具体实施方式

本申请提供抗CLL1单结构域抗体(sdAb)及其构建体，所述构建体诸如嵌合受体、免疫效应细胞衔接子和免疫缀合物。还提供多价和多特异性嵌合受体、双重嵌合受体系统以及分割嵌合受体系统。本文所述的抗CLL1 sdAb、嵌合受体和表达嵌合受体的工程改造的免疫细胞是用于癌症治疗的有用药剂。

因此，本申请的一个方面提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1(例如CLL1的细胞外结构域)的单结构域抗体(“sdAb”)部分。

在另一方面，提供一种抗CLL1嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(例如V_HH)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，细胞内共刺激序列和/或免疫效应细胞的主要细胞内信号传导序列，例如CD3ζ细胞内信号传导序列)。

在另一方面，提供一种多特异性嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(例如V_HH)的细胞外结构域和特异性结合第二抗原或表位的第二抗原结合结构域(例如抗CD33 sdAb、抗CD123 sdAb或NKG2D的细胞外结构域)、跨膜结构域以及包含细胞内共刺激序列和免疫效应细胞的主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)的细胞内信号传导结构域。

在另一方面，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：第一嵌合受体，其包含抗CLL1sdAb(例如V_HH)、跨膜结构域以及包含免疫效应细胞的主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)的细胞内信号传导结构域；以及第二嵌合受体，其包含特异性结合第二抗原或表位的第二抗原结合结构域(例如抗CD33 sdAb、抗CD123 sdAb或NKG2D的细胞外结构域)、跨膜结构域以及包含细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。

在另一方面，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：第一嵌合受体，其包含抗CLL1sdAb(例如V_HH)、跨膜结构域和细胞内共刺激序列；以及第二嵌合受体，其包含特异性结合第二抗原或表位的第二抗原结合结构域(例如抗CD33 sdAb、抗CD123 sdAb或NKG2D的细胞外结构域)、跨膜结构域以及包含免疫效应细胞的主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)的细胞内信号传导结构域。

本文还描述了编码抗CLL1构建体的核酸、包含嵌合受体或嵌合受体系统的工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)、药物组合物、试剂盒、制品和治疗方法。

I.定义

术语“抗原”是指能够在宿主细胞中诱导免疫反应的任何分子，或能够结合抗原特异性受体的任何分子。

术语“抗体”或“抗体部分”包括单克隆抗体(其包括全长4链抗体或具有免疫球蛋白Fc区的仅全长重链抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体、双抗体(diabodies)和单链分子)以及抗体片段(例如Fab、F(ab')₂和Fv)。在本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”可互换使用。本文涵盖的抗体包括单结构域抗体，诸如仅重链抗体。

基本4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及被称为J链的另一多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个可聚合形成多价集聚体(assemblage)的基本4链单元与J链的组合。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿(Dalton)。各L链通过共价二硫键与H链连接，而两条H链取决于H链同种型而通过一个或多个二硫键彼此连接。各H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。各H链在N端具有可变结构域(V_H)，接着是三个恒定结构域(C_H)(对于α和γ链中的每一个)和四个C_H结构域(对于μ和ε同种型)。各L链在N端具有可变结构域(V_L)，接着在其另一端具有恒定结构域。V_L与V_H对齐，并且C_L与重链的第一恒定结构域(C_H1)对齐。据信特定氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面。V_H和V_L的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见例如Basic andClinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。可将来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定结构域的氨基酸序列归于被称为κ和λ的两种明显不同类型之一。取决于其重链恒定结构域(C_H)的氨基酸序列，可将免疫球蛋白归于不同类别或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于C_H序列的相对较小差异和功能，将γ和α类别进一步分成亚类，例如人表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

术语“仅重链抗体”或“HCAb”是指功能性抗体，其包含重链，但缺乏在4链抗体中通常存在的轻链。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。

术语“单结构域抗体”、“单结构域抗体部分”、“sdAb”或“sdAb部分”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽，其包括全长抗体(例如HCAb)以及其抗原结合片段(例如V_HH)。单独的sdAb能够在不与相应含CDR多肽配对的情况下结合抗原。在一些情况下，单结构域抗体由骆驼科HCAb工程改造而成，并且其重链可变结构域在本文中称为“V_HH”。一些V_HH还可称为纳米抗体。骆驼科sdAb是最小已知抗原结合抗体片段之一(参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本V_HH从N端至C端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。

“分离”抗体是已从其产生环境(例如天然或重组)的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体。优选地，分离多肽不与其产生环境中的所有其他组分缔合。其产生环境中的污染物组分(诸如由重组转染细胞产生的污染物组分)是通常将干扰抗体的研究、诊断性或治疗性用途的材料，并且可包括酶、激素以及其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选实施方案中，将多肽纯化至：(1)大于95重量％的抗体，如通过例如劳瑞法(Lowry method)所确定，并且在一些实施方案中，纯化至大于99重量％；(2)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过在非还原或还原条件下使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选地银染进行SDS-PAGE证实具有均一性。分离抗体包括原位处于重组细胞内的抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽或抗体。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“V_H”和“V_L”。这些结构域通常是抗体中变化最大的部分(相对于相同类别的其他抗体)，并且含有抗原结合位点。来自骆驼科物种的仅重链抗体具有单一重链可变区，称为“V_HH”。因此V_HH是V_H的特定类型。

术语“可变”是指以下事实：在抗体之间，可变结构域的某些区段的序列差异很大。V结构域介导抗原结合并且定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在可变结构域的整个范围内均匀分布。而是，其集中在轻链可变结构域和重链可变结构域两者中被称为高变区(HVR)的三个区段中。可变结构域中更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用β折叠构型的四个FR区，所述四个FR区通过三个HVR连接，从而形成连接并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分的环。各链中的HVR通过FR区紧密保持在一起，并且与另一链中的HVR紧密保持在一起，从而有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第十五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均一抗体的群体获得的抗体，即，构成群体的个别抗体除可少量存在的可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。除特异性之外，单克隆抗体的优点在于其通过杂交瘤培养物合成或以重组方式合成，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体的特征是从基本上均一的抗体群体获得，并且不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本申请使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，所述技术包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))以及用于在具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的动物中产生人或人样抗体的技术(参见，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；以及5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换用于指与抗体片段相对的基本上完整形式的抗体。特定地讲，全长4链抗体包括具有重链和轻链的抗体，其包括Fc区。仅全长重链抗体包括重链(诸如V_HH)和Fc区。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应功能。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；单结构域抗体(诸如V_HH)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两种相同的抗原结合片段，所述片段称为“Fab”片段和残余“Fc”片段，“Fc”片段的名称反映容易结晶的能力。Fab片段由完整L链以及H链的可变区结构域(V_H)和一条重链的第一恒定结构域(C_H1)组成。各Fab片段在抗原结合方面是单价的，即，其具有单一抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单一大F(ab')₂片段，所述片段大致对应于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段并且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，其在C_H1结构域的羧基端具有几个另外的残基，所述残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中如下Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基。F(ab')₂抗体片段最初以Fab'片段对的形式产生，所述Fab'片段对在其间具有铰链半胱氨酸。还已知抗体片段的其他化学偶合。

Fc片段包含由二硫键保持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列决定，所述区还被某些类型的细胞上存在的Fc受体(FcR)识别。

“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(3个环各自来自H链和L链)，所述环提供用于抗原结合的氨基酸残基，并且赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原具有特异性的HVR)还具有识别并且结合抗原的能力，但亲和力低于完整结合位点。

“单链Fv”，还缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单一多肽链的V_H和V_L抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还在V_H与V_L结构域之间包含多肽接头，从而使sFv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。

本文所述抗体的“功能片段”包括完整抗体的一部分，所述部分通常包括完整抗体的抗原结合或可变区，或保留或具有改变的FcR结合能力的抗体的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“双抗体(diabodies)”是指通过如下方法制备的小抗体片段：在V_H与V_L结构域之间用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(参见前段)，使得实现V结构域的链间配对而非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两种“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的V_H和V_L结构域存在于不同多肽链上。双抗体更详细地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中。

本文的单克隆抗体明确地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要其表现出期望生物学活性即可(美国专利4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用目标抗原免疫猕猴产生的抗体。如本文所用，所使用的“人源化抗体”是“嵌合抗体”的亚组。

非人(例如骆驼科)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受体的HVR(下文定义)的残基被具有期望特异性、亲和力和/或能力的来自非人物种(供者抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的HVR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含受者抗体或供者抗体中未发现的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能，诸如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上全部，其中高变环中的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白序列的高变环，并且FR区中的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的FR区，但所述FR区可包括一个或多个改善抗体性能(诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的个别FR残基取代。FR中这些氨基酸取代的数量在H链中通常不超过6，并且在L链中不超过3。人源化抗体任选地将还包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)。对于其他细节，参见例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利6,982,321和7,087,409。

“人抗体”是如下抗体，其具有对应于人所产生抗体的氨基酸序列，和/或使用如本文所公开的用于制备人抗体的任何技术制备。人抗体的此定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术产生，所述技术包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。以下文献中所述的方法还可用于制备人单克隆抗体：Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。还参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可以通过向转基因动物施用抗原来制备，所述转基因动物经过修饰以响应于抗原激发产生此类抗体，但其内源基因座已失能(disabled)，例如经免疫的异种小鼠(关于XENOMOUSE^TM技术，参见例如美国专利6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。

