基的总量的体积计10％至30％。

另外，培养条件可以是通常用于培养神经细胞的条件，37℃和5％CO₂的条件是其示例性实例。另外，氧浓度可以设置为0％至1％。

可以根据目的适当地设置培育时间段。例如，在已被诱导以由人iPS细胞分化的神经细胞中检测到动作电位的情况下，培育时间段可以为从解离为单个细胞的神经细胞接种在培养容器的时间点起例如30天以上，例如40天以上，例如50天以上，例如60天以上，以及例如70天以上。

在本实施方式的生产方法中，培养基中葡萄糖的浓度在1g/L以上保持预定的时间段。在此，预定时间段可以是在培养条件下培养神经细胞的整个期间，或者可以是从培养开始例如至少20天，例如22天，例如24天。另外，培养基中葡萄糖的浓度优选在0.2g/L以上保持从培养开始起至少30天，例如从培养开始起35天，以及例如从培养开始起40天。在此，培养开始指代将解离为单个细胞的神经细胞接种在培养容器中的时间点。

在本实施方式的生产方法中，神经细胞粘着于细胞容纳容器的培养表面，并且神经细胞与培养表面之间的粘着面积优选为0.5mm²以上，优选为0.949mm²以上，更优选为3mm²以上，仍更优选为3.14mm²以上/80,000个神经细胞。而且，神经细胞与培养容器的培养表面之间的粘着面积的上限优选为约28.2mm²。

[实施例]

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明，但是本发明不限于以下实施例。

[实验实施例1]

(培养基中葡萄糖浓度随时间的变化的检查)

培养人神经细胞。另外，在该过程中，测量培养基中葡萄糖浓度随时间的变化。每周更换细胞培养基3次。另外，改变要更换的培养基的量，以进行比较。

作为人神经细胞，使用人iPSC衍生的GABA能神经元(Elixirgen Scientific)。

作为细胞培养容器，使用具有微电极阵列(MEA)的MEA板(型号“M768-tMEA-48W”，Axion Biosystems)。MEA板的培养表面涂覆有聚乙烯亚胺(PEI，Thermo FisherScientific)和层粘连蛋白(Thermo Fisher Scientific)。培养容器的每个孔的体积为300μL。

从接种神经细胞的那天(体外第0天，下文有时称为“DIV0”)至第5天(下文有时称为“DIV5”，并且下文同样适用)，Quick-Neuron(TM)GABA能维持培养基(Quick-Neuron(TM)GABAergic Maintenance Medium)(产品名称)(Elixirgen Scientific)用作培养基。培养基中的葡萄糖浓度为5g/L。在DIV6及以后，“完全Brainpys培养基(Complete BrainpysMedium)(产品名称)(CDI)用作培养基。培养基中的葡萄糖浓度为0.5g/L。

如下更换培养基。首先，一次从培养容器中抽吸250μL、150μL或50μL培养基。随后，添加与抽吸培养基具有相同容量的新培养基。每周更换培养基3次。抽吸的培养基用于测量葡萄糖浓度。使用FLEX2(Nova Biomedical Co.,Ltd.)——其是培养基组分分析器——以测量葡萄糖浓度。

图1是显示培养基中葡萄糖浓度随时间变化的测量结果的图。横轴显示从接种神经细胞起的培养天数，纵轴显示培养基中的葡萄糖浓度(g/L)。

结果，明确了在每次更换50μL培养基(每周3次)的情况下，培养基中的葡萄糖浓度保持在最高水平。在每次更换50μL培养基时，接种神经细胞后第22天培养基中的葡萄糖浓度为约1.4g/L。另外，接种神经细胞后第40天培养基中的葡萄糖浓度为约0.2g/L。

另一方面，在每次更换150μL培养基(每周3次)的情况下，接种神经细胞后第22天培养基中的葡萄糖浓度为约0.4g/L。另外，接种神经细胞后第40天培养基中的葡萄糖浓度为约0g/L。

另外，在每次更换250μL培养基(每周3次)的情况下，接种神经细胞后第22天培养基中的葡萄糖浓度为约0.3g/L。另外，接种神经细胞后第40天培养基中的葡萄糖浓度为约0g/L。

[实验实施例2]

(神经细胞的聚集水平的检查)

用显微镜观察实验实施例1中培养的每个神经细胞，并评估其聚集水平。聚集水平的评估标准如下。随着聚集水平增加，神经细胞与培养表面之间的粘着面积变小，并且神经细胞趋向于与培养表面分离。

<<聚集水平的评估标准>>

1：神经细胞与培养表面之间的粘着面积为3.14mm²以上且28.2mm²以下/80,000个神经细胞。

2：神经细胞与培养表面之间的粘着面积为0.949mm²以上且3.14mm²以下/80,000个神经细胞。

3：神经细胞与培养表面之间的粘着面积为0.196mm²以上且0.949mm²以下/80,000个神经细胞。

4：神经细胞与培养表面之间的粘着面积为0mm²以上且0.196mm²以下/80,000个神经细胞。

图2A至2C显示了从接种神经细胞起第53天(DIV53)每个神经细胞的代表性显微照片。图2A显示了通过每次更换250μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的显微照片。图2B显示了通过每次更换150μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的显微照片。图2C显示了通过每次更换50μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的显微照片。

结果，通过每次更换250μL培养基(每周3次)获得的DIV53的神经细胞的聚集水平为4。另外，通过每次更换150μL培养基(每周3次)获得的DIV53的神经细胞的聚集水平为3。另外，通过每次更换50μL培养基(每周3次)获得的DIV53的神经细胞的聚集水平为1。

