具体实施方式

(富含亮氨酸的α2糖蛋白)

富含亮氨酸的α2糖蛋白或LRG是约50kDa的糖蛋白。LRG是血清蛋白之一，据说健康个体的血清中含有约3.0μg/mL。据报道，LRG是中性粒细胞分泌的。近年来，已研究了体内LRG量的变化与结核、肿瘤等各种疾病的相关性，为了准确地诊断这些疾病，需要准确地测定生物体内的LRG量。

可以使用诸如免疫学方法的已知方法来测定LRG。免疫学方法包括ELISA、酶免疫测定、表面等离子体共振、乳胶凝集免疫测定(LTIA)、化学发光免疫测定、电化学发光免疫测定、荧光抗体技术、放射免疫测定、免疫沉淀、蛋白质印迹、免疫层析、高效液相色谱(HPLC)等。

作为包含在本发明的组合物中所含的LRG，可以使用市售的LRG，也可以使用由用户生产或纯化的LRG。作为本发明的组合物中所含的LRG，可以使用体外产生的LRG，也可以使用从生物体内提取的LRG。

(pH)

考虑到LRG的稳定性，本发明的富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物的pH为7.0至9.3，优选为7.0至9.0，更优选为7.5至9.0，进一步优选为7.8至9.0，最优选为8.0至9.0。

可以使用本领域技术人员已知的pH调节剂例如氢氧化钠来调节pH。

(盐浓度)

本发明的LRG组合物的盐浓度优选为200mM至800mM，更优选为300mM至700mM，最优选为300mM至600mM。通过将盐浓度保持在该范围内，可以进一步提高LRG的稳定性。

作为本发明的LRG组合物中所含的盐的种类，可以使用任何已知的盐，例如，可以使用金属盐(如钠盐，钾盐和镁盐)以及非金属盐(如铵盐和胺盐)。优选使用金属盐，更优选使用钠盐。为了提供钠盐，最优选使用氯化钠。也可以组合使用多于一种的盐。

(富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物)

在本说明书中，富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物(以下有时称为LRG组合物)是指用于测定LRG的含有LRG的溶液。本发明的LRG组合物可以适合用作用于LRG测定的校准样品溶液。在本说明书中，校准样品溶液是指含有一定浓度的待测物质的样品溶液，其用于精确地测定待测物质，并且标准物质、校准物、对照、内标物质等是所述校准样品溶液。用于提供本发明的LRG组合物的形式是通过将LRG和pH为7.0至9.3的溶剂混合而预先制备的处于溶液状态的形式。用于提供本发明的LRG组合物的另一种形式是其中分别制备LRG和溶剂并且在使用前将两者混合成溶液状态的形式。

本发明的LRG组合物中LRG的浓度可以为0.1至1000μg/mL，0.1至100μg/mL，1至100μg/mL，1至50μg/mL或1至30μg/mL，尽管浓度不限于该范围。

在这方面，在测定富含亮氨酸的α2糖蛋白的方法中“使用富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物”是指将富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物用于准确测定富含亮氨酸的α2糖蛋白，并且是指例如，将富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物用作校准样品溶液(标准物质、校准物、对照、内标物质等)。

除了所述LRG组合物包含LRG并且具有7.0至9.3的pH，对本发明的LRG组合物的组成没有特别限制，只要不损害本发明的效果并且不会阻碍LRG的使用即可。当通过免疫学测定方法测定LRG时，不应损害本发明的效果，并且不应阻断构成测定系统的全部或部分反应，例如抗原-抗体反应、用生物素/抗生物素蛋白检测的标记反应和酶促反应。根据目的可适当地选择和使用免疫学测定方法中通常使用的成分，例如，缓冲剂(例如乙酸、柠檬酸、磷酸、HEPES、MES、Tris、甘氨酸、硼酸、碳酸和Good′s缓冲剂)、抑制非特异性反应的成分(非离子表面活性剂，例如Tween20和TritonX-100等)、促进抗原-抗体反应的成分(聚合物，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和磷脂聚合物等)、除LRG以外的糖蛋白或肽(白蛋白、酪蛋白等)、氨基酸、糖(蔗糖、环糊精等)、防腐剂(叠氮化钠、ProClin950等)等。

本发明的LRG组合物可以保存在已知的容器中。可用于本发明的LRG组合物的保存容器的材料可以是聚丙烯、聚苯乙烯或玻璃，尽管所述材料不限于这些材料。保存容器的形式可以是硬质的或软质的，并且实例包括安瓿、小瓶、软袋、注射型容器等。

LRG可以由表达LRG的细胞产生。可以通过用含有编码LRG的DNA的表达载体转化宿主来获得表达LRG的细胞。宿主细胞可以是微生物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等，可以是原核细胞或真核细胞。作为哺乳动物细胞，可以使用，例如，HepG2细胞、HEK293细胞、HeLa细胞、人FL细胞、猴COS-7细胞、猴Vero细胞、中国仓鼠卵巢细胞(以下缩写为CHO细胞)、dhfr基因敲除的CHO细胞、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠H4IIE-C3细胞、大鼠GH3细胞等。

通过常规基因工程方法，可以将以上述方式获得的质粒引入宿主细胞。可以通过用于培养微生物或培养昆虫细胞或哺乳动物细胞的通用方法来培养转化体。LRG蛋白可以通过通常用于分离/纯化普通蛋白的方法的组合来获得。