当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域中序列高变和/或形成结构上限定的环的区域。通常，sdAb包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3在三个HVR中表现出最大多样性，并且据信在赋予抗体优良特异性方面起独特作用。参见，例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。

术语“互补决定区”或“CDR”用于指由Kabat系统定义的高变区。参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。

多种HVR描绘可供使用并且涵盖于本文中。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性并且最常用(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。或者，Chothia提及结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“contact”HVR是基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基示于下表1中。

表1.HVR界定

HVR可包括如下“扩展HVR”：V_L中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及V_H中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，根据以上Kabat等人对可变结构域残基进行编号。

sdAb(诸如V_HH)的氨基酸残基根据Kabat等人(“Sequence of proteins ofimmunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.,出版号91)提供的用于V_H结构域的通用编号进行编号，所述编号适用于Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000年6月23日；240(1-2):185-195的文章中的来自骆驼科的V_HH结构域。根据此编号，V_HH的FR1包含1-30位的氨基酸残基，V_HH的CDR1包含31-35位的氨基酸残基，V_HH的FR2包含36-49位的氨基酸，V_HH的CDR2包含50-65位的氨基酸残基，V_HH的FR3包含66-94位的氨基酸残基，V_HH的CDR3包含95-102位的氨基酸残基，并且V_HH的FR4包含103-113位的氨基酸残基。在此方面，应注意，如本领域中对于V_H结构域和V_HH结构域所熟知，各CDR中氨基酸残基的总数可变化，并且可不对应于Kabat编号所表明的氨基酸残基总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可不被实际序列占据，或实际序列可含有比Kabat编号允许的数量更多的氨基酸残基)。

表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型是指以上Kabat等人中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可含有较少氨基酸或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或在所述FR或HVR中的插入。例如，重链可变结构域可在H2的残基52后包括单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)，并且在重链FR残基82后包括插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列中具有同源性的区域与“标准”Kabat编号的序列比对来确定给定抗体中残基的Kabat编号。

除非本文另外表明，否则免疫球蛋白重链中残基的编号是如以上Kabat等人中的EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1EU抗体的残基编号。

“框架”或“FR”残基是除如本文所定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。

“人共有框架”或“受体人框架”是代表人免疫球蛋白V_L或V_H框架序列的选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，从可变结构域序列的亚组选择人免疫球蛋白V_L或V_H序列。通常，序列的亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的亚组。对于V_L，实例包括如下亚组，其可是如以上Kabat等人中的亚组κI、κII、κIII或κIV。此外，对于VH，亚组可是如Kabat等人中的亚组I、亚组II或亚组III。可替代地，人共有框架可来源于上述亚组，其中通过将供体框架序列与各种人框架序列的集合比对，基于与供体框架的同源性来选择特定残基，诸如人框架残基。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同氨基酸序列，或其可含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数量是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。

指定位置(例如Fc区)的“氨基酸修饰”是指指定残基的取代或缺失，或与在指定残基相邻位置插入至少一个氨基酸残基。在指定残基的“相邻位置”插入意指在其一至两个残基内插入。插入可在指定残基的N端或C端。本文的优选氨基酸修饰是取代。

“亲和力成熟”抗体是在其一个或多个HVR中具有一种或多种改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，所述改变使抗体对抗原的亲和力改善。在一些实施方案中，亲和力成熟抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。通过本领域已知的程序产生亲和力成熟抗体。例如，Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述通过V_H和V_L结构域改组实现的亲和力成熟。以下参考文献描述HVR和/或框架残基的随机诱变，例如：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。

如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对…具有特异性”是指可测量并且可再现的相互作用，诸如靶标与抗原结合蛋白(诸如嵌合受体或sdAb)之间的结合，其在包括生物分子的异质分子群存在下确定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以是表位)的抗原结合蛋白是相对于其与其他靶标结合，与此靶标以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间结合的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量，抗原结合蛋白与不相关靶标的结合程度小于抗原结合蛋白与靶标的结合的约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗原结合蛋白的解离常数(Kd)是≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM或≤0.1nM。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白质之间是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不需要排他性结合。

术语“特异性”是指抗原结合蛋白(诸如嵌合受体或抗体构建体)对于抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体例如具有单特异性。如本文所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同抗原或表位。如本文所用，“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同抗原结合特异性。如本文所用，术语“单特异性”表示抗原结合蛋白具有一个或多个结合位点，所述结合位点各自结合相同抗原或表位。

如本文所用，术语“价”表示抗原结合蛋白中存在指定数量的结合位点。例如，天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。

“抗体效应功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)并且随抗体同种型而变化的那些生物学活性。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；以及B细胞活化。“降低或最小化”的抗体效应功能意指从野生型或未修饰抗体降低至少50％(可替代地60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的抗体效应功能。本领域普通技术人员可容易确定和测量抗体效应功能。在一个优选实施方案中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应功能受影响。在一些实施方案中，通过消除糖基化的恒定区突变(例如“无效应子突变”)来消除效应功能。在一个方面，无效应子突变是C_H2区域中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等人,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。可替代地，导致效应功能降低或消除的另外的突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。可替代地，可以通过制备技术来降低或消除效应功能，诸如在不糖基化的宿主细胞(例如大肠杆菌)或导致不能有效或不太有效地促进效应功能的改变的糖基化模式的宿主细胞中表达(例如Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003))。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指细胞毒性的一种形式，其中结合到某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，并且随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是通过此机制杀伤靶细胞所必需的。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的Fc表达。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外，可在体内，例如在动物模型(诸如Clynes等人,PNAS USA95:652-656(1998)中公开的动物模型)中评估目标分子的ADCC活性。

本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可变化，但通常将人IgG重链Fc区定义为从Cys226位的氨基酸残基或从Pro230至其羧基端的链段。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程改造编码抗体重链的核酸而去除。因此，完整抗体的组合物可包含去除所有K447残基的抗体群体、未去除K447残基的抗体群体以及具有含和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。用于本文所述抗体的合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体或CAR)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外表明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与抗原，或CAR与抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，所述方法包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原，并且往往易于解离，而高亲和力的抗体通常更快地结合抗原并且往往较长久地保持结合。本领域中已知测量结合亲和力的多种方法，所述方法中的任一者均可用于本申请的目的。下文描述用于测量结合亲和力的特定说明性且示例性的实施方案。

“阻断性”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。在一些实施方案中，阻断性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。

关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对候选序列和特定肽或氨基酸序列并且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与特定肽或氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN^TM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，所述参数包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。

如本文所用，“嵌合受体”、“嵌合抗原受体”或“CAR”是指经遗传工程改造的受体，其可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫细胞，诸如T细胞上。一些嵌合受体也称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施方案中，嵌合受体包含对一种或多种抗原(诸如肿瘤抗原)或表位具有特异性的细胞外结构域、跨膜结构域以及T细胞和/或共刺激受体的细胞内信号传导结构域。“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。“抗CLL1CAR”是指具有对CLL1具有特异性的细胞外结合结构域的CAR。

编码本文所述的嵌合受体或抗CLL1构建体的“分离”核酸分子是经过鉴定并且与在其产生环境中通常缔合的至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子。优选地，分离核酸不与和产生环境相关的所有组分缔合。编码本文的多肽和抗体的分离核酸分子的形式不同于其天然存在的形式或环境。因此，分离核酸分子与天然存在于细胞中的编码本文的多肽和抗体的核酸不同。

术语“调控序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，所述核酸是“可操作地连接”的。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述DNA与所述多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点被定位成有利于翻译，则所述核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。通过在方便限制性位点连接来完成连接。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接物(adaptor)或接头。

如本文所用，术语“载体”是指如下核酸分子，其能够传送与其连接的另一核酸。所述术语包括为自复制核酸结构形式的载体，以及掺入宿主细胞基因组中的载体，其中已在所述宿主细胞中引入所述载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

如本文所用，术语“自体”是指来源于同一个体的任何材料，之后将所述材料再引入所述个体中。

“同种异体”是指来源于相同物种的不同个体的移植物。

如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代主题细胞及其子代。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称均包括子代。因此，词语“转染子”和“转染细胞”包括原代主题细胞和来源于其的培养物，与转移次数无关。还应理解，由于有意或无意突变，所有子代的DNA含量可能不完全相同。包括具有与原始转化细胞中所筛选相同的功能或生物学活性的变体子代。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于其的子代，而与传代次数无关。子代的核酸含量可与亲代细胞不完全相同，而是可含有突变。本文包括具有与原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体子代。

如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益或期望结果，包括临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的一个或多个：减轻由疾病引起的一种或多种症状、减弱疾病的程度、稳定疾病(例如预防或延缓疾病的恶化)、预防或延缓疾病的扩散(例如转移)、预防或延缓疾病的复发、延缓或减缓疾病的进展、改善疾病状态、使疾病缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需要的一种或多种其他药物的剂量、延缓疾病的进展、提高生活品质和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理结果。本申请的方法涵盖治疗的这些方面中的任何一个或多个。