从结果看出，在保持培养基中葡萄糖浓度高的条件下培养的神经细胞趋向于具有低聚集水平。更具体地，明确了在接种神经细胞后第22天，培养基中葡萄糖浓度为1g/L以上的神经细胞趋向于具有低聚集水平。此外，明确了在接种神经细胞后第40天，培养基中葡萄糖浓度为0.2g/L以上的神经细胞趋向于具有低聚集水平。

[实验实施例3]

(神经细胞的聚集水平和动作电位的检查)

以与实验实施例1相同的方式，用显微镜观察从接种神经细胞起培养42天的神经细胞，并评估其聚集水平。聚集水平的评估标准与实验实施例2相同。另外，使用微电极阵列测量并评估每个神经细胞的动作电位。动作电位的评估标准如下，并确定可以检测的动作电位的可检测性。

<<动作电位的评估标准>>

A：可以很好地检测到动作电位。

B：可以检测到动作电位。

C：无法检测到动作电位。

图3A显示了评估为聚集水平1的神经细胞的代表性显微照片。图3B显示了评估为聚集水平2的神经细胞的代表性显微照片。图3C显示了评估为聚集水平3的神经细胞的代表性显微照片。图3D显示了评估为聚集水平4的神经细胞的代表性显微照片。另外，下表1显示了聚集水平和动作电位的评估结果。

[表1]

结果，明确了当使用评估为聚集水平1的神经细胞时，可以很好地检测到动作电位。

[实验实施例4]

(神经细胞的聚集水平随时间的变化的检查)

观察到以与实验实施例1相同的方式培养的每个神经细胞的聚集水平随时间的变化。聚集水平的评估标准与实验实施例2相同。

图4是显示通过每次更换250μL、150μL或50μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的聚集水平随时间的变化的图。结果，明确了即使在接种神经细胞后第56天，通过每次更换50μL培养基(每周3次)获得的神经细胞保持聚集水平1。

另一方面，认识到在接种神经细胞后第38天之后，通过每次更换150μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的聚集水平增加。另外，认识到在接种神经细胞后第31天之后，通过每次更换250μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的聚集水平增加。

结果表明，培养基中的葡萄糖浓度越低，神经细胞的聚集水平趋向于越高。在相关技术中，通常采用通过每次更换150μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的培养条件。另一方面，明确了在通过每次更换50μL培养基(每周3次)获得的神经细胞的培养条件的情况下，可以将神经细胞的聚集水平保持在低水平。

[实验实施例5]

(培养基中的葡萄糖浓度与神经细胞的聚集水平之间的关系的检查)

以与实验实施例1相同的方式，通过改变更换的培养基的量来培养神经细胞。此外，检查从接种神经细胞起第22天(DIV22)培养基中神经细胞的葡萄糖浓度与从接种神经细胞起第31天(DIV31)、第38天(DIV38)、第45天(DIV45)和第56天(DIV56)神经细胞的聚集水平之间的关系。

图5是显示检查结果的图。在图5中，横轴显示在DIV22天培养基中神经细胞的葡萄糖浓度(g/L)，纵轴显示通过与实验实施例2相同的评估标准评估的神经细胞的聚集水平。

结果，明确了当从接种神经细胞起第22天(DIV22)培养基中神经细胞的葡萄糖浓度为1g/L以上时，甚至在第31天(DIV31)、第38天(DIV38)、第45天(DIV45)和第56天(DIV56)神经细胞的聚集水平趋向于保持低水平。

另一方面，明确了当从接种神经细胞起第22天(DIV22)培养基中神经细胞的葡萄糖浓度小于1g/L时，在第31天(DIV31)、第38天(DIV38)、第45天(DIV45)和第56天(DIV56)神经细胞的聚集水平才趋向于增加。

本发明包括以下方面。

[1]细胞容纳容器，包括：

神经细胞；和

培养基，

其中神经细胞粘着于细胞容纳容器的培养表面，

神经细胞与培养表面之间的粘着面积为0.5mm²以上/80,000个神经细胞，和

培养基中葡萄糖的浓度为1g/L以上。

[2]根据[1]的细胞容纳容器，其中电极阵列放置在培养表面上。

[3]根据[1]或[2]的细胞容纳容器，其中神经细胞源自干细胞。

[4]根据[3]的细胞容纳容器，其中干细胞是人细胞。

[5]用于生产细胞容纳容器的方法，所述方法包括：

在培养条件下培育包括神经细胞和培养基的容器，同时在预定时间更换培养基，

其中培养基中葡萄糖的浓度在1g/L以上保持预定的时间段。

[6]根据[5]的生产方法，其中培育进行30天以上。

[7]根据[5]或[6]的生产方法，其中神经细胞粘着于细胞容纳容器的培养表面，和

神经细胞与培养表面之间的粘着面积为3mm²以上/80,000个神经细胞。

[8]根据[7]的生产方法，其中电极阵列放置在培养表面上。

[9]根据[5]至[8]中任一项的生产方法，其中神经细胞源自干细胞。

[10]根据[9]的生产方法，其中干细胞是人细胞。

尽管上文已描述和示例了本发明的优选实施方式，但是应理解，这些是本发明的示例，而不应被视为是限制性的。在不背离本发明的范围的情况下，可以进行增加、省略、替换和其它修改。因此，本发明不应被视为由前述描述限制，而仅由所附权利要求的范围限制。