在说明书中，“保存稳定化”或“稳定性提高”是指，由于包含LRG的溶液中所含的大部分LRG被长时间保持而不分解或未发生结构变化，因此溶液的初始LRG值与保存后的测定值相差不大。更具体地，例如，这意味着，由于包含LRG的溶液中所含的75％或以上的LRG被保持了29天而不分解或未发生结构变化，因此在37℃保存29天后，测定的溶液的LRG值是初始值的75％或以上。在37℃下保存29天后，本发明的LRG组合物的测定的LRG值为基于初始量的优选80％或以上，更优选90％或以上，进一步优选95％或以上，最优选96％或以上。本发明的LRG组合物在37℃的高温下也具有长期稳定性，但是在低温或常温下保存的LRG组合物不排除在本发明的范围之外。

(用于LRG测定的生物样品)

用于测定LRG的生物样品没有特别限制，只要可以测定LRG即可，可以是血液、血清、血浆、脑脊髓液(CSF)、尿液、粪便等。优选使用血清或血浆，并且进一步优选使用血清。生物体或受试者没有特别限制，只要生物体或受试者是哺乳动物并且包括人或动物(例如，猴子、狗、猫、小鼠、豚鼠、大鼠、仓鼠、马、牛和猪)，优选是人。必要时，可以对生物样品进行适当的预处理。

(富含亮氨酸的α2糖蛋白的测定试剂盒)

使用本发明的用于测定富含亮氨酸的α2糖蛋白的试剂盒(以下有时称为LRG测定试剂盒)，可以使用LRG组合物准确地测定LRG。LRG测定试剂盒的一个实例是使用免疫学方法的试剂盒。本发明的LRG测定试剂盒可以包括用于通过免疫学方法测定人体的LRG浓度的试剂。免疫学方法包括ELISA，酶免疫测定，表面等离子体共振，乳胶凝集免疫测定(LTIA)，化学发光免疫测定，电化学发光免疫测定，荧光抗体技术，放射免疫测定，免疫沉淀，蛋白质印迹，免疫层析，高效液相色谱(HPLC)等。免疫学方法优选是乳胶凝集免疫测定(LTIA)。

本发明的LRG测定试剂盒可用于诊断自身免疫疾病，结核病，肿瘤，炎性疾病和炎性肠疾病(溃疡性结肠炎和克罗恩病)。

本发明的LRG测定试剂盒还可以包括用户指南等。试剂盒还可包括任何组成元素，例如缓冲剂，稳定剂，样品稀释剂，pH调节剂和反应容器。

(LRG组合物的保存稳定化方法)

本发明的用于LRG组合物的保存稳定化方法包括使富含亮氨酸的α2糖蛋白与pH为7.0至pH 9.3的溶剂接触的步骤。对溶剂没有特别限制，只要pH为7.0至9.3即可。溶剂可以包含缓冲剂，例如HEPES、MES、CHES和Tris，并且缓冲剂的浓度可以为1至1000mM。除了将LRG添加到pH为7.0至9.3的溶剂中以外，“使接触”还包括将pH不为7.0至9.3的包含LRG的溶液的pH调节至7.0至9.3。

接下来，参考实施例具体说明本发明，但是这些实施例不限制本发明的范围。在本说明书中，除非另有说明，％表示重量％。

实施例

[实施例1]具有不同pH值的溶液的LRG量随时间变化的检查1

在制备具有不同pH值的LRG标准抗原溶液之后，进行保存测试，并且检查LRG标准抗原溶液的LRG量随时间的变化。因此检查了pH对LRG的保存稳定性的影响。使用的LRG是使用CHO(中国仓鼠细胞)产生的。具体地，通过以下步骤来制备LRG：使用质粒将人LRG基因引入CHO-K1细胞，在无血清培养基中培养引入了LRG基因的CHO-K1细胞，并从培养物上清液中回收人LRG重组蛋白。

制备具有下表1组成的LRG标准抗原溶液，并使用4N氢氧化钠溶液将pH值控制为7.5或8.0。将LRG标准抗原溶液在37℃下保存29天，观察LRG量随时间的变化。样品组成和实验结果示于表1和2以及图1中。

[表1]

[表2]

在37℃下保存29天后，将pH值调节为8.0的LRG标准抗原溶液的测定值是初始LRG量的93％。将pH调节至7.5的LRG标准抗原溶液的测定值为初始LRG量的81％。因此，表明当LRG标准抗原溶液的pH为8.0而不是7.5时，LRG的保存稳定性优异。

[实施例2]具有不同盐浓度的溶液的LRG量随时间的变化的检查

在实施例1中制备的2号样品中，氯化钠的浓度从150mM改变为500mM，并进行保存测试。因此检查了盐浓度对LRG的保存稳定性的影响。样品组成和实验结果示于表3和图2中。

[表3]

结果表明，与盐浓度为150mM的LRG标准抗原溶液相比，盐浓度增加为500mM的LRG标准抗原溶液可以提高LRG的保存稳定性。在37℃下保存29天后，盐浓度为150mM的LRG标准抗原溶液的测定值为初始LRG量的93％，而在37℃保存29天后，盐浓度为500mM的LRG标准抗原溶液的测定值为初始LRG量的98％。

[实施例3]具有不同pH值的溶液的LRG量随时间变化的检查2

制备具有与实施例1中制备的样品相同组成的LRG标准抗原溶液，不同之处在于，使用了下表4中所示的缓冲剂，并且将pH调节至6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5。将LRG标准抗原溶液在37℃下保存29天，观察LRG量随时间的变化。样品组成和实验结果示于表4和图3中。

[表4]

从以上结果表明，当将LRG标准抗原溶液的pH调节至7.0至9.3时，LRG的保存稳定性提高。

工业适用性

本发明的富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物具有优异的保存稳定性。因此，当将本发明的富含亮氨酸的α2糖蛋白组合物用作校准样品时，可以准确地定量测定生物样品中的LRG，并且可以准确地诊断疾病。