如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人。

本文所用的术语“有效量”是指药剂(诸如抗CLL1构建体、工程改造的免疫细胞或其药物组合物)足以治疗指定病症、病状或疾病(诸如改善、缓和、减轻和/或延缓其症状中的一个或多个)的量。关于癌症，有效量包括足以使肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(诸如以抑制肿瘤生长)或预防或延缓其他不所要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延缓发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延缓复发的量。有效量可在一次或多次施用中施用。有效量的药物或组合物可：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤尺寸；(iii)在某种程度上抑制、延迟、减缓并且优选终止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即在某种程度上减缓并且优选终止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延缓肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在某种程度上缓解一种或多种癌症相关症状。

“辅助治疗(Adjuvant setting)”是指个体具有癌症史并且通常(但不一定)对疗法起反应的临床方案，其包括但不限于手术(例如手术切除)、放射疗法和化学疗法。然而，由于其癌症史，这些个体被视为具有发展所述疾病的风险。“辅助治疗”中的治疗或施用是指后续治疗模式。风险程度(例如，当辅助治疗中的个体被视为“高风险”或“低风险”时)取决于若干因素，最通常是首次治疗时的疾病程度。

“新辅助治疗(Neoadjuvant setting)”是指如下临床方案，其中在初始/确定性疗法之前进行所述方法。

如本文所用，“延缓”癌症的发展是指推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推延疾病的发展。此延缓可取决于病史和/或所治疗个体而具有不同的时间长度。如本领域技术人员显而易见，足够或显著的延缓在个体不发展所述疾病的情况下实际上可涵盖预防。“延缓”癌症发展的方法是如下方法，在与不使用所述方法相比时，其在给定时间范围内降低疾病发展的可能性和/或在给定时间范围内降低疾病的程度。此类比较通常基于使用统计学上显著数量的个体进行的临床研究。癌症发展可以使用标准方法检测，所述方法包括但不限于计算机轴向断层扫描(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血测试、动脉造影或活检。发展还可指最初可能无法检测到的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。

术语“药物制剂”是指如下制剂，其为使活性成分的生物学活性有效的形式，并且不包含对制剂将所施用的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。此类制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌性的或不含所有活微生物及其孢子。

应理解，本文所述的本申请的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。

本文提及“约”值或参数包括(并且描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。

如本文所用，提及“不是”值或参数通常是指并且描述“除值或参数之外”。例如，所述方法不用于治疗X型癌症是指所述方法用于治疗除X型之外的癌症。

本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。

除非上下文另外明确规定，否则如本文和随附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。

II.抗CLL1构建体

在一个方面，本申请提供一种抗CLL1构建体，其包含抗CLL1 sdAb部分。本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者或其抗原结合片段(例如V_HH)可用于抗CLL1构建体。抗CLL1sdAb描述于以下部分“A.抗CLL1单结构域抗体”中。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:95的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:101的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:102的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:103的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:104的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:105的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:106的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:174的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:175的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1构建体，其包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分包含有包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:176的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，抗CLL1构建体是跨膜分子。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是分泌型分子。

在一些实施方案中，抗CLL1构建体是包含本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者的单克隆抗体，其包括骆驼科、嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是抗体片段，例如V_HH片段。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是仅全长重链抗体，其包含任何抗体类别或同种型(诸如IgG1或IgG4)的Fc区。在一些实施方案中，Fc区具有降低或最小化的效应功能。

在一些实施方案中，抗CLL1构建体是嵌合受体，其包含有包含本文所述的抗CLL1sdAb中的任一者的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫细胞的主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫细胞的主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)和细胞内共刺激序列两者。抗CLL1嵌合受体和嵌合受体系统进一步描述于部分“B.嵌合受体”中。包含抗CLL1嵌合受体或嵌合受体系统的工程改造的免疫细胞描述于部分IV中。

在一些实施方案中，抗CLL1构建体是单特异性分子。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是多特异性分子。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是双特异性分子。

在一些实施方案中，抗CLL1构建体是多特异性抗原结合蛋白，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分。在一些实施方案中，第二结合部分是sdAb或scFv。在一些实施方案中，第二结合部分特异性结合CLL1上的不同表位。在一些实施方案中，第二结合部分特异性结合第二抗原，诸如肿瘤抗原，或免疫细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，抗CLL1sdAb与第二结合部分通过肽接头连接。

在一些实施方案中，抗CLL1构建体是免疫效应细胞衔接子，其包含本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者和特异性结合免疫细胞(诸如T细胞)表面上的抗原的第二结合部分。在一些实施方案中，第二结合部分特异性结合选自由以下组成的组的抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、4-1BB、CD27、CD40L和HVEM。免疫效应细胞衔接子进一步描述于以下部分“C.免疫效应细胞衔接子”中。

在一些实施方案中，抗CLL1构建体是免疫缀合物，其包含本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者和效应分子。在一些实施方案中，效应分子是选自由以下组成的组的治疗剂：药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽和核酸。在一些实施方案中，效应分子是药物或毒素。在一些实施方案中，效应分子是标记。免疫缀合物在下文部分“D.免疫缀合物”中进一步描述。

A.抗CLL1单结构域抗体

本申请的一个方面提供特异性结合CLL1的分离的单结构域抗体(本文中称为“抗CLL1 sdAb”)。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb调节CLL1活性。在一些实施方案中，抗CLL1sdAb是拮抗剂抗体。还提供来源于本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者的抗原结合片段(例如V_HH)和包含本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者的构建体。示例性抗CLL1 sdAb在下表2中列出。本文所述的抗CLL1构建体包含一种或多种抗CLL1 sdAb部分。

表2.示例性抗CLL1 sdAb。

SEQ ID NO:94(AS82472 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:95(AS82480 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:96(AS82494 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:97(AS82505 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:98(AS82544 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:99(AS82658 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:100(AS82718 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:101(AS83180 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:102(AS83183 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:103(AS83309 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:104(AS83431 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:105(AS83478 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:106(AS83591 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:171(AS83010 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:172(AS83457 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:173(AS83591 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:107(AS82472 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:108(AS82480 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:109(AS82494 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:110(AS82505 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:111(AS82544 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:112(AS82658 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:113(AS82718 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:114(AS83180 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:115(AS83183 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:116(AS83309 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:117(AS83431 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:118(AS83478 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:119(AS83791 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:174(AS83010 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:175(AS83457 sdAb核酸序列)

SEQ ID NO:176(AS83591 sdAb核酸序列)

C型凝集素样分子-1(CLL1)，也称为CLEC12A、C型凝集素结构域家族12的成员A、DCAL-2、MICL和CD371，是II型跨膜糖蛋白，其用作抑制性受体。CLL1的表达局限于骨髓谱系细胞以及大多数AML母细胞中。具体地，CLL1选择性地存在于急性骨髓性白血病(AML)中的白血病干细胞中，但不存在于正常造血干细胞中。CLL1可以是针对AML的免疫治疗剂的合适肿瘤抗原靶标。参见，例如Wang J.等人,(2018)J.Hematol.Oncol.,11:7；Zhao X.等人,(2010),Haematologica,95(1):71-78；以及Lu H.等人,(2014)AngewChem.Int.Ed.Engl.53(37):9841-9845。

在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb特异性结合人CLL1。在一些实施方案中，抗CLL1sdAb特异性结合食蟹猴CLL1。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb特异性结合CLL1的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb特异性结合SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb特异性识别人CLL1内的表位。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb与来自非人物种的CLL1交叉反应。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb完全对人CLL1具有特异性，并且不表现出物种或其他类型的非人交叉反应性。

在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb与CLL1蛋白(或其片段)的至少一种等位基因变体交叉反应。在一些实施方案中，在与天然存在的CLL1(或其片段)比较时，等位基因变体具有最多约30个(诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个中的任一者)氨基酸取代(诸如保守取代)。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb不与CLL1蛋白(或其片段)的任何等位基因变体交叉反应。

在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ IDNO:96的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ IDNO:105的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列中的一个、两个或全部三个CDR的抗CLL1 sdAb。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158和165中的任一者的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160和167中的任一者的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162和169中的任一者的氨基酸序列的CDR3。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)与SEQ ID NO:4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158和165中的任一者的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的CDR1；(b)与SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160和167中的任一者的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的CDR2；以及(c)与SEQ ID NO:8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162和169中的任一者的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性中的任一者的CDR相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CLL1 sdAb保留结合CLL1的能力。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)相对于SEQ ID NO:4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、151、158和165中的任一者的氨基酸序列具有约1、2或3个氨基酸取代(例如保守取代)、插入或缺失中的任一者的CDR1；(b)相对于SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、153、160和167中的任一者的氨基酸序列具有约1、2或3个氨基酸取代(例如保守取代)、插入或缺失中的任一者的CDR2；以及(c)相对于SEQ ID NO:8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、155、162和169中的任一者的氨基酸序列具有约1、2或3个氨基酸取代(例如保守取代)、插入或缺失中的任一者的CDR3。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:4、6和8的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:11、13和15的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:18、20和22的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:25、27和29的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:32、34和36的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:39、41和43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:46、48和50的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:53、55和57的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLLsdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQID NO:62的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQID NO:60的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:60、62和64的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:67、69和71的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:74、76和78的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:81、83和85的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQID NO:88、90和92的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:151、153和155的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:158、160和162的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1或其在CDR1中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；(b)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2或其在CDR2中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体；以及(c)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3或其在CDR3中包含最多约3个(例如1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1 sdAb，其包含：(a)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:165、167和169的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb，包括上述实施方案中的任一者(即包含特定CDR1、CDR2和/或CDR3的抗CLL1 sdAb)，包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的V_HH结构域。在一些实施方案中，具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性中的任一者的V_HH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CLL1 sdAb保留结合CLL1的能力。在一些实施方案中，在SEQ IDNO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列中，总共1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR外的区域中(即，在FR中)。在一些实施方案中，抗CLL1sdAb包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列，任选地包括所述序列的翻译后修饰。

在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:95。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:98。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:99。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:100。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:101。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:102。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:103。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:104。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:105。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种分离的抗CLL1 sdAb，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:106。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列。

在一些实施方案中，可以通过组合丙氨酸扫描来定位功能性表位。在此过程中，可以使用组合丙氨酸扫描策略来鉴定CLL1蛋白中与抗CLL1 sdAb的相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，表位是构象表位，并且可使用结合CLL1的抗CLL1 sdAb的晶体结构来鉴定表位。

在一些实施方案中，本申请提供与本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者竞争结合CLL1的抗体(例如sdAb)。在一些实施方案中，本申请提供与本文所提供的抗CLL1 sdAb中的任一者竞争结合CLL1上的表位的抗体(例如sdAb)。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1抗体(例如sdAb)，其与包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列的抗CLL1sdAb结合相同的表位。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1抗体(例如sdAb)，其与包含SEQID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列的抗CLL1 sdAb竞争性地特异性结合CLL1。

在一些实施方案中，可使用竞争测定鉴定与本文所述的抗CLL1 sdAb竞争结合CLL1的单克隆抗体。可使用竞争测定通过识别相同或空间重叠的表位来确定两种抗体是否结合相同表位，或确定一种抗体是否竞争性地抑制另一抗体与抗原的结合。在某些实施方案中，所述竞争性抗体结合本文所述的抗体所结合的相同表位。示例性竞争测定包括但不限于常规测定，诸如Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,第14章(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)中提供的那些。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”Methods in Molecular Biology,第66卷(Humana Press,Totowa,N.J.)中提供了用于定位抗体所结合的表位的详细的示例性方法。在一些实施方案中，如果各抗体将另一抗体的结合阻断50％或更多，则所述两种抗体被称为结合相同表位。在一些实施方案中，与本文所述的抗CLL1 sdAb竞争的抗体是骆驼科、嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，本申请提供与如本文所述的骆驼科、嵌合、人源化或人抗CLL1 sdAb竞争的抗体。

B.嵌合受体和嵌合受体系统

本申请的一个方面提供一种嵌合受体，其包含有包含一种或多种抗CLL1 sdAb(例如V_HH)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。还提供一种嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(例如V_HH)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的结合部分的细胞外结构域。部分A中所述的抗CLL1sdAb中的任一者可用于本文所述的嵌合受体或嵌合受体系统。嵌合受体和嵌合受体系统的示例性结构在图8A-8E中示出。

在一些实施方案中，提供一种靶向CLL1的嵌合受体(本文中还称为“抗CLL1嵌合受体”或“抗CLL1 CAR”)，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列，或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分是骆驼科、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ(即“CD3ζ细胞内信号传导序列”)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于CD28或4-1BB。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)和细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含主要细胞内信号传导序列，但不包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列，但不包含主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如，CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种抗CLL1嵌合受体，其包含与SEQ ID NO:120-132、177-179、181和229-230中的任一者的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的多肽。在一些实施方案中，提供一种抗CLL1嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:120-132、177-179、181和229-230中的任一者的氨基酸序列的多肽。还提供一种多肽，其包含SEQ IDNO:120-132、177-179、181和229-230中的任一者的氨基酸序列。

示例性抗CLL1嵌合受体在下表3中示出。

表3.示例性抗CLL1嵌合受体。

在一些实施方案中，提供一种靶向CLL1的嵌合受体，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域，所述抗CLL1 sdAb包含有包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含如下多肽，其包含SEQ ID NO:125或181的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:125或181的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种靶向CLL1的嵌合受体，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域，所述抗CLL1 sdAb包含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含如下多肽，其包含SEQ ID NO:120或229的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:120或229的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

在一些实施方案中，提供一种靶向CLL1的嵌合受体，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域，所述抗CLL1 sdAb包含有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb部分、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含如下多肽，其包含SEQ ID NO:122或230的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:122或230的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。

多价嵌合受体

本申请还提供多价抗CLL1嵌合受体，其具有两个或更多个(诸如约2、3、4、5、6个或更多个中的任一者)特异性结合CLL1的结合部分。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个是抗原结合片段。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个包含sdAb。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个来源于骆驼科抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个来源于四链抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个是scFv。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个来源于人抗体。在一些实施方案中，结合部分中的一个或多个是特异性结合CLL1的受体、多肽配体或其他非抗体多肽的细胞外结构域。在一些实施方案中，多价嵌合受体是单特异性的，即所述多价嵌合受体仅靶向CLL1，并且包含两个或更多个针对CLL1的结合位点。在一些实施方案中，多价嵌合受体是多特异性的，即所述多价嵌合受体靶向多于一种抗原或表位。对相同抗原具有特异性的结合部分可结合抗原的相同表位(即“单表位嵌合受体”)或结合抗原的不同表位(即“多表位嵌合受体”，诸如双表位嵌合受体或三表位嵌合受体)。对相同抗原具有特异性的结合位点可包含相同或不同的sdAb。

在一些实施方案中，本申请提供一种多价(诸如二价、三价或更高价数)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含多个(诸如至少约2、3、4、5、6个或更多个中的任一者)特异性结合CLL1的结合部分；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，本申请提供一种多价(诸如二价、三价或更高价数)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含多个(诸如至少约2、3、4、5、6个或更多个中的任一者)抗CLL1 sdAb部分；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，本申请提供一种多价(诸如二价、三价或更高价数)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含特异性结合CLL1的第一表位的sdAb部分，以及特异性结合CLL1的第二表位的第二结合部分(例如sdAb或scFv)；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域，其中第一表位与第二表位不同。在一些实施方案中，第一抗CLL1 sdAb位于第二CLL1结合部分(例如第二抗CLL1 sdAb)的N端。在一些实施方案中，第一抗CLL1 sdAb位于第二CLL1结合部分(例如第二抗CLL1 sdAb)的C端。在一些实施方案中，多价嵌合受体特异性结合CLL1上的两个不同表位。在一些实施方案中，多价嵌合受体特异性结合CLL1上的三个或更多个不同表位。

在一些实施方案中，结合部分，诸如sdAb(包括多个sdAb或第一sdAb和/或第二sdAb)是骆驼科、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，结合部分或sdAb通过肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，各肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35、25、20、15、10或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于CD28或4-1BB。在一些实施方案中，多价嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(诸如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，多价嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，多价嵌合受体是单特异性的。在一些实施方案中，多价嵌合受体是多特异性的，诸如双特异性的。

本文所述的多价嵌合受体可尤其适用于通过不同抗原结合位点协同结合来靶向多聚体抗原，或适用于提高与抗原的结合亲和力或亲合力。本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者可用于本文所述的多价嵌合受体的细胞外结构域。

多特异性嵌合受体

本申请还提供多特异性嵌合受体，其靶向两种或更多种(诸如约2、3、4、5、6种或更多种中的任一者)不同抗原。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体对各抗原具有一个抗原结合位点。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体对至少一种抗原具有多于两个结合位点。各抗原结合位点可包含sdAb。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体是双特异性嵌合受体。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体是三特异性嵌合受体。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(诸如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和特异性结合第二抗原或表位的第二结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(诸如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和特异性结合第二抗原的第二sdAb；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(诸如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和特异性结合第二抗原的scFv；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(诸如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和特异性结合第二抗原的受体的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，第二抗原选自由以下组成的组：NKG2D配体、CD33、WT1、CS1、CD123、叶酸受体β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27和CD70。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb和/或第二结合部分(包括第二sdAb或scFv)是骆驼科、嵌合、人或人源化的。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb和第二结合部分(包括第二sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)通过肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35、25、20、15、10或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于CD28或4-1BB。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(诸如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和抗CD33sdAb或scFv；(b)跨膜结构域，以及(c)包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内结构域。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb和抗CD33 sdAb的细胞外结构域；(b)跨膜结构域(例如CD28跨膜结构域)，以及(c)细胞内结构域(例如包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内结构域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；并且其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb在抗CD33 sdAb的N端。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb在抗CD33sdAb的C端。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb与抗CD33 sdAb通过肽接头融合。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:142-147和182-183中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:225的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb和抗CD33 sdAb的细胞外结构域，其中抗CLL1 sdAb的C端通过肽接头与抗CD33 sdAb的N端融合；(b)跨膜结构域(例如CD28跨膜结构域)，以及(c)细胞内结构域(例如包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内结构域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3；并且其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:225的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含与SEQ ID NO:184的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含与SEQ ID NO:185的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含与SEQ ID NO:188的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，其包含与SEQID NO:184-195中的任一者的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的多肽。在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，其包含有包含SEQ IDNO:184-195中的任一者的氨基酸序列的多肽。还提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:184-195中的任一者的氨基酸序列。

示例性抗CLL1串联嵌合受体在下表4中示出。

表4.示例性抗CLL1 sdAb串联嵌合受体。

任何合适的抗CD33 sdAb或scFv均可用于本文所述的靶向CLL1和CD33的多特异性嵌合受体。已描述示例性抗CD33 sdAb，例如参见PCT/CN2018/104882。示例性抗CD33 sdAb的序列在下表5中示出。

表5.示例性抗CD33 sdAb。

SEQ ID NO:225(AS49264 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:226(AS49814 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:227(AS50073 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

SEQ ID NO:228(AS67190 sdAb氨基酸序列；CDR加有下划线)

在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和抗CD123sdAb或scFv；(b)跨膜结构域，以及(c)包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内结构域。

在一些实施方案中，提供一种多特异性(例如双特异性)嵌合受体，其包含：(a)细胞外结构域，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和NKG2D的细胞外结构域；(b)跨膜结构域，以及(c)包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内结构域。

嵌合受体系统

本申请还提供包含两种或更多种嵌合受体的嵌合受体系统，其包括双重嵌合受体系统和分割嵌合受体。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列和细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列和细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二抗原选自由以下组成的组：NKG2D配体、CD33、WT1、CS1、CD123、叶酸受体β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27和CD70。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于CD28或4-1BB。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(诸如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，第一嵌合受体和第二嵌合受体各自包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAB(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域，其中任选地细胞内信号传导结构域不包含细胞内共刺激序列；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域，其中任选地细胞内信号传导结构域不包含主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，第二抗原选自由以下组成的组：NKG2D配体、CD33、WT1、CS1、CD123、叶酸受体β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27和CD70。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于CD28或4-1BB。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(诸如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、第二结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含有包含细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域的细胞内结构域，其中任选地细胞内信号传导结构域不包含主要细胞内信号传导序列；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域，其中任选地细胞内信号传导结构域不包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，第二抗原选自由以下组成的组：NKG2D配体、CD33、WT1、CS1、CD123、叶酸受体β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27和CD70。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于CD28或4-1BB。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(诸如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、抗CLL1 sdAb、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、第二结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD33 sdAb或scFv的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)。在一些实施方案中，跨膜结构域选自由以下组成的组：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(诸如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，第一嵌合受体和/或第二嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。

任何合适的抗CD33 sdAb或scFv均可用于本文所述的靶向CLL1和CD33的双重嵌合受体系统。示例性抗CD33 sdAb已有描述，例如参见PCT/CN2018/104882。示例性抗CD33sdAb的序列在表5中示出。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD28跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CLL1 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(2)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD33 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD8跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CD33 sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:207的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(3)包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列或其包含与SEQ IDNO:96的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列或其包含与SEQID NO:226的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:227的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:228的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD28跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD33 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD8跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ IDNO:226的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:226的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD28跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD33 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD8跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ IDNO:227的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:227的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD28跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CLL1 sdAb包含：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD33 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域(例如CD8跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域)，其中抗CD33 sdAb包含：包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CD33 sdAb部分包含如下V_HH结构域，其包含SEQ IDNO:228的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:228的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域以及包含来源于CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二嵌合受体包含从N端至C端包含以下的多肽：CD8信号肽、细胞外结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域以及包含来源于4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含与SEQ ID NO:229或230的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的多肽；以及(b)第二嵌合受体，其包含与SEQ ID NO:231、232或233的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的多肽。在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:229或230的氨基酸序列的多肽；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:231、232或233的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列的多肽；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列的多肽；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含SEQID NO:232的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的多肽；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体构建体，其包含有包含本文所述的抗CLL1嵌合受体中的任一者的第一多肽和包含本文所述的抗CD33嵌合受体中的任一者的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽通过自切割肽(例如P2A肽)彼此融合。在一些实施方案中，双重嵌合受体构建体包含与SEQ ID NO:234的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，双重嵌合受体构建体包含与SEQ ID NO:235的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，双重嵌合受体构建体包含与SEQ ID NO:236的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，双重嵌合受体构建体包含SEQ ID NO:234、235或236的氨基酸序列。还提供编码本文所述的双重嵌合受体构建体中的任一者的核酸。还提供一种多肽，其包含SEQ ID NO:234-236中的任一者的氨基酸序列。

示例性抗CLL1双重嵌合受体系统在下表6中示出。

表6.示例性抗CLL1 sdAb双重嵌合受体。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD123 sdAb或scFv的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种双重嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含NKG2D的细胞外结构域的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD33 sdAb或scFv的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD123 sdAb或scFv的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含NKG2D的细胞外结构域的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD33 sdAb或scFv的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含抗CD123 sdAb或scFv的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，提供一种分割嵌合受体系统，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含来源于4-1BB或CD28的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域；以及(b)第二嵌合受体，其包含有包含NKG2D的细胞外结构域的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

细胞外结构域

本文所述的嵌合受体的细胞外结构域包含一个或多个(诸如1、2、3、4、5、6个或更多个中的任一者)结合部分，诸如sdAb。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，一个或多个结合部分来源于四链抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分来源于骆驼科抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分来源于人抗体。在一些实施方案中，一个或多个结合部分是非抗体结合蛋白，诸如结合抗原的受体细胞外结构域、多肽配体或工程改造的蛋白。结合部分可直接通过肽键或通过肽接头彼此融合。

在一些实施方案中，细胞外结构域包含第二结合部分。第二结合部分特异性结合细胞表面分子。第二结合部分可经过选择以识别用作与特殊疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的抗原。第二结合部分靶向的抗原可直接或间接参与疾病。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原与急性骨髓性白血病(AML)相关。在一些实施方案中，肿瘤抗原与慢性骨髓性白血病(CML)相关。在一些实施方案中，肿瘤抗原与骨髓增生异常综合征(MDS)相关。

肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的可引发免疫反应，尤其是T细胞介导的免疫反应的蛋白质。本发明的靶向抗原的选择将取决于待治疗癌症的特定类型。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所独有的，并且不存在于体内其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞所独有的，而是在不能诱导对所述抗原的免疫耐受状态的条件下还在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使免疫系统对抗原作出反应的条件下发生。TAA可以是在胎儿发育期间在免疫系统不成熟并且不能反应时在正常细胞上表达的抗原，或其可以是通常在正常细胞上以极低水平存在，但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。

TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，诸如MART-1/MelanA(MART-1)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2，以及肿瘤特异性多谱系抗原，诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过度表达的胚胎抗原，诸如CEA；过度表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，诸如p53、Ras、HER2/neu；因染色体易位产生的独特肿瘤抗原，诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，诸如EB病毒(Epstein Barrvirus)抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大型抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP以及TPS。

第二结合部分可具有任何合适的形式。在一些实施方案中，第二结合部分来源于抗体，诸如四链抗体，或单结构域抗体，诸如仅重链抗体。在一些实施方案中，第二结合部分是抗体片段，诸如Fab、Fv、scFv或V_HH。在一些实施方案中，第二结合部分是特异性结合选自由以下组成的组的抗原的抗体片段：NKG2D配体、CD33、WT1、CS1、CD123、叶酸受体β、FLT3R、B7H6、TIM3、MUC1、c-kit、CD44v6、Lewis-Y、CD99、CD27和CD70。

在一些实施方案中，第二结合部分是CD33结合结构域。在一些实施方案中，CD33结合结构域是抗CD33抗体的抗体片段(例如scFv或V_HH)。在一些实施方案中，CD33结合结构域是来源于hP67.6的scfv。在一些实施方案中，CD33结合结构域是抗CD33 sdAb。

CD33，也称为Siglec-3(结合唾液酸的Ig样凝集素3)、gp67或p67，是在骨髓谱系细胞上表达的跨膜受体。CD33是吉妥珠单抗(gemtuzumab)奥佐米星(ozogamicin)的靶标，是抗体-药物缀合物，其已经批准用于治疗患有急性骨髓性白血病的患者。

在一些实施方案中，第二结合部分是CD123结合结构域。在一些实施方案中，CD123结合结构域是抗CD123抗体的抗体片段(例如scFv或V_HH)。在一些实施方案中，CD123结合结构域是CD123的配体或IL-3结构域。在一些实施方案中，IL-3结构域来源于人IL-3，诸如人IL-3的全长或功能片段。

IL-3(白细胞介素-3)基因定位在染色体5上，所述基因编码长度为152个氨基酸的蛋白质。IL-3是能够支持大范围细胞活性(诸如细胞生长、分化和凋亡)的细胞因子。IL-13通过结合白细胞介素-3受体(IL-3R)(也称为CD123抗原)而起作用。IL-3R是异二聚体受体，其包含配体特异性α亚基以及IL-3、集落刺激因子2(CSF2/GM-CSF)和白细胞介素5(IL5)的受体所共享的信号转导β亚基。IL-3R的活化导致βc链的磷酸化、含有SH2的衔接分子(诸如Vav1)的募集以及通过Jak2/STAT5和Ras/MAPK途径进行的下游信号转导。

IL-3R是75kD糖蛋白，并且在被N-糖苷酶水解时变成43kD。IL-3R具有三个负责特异性结合IL-3的细胞外结构域、跨膜结构域以及对于细胞内信号传导必不可少的短细胞间结构域(Sato等人,1993)。IL-3R是对IL-3具有低亲和力和高特异性的异二聚体受体。在结合IL-3后，IL-3R被激活并且促进细胞增殖和存活(Liu等人,2015)。

CD123在AML母细胞(即成髓细胞)上过表达。75％至89％的AML患者中的AML母细胞和白血病干细胞(LSC)表达CD123。形成鲜明对比的是，正常造血干细胞(HSC)上存在CD123的低的或不可检测的表达(Frankel等人,2014；Jordan等人,2000)。除AML外，CD123还在多种血液系统恶性肿瘤中过表达，包括B细胞谱系急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、浆细胞样树突状细胞瘤和毛细胞白血病(Munoz等人,2001)。此表达谱使CD123成为所述疾病的临床诊断、预后和干预中的有价值生物标志物。目前，早期临床试验已展示，CD123靶向疗法是安全的并且对造血作用无严重副作用。CD123靶向疗法在人中的抗白血病活性仍在研究中。

在一些实施方案中，第二结合部分是配体，或受体的配体结合结构域，诸如受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，第二结合部分是来源于选自由以下组成的组的分子的配体或配体结合结构域：NKG2A、NKG2C、NKG2F、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80。在一些实施方案中，第二结合部分是NKG2D的细胞外结构域。在一些实施方案中，第二结合部分包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列。

SEQ ID NO:149NKG2D-L结合结构域

NKG2D是NKG2家族的独特成员，所述家族是刺激或抑制NK细胞的细胞毒性活性的C型凝集素受体。NKG2D是II型跨膜锚定糖蛋白，其主要在NK细胞和CD8⁺ T细胞(例如αβT细胞和γδT细胞)的表面上表达。其在多个物种中高度保守，其中在人与鼠受体之间具有70％序列同一性。不同于与CD94异二聚化并且结合I类非经典MHC糖蛋白的其他NKG2受体，NKG2D形成同二聚体并且结合细胞应激诱导型分子。越来越多的证据表明，NKG2D在针对应激或异常细胞(诸如自体肿瘤细胞和感染病毒的细胞)的免疫监视中起至关重要的作用。

已在人中鉴定出多种NKG2D配体，其包括由MHC家族中的基因编码的MIC分子(MHCI类链相关蛋白A和B，或MICA和MICB)，以及簇集在人染色体6上的ULBP分子(UL16结合蛋白，也称为RAET1蛋白)(Bahram等人,2005)。所有NKG2D配体均与MHC I类分子同源，并且表现出相当大的等位基因变化。尽管NKG2D配体RNA在身体所有组织和器官中广泛表达，但正常成人细胞的表面通常不存在NKG2D配体(Le Bert和Gasser,2014)。然而，NKG2D配体的表达主要在上皮来源的组织中响应于细胞应激(包括热休克、DNA损伤和停滞的DNA复制)而被诱导或上调。细胞上NKG2D配体的存在标志着所述细胞进行NK细胞靶向和潜在消除(Le Bert和Gasser,2014)。有趣的是，多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中转化细胞的DNA修复途径的高活性引起NKG2D配体的表达，从而使这些细胞易于进行NK介导的裂解(Sentman等人,2006)。

NKG2D由KLRK1基因编码。NKG2D是跨膜受体蛋白，其包含三个结构域：细胞质结构域(人NKG2D的残基1-51)、跨膜结构域(人NKG2D的残基52-72)和细胞外结构域(人NKG2D的残基73-216)。NKG2D的细胞外结构域含有C型凝集素结构域(人NKG2D的残基98-213)。

跨膜结构域

本申请的嵌合受体包含可以直接或间接与细胞外结构域融合的跨膜结构域。跨膜结构域可来源于天然来源或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜，优选真核细胞膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所述的嵌合受体的跨膜结构域可获自天然存在的蛋白质。可替代地，其可以是非天然存在的合成蛋白质区段，例如在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。

基于跨膜结构域的三维结构对跨膜结构域进行分类。例如，跨膜结构域可形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨越细胞的磷脂双层的任何其他稳定结构。此外，还可或可替代地基于跨膜结构域拓扑结构对跨膜结构域进行分类，所述拓扑结构包括跨膜结构域跨膜的穿过次数和蛋白质的取向。例如，单次穿膜蛋白跨越细胞膜一次，而多次穿膜蛋白跨越细胞膜至少两次(例如2、3、4、5、6、7次或更多次)。膜蛋白可取决于其末端和穿膜区段相对于细胞内部和外部的拓扑结构定义为I型、II型或III型。I型膜蛋白具有单一跨膜区，并且被定向成使得蛋白质的N端存在于细胞脂质双层的细胞外侧，并且蛋白质的C端存在于细胞质侧。II型膜蛋白还具有单一跨膜区，但被定向成使得蛋白质的C端存在于细胞脂质双层的细胞外侧，并且蛋白质的N端存在于细胞质侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，并且可基于跨膜区段的数量以及N端和C端的位置进一步细分。

在一些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域来源于I型单次穿膜蛋白。在一些实施方案中，来自多次穿膜蛋白的跨膜结构域还可适用于本文所述的CAR。多次穿膜蛋白可包含复合(至少2、3、4、5、6、7个或更多个)α螺旋或β折叠结构。优选地，多次穿膜蛋白的N端和C端存在于脂质双层的相对侧，例如蛋白质的N端存在于脂质双层的细胞质侧，并且蛋白质的C端存在于细胞外侧。

在一些实施方案中，嵌合受体的跨膜结构域包括选自以下的α、β或ξ链的跨膜结构域的跨膜结构域：T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CLL1、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(4-1BB)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD1。

在一些实施方案中，跨膜结构域来源于CD8。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD8α的跨膜结构域，其包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:133)的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于CD28。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD28的跨膜结构域，其包含FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:134)的氨基酸序列。

用于本文所述的嵌合受体的跨膜结构域还可包含非天然存在的合成蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是非天然存在的合成α螺旋或β折叠。在一些实施方案中，蛋白质区段是至少约20个氨基酸，例如至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸。合成跨膜结构域的实例是本领域中，例如在美国专利7,052,906B1和PCT公布WO 2000/032776 A2中已知的，其相关公开内容以引用的方式并入本文中。

跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域C端侧的细胞质区。跨膜结构域的细胞质区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，有助于使脂质双层中的跨膜结构域定向。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的细胞质区中。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区包含带正电的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。

在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，嵌合受体的跨膜结构域包含人工疏水性序列。例如，在跨膜结构域的C端可存在苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区是疏水性的。在一些实施方案中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的喜水性或疏水性或亲水性特征可通过本领域已知的任何方法评估，例如Kyte和Doolittle喜水性分析。

细胞内信号传导结构域

本申请的嵌合受体包含细胞内信号传导结构域。嵌合受体系统中单一嵌合受体的细胞内信号传导结构域或两种嵌合受体的细胞内信号传导结构域负责激活表达嵌合受体的免疫效应细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的专门功能。T细胞的效应功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞质信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应功能信号并且引导细胞执行专门功能。尽管通常可以使用完整细胞质信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用完整链。在使用细胞质信号传导结构域的截短部分的情况下，只要所述截短部分转导效应功能信号，其即可用于替代完整链。因此，术语细胞质信号传导结构域意在包括细胞质信号传导结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，嵌合受体包含基本上由免疫效应细胞的主要细胞内信号传导序列组成的细胞内信号传导结构域。“主要细胞内信号传导序列”是指以刺激方式起作用以诱导免疫效应功能的细胞质信号传导序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。如本文所用，“ITAM”是保守蛋白质基序，其通常存在于在许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部。所述基序可包含由6-8个氨基酸分隔的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中各x独立地为任何氨基酸，从而产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导很重要，所述信号转导至少部分地由信号传导分子活化后ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM还可用作信号传导途径中涉及的其他蛋白质的对接位点。示例性的含有ITAM的主要细胞质信号传导序列包括来源于CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ，即主要细胞内信号传导序列是CD3ζ细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由CD3ζ的细胞质信号传导结构域组成。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列是野生型CD3ζ的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列是CD3ζ的细胞质信号传导结构域的功能突变体，其含有一个或多个突变，诸如Q65K。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导序列包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列。

SEQ ID NO:135CD3ζ细胞内信号传导序列

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域由细胞内共刺激序列组成。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域不包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列和细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域不包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含有包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域，并且第二嵌合受体包含有包含细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一嵌合受体包含有包含细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域，并且第二嵌合受体包含有包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。

除刺激抗原特异性信号外，许多免疫效应细胞还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活，以及激活细胞的效应功能。在一些实施方案中，嵌合受体包含至少一个细胞内共刺激序列。如本文所用，术语“细胞内共刺激序列”是指蛋白质中介导细胞内的信号转导以诱导免疫反应(诸如效应功能)的至少一部分。本文所述的嵌合受体的细胞内共刺激序列可以是来自共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，其转导信号并且调节由免疫细胞(诸如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)介导的反应。“细胞内共刺激序列”可以是共刺激分子的细胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(诸如T细胞)上特异性结合共刺激配体，从而由免疫细胞介导共刺激反应(诸如但不限于增殖和存活)的同源结合配偶体。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含单一细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个(诸如约2、3、4个或更多个中的任一者)细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的细胞内共刺激序列，例如CD28的细胞内共刺激序列的两个拷贝。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白(诸如任何两种或更多种本文所述的共刺激蛋白)的两个或更多个细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含主要细胞内信号传导序列(诸如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)和一个或多个细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，一个或多个细胞内共刺激序列和主要细胞内信号传导序列(诸如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)通过任选的肽接头彼此融合。主要细胞内信号传导序列和一个或多个细胞内共刺激序列可以任何合适的顺序排列。在一些实施方案中，一个或多个细胞内共刺激序列位于跨膜结构域与主要细胞内信号传导序列(诸如CD3ζ的细胞质信号传导结构域)之间。多个细胞内共刺激序列可提供相加或协同刺激作用。

宿主细胞(例如免疫细胞)中细胞内共刺激序列的活化可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、细胞吞噬特性、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的细胞内共刺激序列可适用于本文所述的嵌合受体中。基于诸如将表达效应分子的免疫效应细胞的类型(例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和期望免疫效应功能(例如ADCC作用)的因素选择细胞内共刺激序列的类型。用于嵌合受体的细胞内共刺激序列的实例可以是如下共刺激蛋白的细胞质信号传导结构域，其包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如，4-1BB/TNFSF9/4-1BB、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFFR/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其他共刺激分子，诸如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。

在一些实施方案中，一个或多个细胞内共刺激序列选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及特别地结合CD83的配体。

在一些实施方案中，本申请的嵌合受体中的细胞内信号传导结构域包含来源于CD28的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域和CD28的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD28的细胞内共刺激序列，所述序列包含RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本申请的CAR中的细胞内信号传导结构域包含来源于4-1BB(即CD137)的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域和4-1BB的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的细胞内共刺激序列，所述序列包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:137)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本申请的CAR中的细胞内信号传导结构域包含来源于ICOS的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域和ICOS的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含ICOS的细胞内共刺激序列，所述序列包含CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQID NO:138)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本申请的CAR中的细胞内信号传导结构域包含CD28的细胞内共刺激序列和4-1BB的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域、CD28的细胞内共刺激序列和4-1BB的细胞内共刺激序列。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含有包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含有包含CD28的细胞内共刺激序列的多肽。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含有包含4-1BB的细胞内共刺激序列的多肽。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含从N端至C端包含以下的多肽：4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ的细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含从N端至C端包含以下的多肽：CD28的细胞内共刺激序列、4-1BB的细胞内共刺激序列以及CD3ζ的细胞质信号传导结构域。

本公开范围内还包括本文所述的任何细胞内共刺激序列的变体，使得细胞内共刺激序列能够调节免疫细胞的免疫反应。在一些实施方案中，与野生型对应物相比，细胞内共刺激序列包含最多10个氨基酸残基变化(例如1、2、3、4、5或8个)。包含一个或多个氨基酸变化的此类细胞内共刺激序列可称为变体。相对于不包含突变的细胞内共刺激序列，细胞内共刺激序列的氨基酸残基的突变可导致增加的信号转导和提高的免疫反应刺激。相对于不包含突变的细胞内共刺激序列，细胞内共刺激序列的氨基酸残基的突变可导致减少的信号转导和降低的免疫反应刺激。

铰链区

本申请的嵌合受体可包含位于细胞外结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是如下氨基酸区段，其通常存在于蛋白质的两个结构域之间，并且可使蛋白质具有柔性并且使所述结构域中的一者或两者相对于彼此移动。可使用提供细胞外结构域相对于效应分子的跨膜结构域的这种柔性和移动的任何氨基酸序列。

铰链结构域可含有约10-100个氨基酸，例如约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，铰链结构域的长度可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸中的任一者。

在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在蛋白质的铰链结构域。本领域中已知包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域均适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在蛋白质的铰链结构域的至少一部分，并且赋予嵌合受体柔性。在一些实施方案中，铰链结构域来源于CD8，诸如CD8α。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如含有CD8α的铰链结构域的至少15(例如20、25、30、35或40)个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，CD8α的铰链结构域包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:139)的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域来源于CD28。在一些实施方案中，CD28的铰链结构域包含IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:140)的氨基酸序列。

抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域还适用于本文所述的嵌合受体系统。在一些实施方案中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是抗体的铰链结构域，并且包含抗体的铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，绞链区包含IgG1抗体的绞链区以及CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，绞链区包含IgG1抗体的绞链区和CH3恒定区。

非天然存在的肽还可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施方案中，Fc受体的细胞外配体结合结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域是肽接头，诸如(GxS)n接头，其中x和n可以独立地为3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。在一些实施方案中，肽接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:141)的氨基酸序列。

信号肽

本申请的嵌合受体可在多肽的N端包含信号肽(也称为信号序列)。通常，信号肽是使多肽靶向细胞中的期望位点的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使效应分子靶向细胞的分泌途径，并且将允许效应分子整合并且锚定到脂质双层中。包括天然存在蛋白质的信号序列或非天然存在的合成信号序列的信号肽可适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施方案中，信号肽来源于选自由CD8、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽来源于CD8，诸如CD8α。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列。

C.免疫效应细胞衔接子

本申请的一个方面提供一种免疫效应细胞衔接子，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的靶细胞结合结构域，以及(b)包含特异性结合免疫效应细胞上的抗原的抗原结合片段的免疫效应细胞结合结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ IDNO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ IDNO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域中的抗原结合片段是Fab、scFv或sdAb。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与免疫效应细胞结合结构域的N端融合。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与免疫效应细胞结合结构域的C端融合。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与免疫效应细胞结合结构域通过肽接头融合。在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。

在一些实施方案中，提供一种T细胞衔接子，其包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1sdAb中的任一者)的靶细胞结合结构域，以及(b)包含特异性结合T细胞上的抗原的抗原结合片段的T细胞结合结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，T细胞结合结构域中的抗原结合片段是Fab、scFv或sdAb。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与T细胞结合结构域的N端融合。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与T细胞结合结构域的C端融合。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与T细胞结合结构域通过肽接头融合。在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域包含特异性结合CD3(诸如CD3ε)的抗原结合片段。

靶细胞结合结构域

本文所述的免疫效应细胞衔接子包含有包含抗CLL1 sdAb的靶细胞结合结构域。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域由抗CLL1 sdAb组成。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域包含抗CLL1 sdAb和来源于特异性结合靶细胞上的抗原的单结构域抗体或四链抗体的一个或多个抗原结合片段。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞或骨髓细胞。

在一些实施方案中，靶细胞结合结构域具有两个或更多个(诸如约2、3、4、5、6个或更多个中的任一者)抗原结合片段，诸如单结构域抗体。在一些实施方案中，多价靶细胞结合结构域仅靶向CLL1，并且包含针对CLL1的两个或更多个抗原结合片段。在一些实施方案中，多价靶细胞结合结构域靶向多于一种抗原，并且多价靶细胞结合结构域包含针对至少一种抗原的两个或更多个抗原结合片段。对相同抗原具有特异性的抗原结合片段可结合抗原的相同表位或结合抗原的不同表位。对相同抗原具有特异性的抗原结合片段可包含相同或不同的单结构域抗体。

在一些实施方案中，靶细胞结合结构域包含多个抗CLL1 sdAb。在一些实施方案中，多个抗CLL1 sdAb通过肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，各肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35、25、20、15、10或5个中的任一者)氨基酸。

在一些实施方案中，靶细胞结合结构域可特异性结合两种或更多种(诸如约2、3、4、5、6种或更多种中的任一者)不同抗原。在一些实施方案中，多特异性靶细胞结合结构域具有针对各抗原的一个抗原结合片段。在一些实施方案中，多特异性靶细胞结合结构域具有针对至少一种抗原的多于两个抗原结合片段。各抗原结合片段可包含单结构域抗体。

取决于待靶向的期望抗原，可将靶细胞结合结构域工程改造以包括对期望抗原具有特异性的适当的单结构域抗体。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域包含抗CLL1 sdAb和抗CD33 sdAb。抗原结合片段(诸如sdAb)可以任何合适的顺序排列。例如，使第一sdAb与第二sdAb的N端或C端融合。可将合适的肽接头置于不同的sdAb之间以避免sdAb之间的位阻。

免疫效应细胞结合结构域

本文所述的免疫效应细胞衔接子包含免疫效应细胞结合结构域。免疫效应细胞结合结构域包含特异性结合免疫效应细胞上的抗原的抗原结合片段。免疫效应细胞包括但不限于T细胞和NK细胞。

在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域特异性结合CD3，诸如人CD3。“CD3”在本领域中称为六链多蛋白复合物(参见Abbas和Lichtman,2003；Janeway等人,第172页和第178页,1999)。在哺乳动物中，复合物包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链以及CD3ζ链的同二聚体。如本文所用的CD3可来自各种动物物种，包括人、灵长类动物、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域包含特异性结合个别CD3链(诸如CD3γ链、CD3δ链或CD3ε链)的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段特异性结合由两条或更多条个别CD3链形成的复合物(例如，多于一条CD3ε链的复合物、CD3γ和CD3ε链的复合物、CD3δ和CD3ε链的复合物)。在一些实施方案中，抗原结合片段特异性结合CD3ε链。

靶向CD3的抗原结合片段可以是任何合适的抗原结合片段，其包括但不限于Fab、scFv和sdAb(例如V_HH)。在一些实施方案中，抗原结合片段是鼠、骆驼科、嵌合、人或人源化的。可基于本领域中的任何已知CD3抗体设计抗原结合片段，所述CD3抗体包括但不限于SP34小鼠单克隆抗体(参见，例如Pressano,S.The EMBO J.4:337-344,1985；Alarcon,B.EMBO J.10:903-912,1991；Salmeron A.等人,J.Immunol.147:3047-52,1991；YoshinoN.等人,Exp.Anim 49:97-110,2000；Conrad M L.等人,Cytometry 71A:925-33,2007；以及Yang等人,J.Immunol.137:1097-1100:1986)、Cris-7单克隆抗体(Reinherz,E.L.等人(编),Leukocyte typing II,Springer Verlag,New York,(1986))、BC3单克隆抗体(Anasetti等人(1990)J.Exp.Med.172:1691)、OKT3(Ortho multicenter TransplantStudy Group(1985)N.Engl.J.Med.313:337)以及其衍生物(诸如OKT3ala-ala(Herold等人(2003)J.Clin.Invest.11:409))、维西珠单抗(visilizumab)(Carpenter等人(2002)Blood99:2712)、145-2C11单克隆抗体(Hirsch等人(1988)J.Immunol.140:3766)、UCHT-1(Beverley,P C和Callard,R.E.(1981)Eur.J.Immunol.11:329-334)、WO2016180982中所述的抗CD3 sdAb(诸如60E11和117G03)以及WO2004/106380；WO2004/106381；WO2010/037838；WO2008/119567；WO2007/042261；WO2010/0150918中所述的CD3结合分子；各参考文献的内容以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，抗CD3抗原结合片段来源于OKT3、L2K、UCHT1、60E11或117G03。在一些实施方案中，抗CD3抗原结合片段是来源于OKT3、L2K或UCHT的scFv。在一些实施方案中，抗CD3抗原结合片段是来源于60E11或117G03的V_HH。在一些实施方案中，抗CD3抗原结合片段来源于与OKT3、L2K、UCHT1、60E11或117G03结合相同表位的抗体。在一些实施方案中，抗CD3抗原结合片段来源于与OKT3、L2K、UCHT1、60E11或117G03竞争性地特异性结合CD3的抗体。

信号肽

本申请的免疫效应细胞衔接子可在多肽的N端包含信号肽(也称为信号序列)。通常，信号肽是使多肽靶向细胞中的期望位点的肽序列。在一些实施方案中，信号肽使免疫效应细胞衔接子靶向细胞的分泌途径，并且将允许免疫效应细胞衔接子分泌到细胞培养基中。包括天然存在蛋白质的信号序列或非天然存在的合成信号序列的信号肽。在一些实施方案中，信号肽来源于人白蛋白信号肽。在一些实施方案中，信号肽来源于人天青杀素(azurocidin)分泌信号。

肽接头

靶细胞结合结构域和免疫效应细胞结合结构域可通过肽接头彼此融合。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域和免疫效应细胞结合结构域可在没有任何肽接头的情况下直接彼此融合。

在一些实施方案中，多特异性或多价靶细胞结合结构域中的各种抗原结合片段(诸如sdAb)通过肽接头彼此融合。在一些实施方案中，抗原结合片段(诸如sdAb)在没有任何肽接头的情况下直接彼此融合。连接不同抗原结合片段(诸如sdAb)的肽接头可以是相同或不同的。

免疫效应细胞衔接子中的各肽接头可取决于抗原结合片段(诸如sdAb)和/或各种结构域的结构和/或功能特征而具有相同或不同的长度和/或序列。可独立地选择并且优化各肽接头。免疫效应细胞衔接子中使用的肽接头的长度、柔性程度和/或其他特性可对包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力的特性具有一些影响。例如，可选择较长的肽接头以确保两个相邻结构域在空间上不互相干扰。例如，在包含针对多聚体抗原的sdAb的多价或多特异性靶细胞结合结构域中，肽接头的长度和柔性优选地使得其允许各抗原结合片段(诸如sdAb)结合多聚体各亚基上的抗原决定簇。

在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如，(GGGGS)₃接头(SEQ ID NO:141)可以是靶细胞结合结构域与免疫效应细胞结合结构域之间的合适的肽接头。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35、25、20、15、10或5个中的任一者)氨基酸。

肽接头可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸或约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任一者。

肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，来源于仅重链抗体的铰链区的序列可用作接头。参见，例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)_n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)_n、(GSGGS)_n、(GGGS)_n和(GGGGS)_n，其中n是至少一个整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其他柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:143)、(GGGGS)₂(SEQ ID NO:144)、(GGGGS)₃(SEQ ID NO:141)、(GGGGS)₄(SEQ ID NO:182)、(GGGGS)₅(SEQ ID NO:183)、(GGGS)₂(SEQ ID NO:145)、(GGGS)₄(SEQ IDNO:146)或GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:147)。

D.免疫缀合物

在一个方面，本申请提供免疫缀合物，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和效应分子。示例性效应分子包括但不限于药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽、核酸和标记。

在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂(诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合的抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)。

在一些实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗CLL1 sdAb与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于美登醇(maytansinoid)(参见美国专利5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235B1)；奥瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；尾海兔素(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；以及Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环，诸如道诺霉素(daunomycin)或阿霉素(doxorubicin)(参见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷，诸如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、替塞他赛(tesetaxel)和奥他他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)；以及CC1065。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含与如下酶促活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗CLL1 sdAb，其包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素(modeccin)A链、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、泻果素(麻疯树毒蛋白，curcin)、巴豆毒素、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯。

在一些实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文所述的抗CLL1sdAb。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当将放射性缀合物用于检测时，其可包含用于闪烁显像研究的放射性原子(例如tc99m或I123)，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，“MRI”)的自旋标记(诸如碘123、碘131、铟111、氟19、碳13、氮15、氧17、钆、锰或铁)。

可使用如下多种双功能蛋白偶合剂来制备抗体与细胞毒性剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(诸如己二亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(诸如双(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是有利于释放细胞中的细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利5,208,020)。

本文的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用如下交联剂制备的此类缀合物，其包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC以及磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，所述交联剂可商购获得(例如来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

在一些实施方案中，本文提供的抗CLL1 sdAb中的任一者可用于检测生物样品中CLL1的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是生物来源的血液、血清或其他液体样品。在一些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。

在一些实施方案中，本申请提供一种免疫缀合物，其包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和标记。在一些实施方案中，标记与抗CLL1 sdAb缀合。在一些实施方案中，提供一种检测细胞中的CLL1的方法，其包括使细胞与免疫缀合物接触。在一些实施方案中，提供一种检测生物样品中CLL1的存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括检测生物样品中CLL1蛋白的存在。在一些实施方案中，CLL1是人CLL1。在一些实施方案中，所述方法包括在允许抗CLL1 sdAb与CLL1结合的条件下使生物样品与免疫缀合物接触，以及检测来自标记的信号。所述方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，提供一种诊断个体的与CLL1表达相关的疾病(例如急性骨髓性白血病)的方法，其包括向个体施用免疫缀合物以及检测个体中的标记。在一些实施方案中，使用免疫缀合物来选择适合用本文所述的任何抗CLL1治疗剂(例如抗CLL1 sdAb、嵌合受体、免疫效应细胞衔接子和工程改造的免疫细胞)治疗的受试者，其中CLL1是用于选择患者的生物标志物。

在一些实施方案中，提供标记的抗CLL1 sdAb。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子密集标记、化学发光标记和放射性标记)，以及间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分，诸如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I；荧光团(诸如稀土螯合物)或荧光素(fluorescein)及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹磺酰基；伞形酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利4,737,456)；萤光素(luciferin)；2,3-二氢酞嗪二酮；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与使用过氧化氢氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋标记；噬菌体标记；稳定游离自由基等。

E.抗体部分的特征

在一些实施方案中，本文所述的抗CLL1构建体中的任何抗体部分可单独或以组合形式并入如以下部分1-7中所述的任何特征。

1.抗体亲和力

在一些实施方案中，本文提供的抗体部分的解离常数(Kd)是≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

在一些实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量Kd，所述放射性标记的抗原结合测定用以下测定所述的目标抗体的Fab型式或V_HH片段以及其抗原进行。例如，通过以下方法测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下，以最小浓度的(¹²⁵I)标记抗原平衡Fab，随后用涂有抗Fab抗体的板捕获结合的抗原(参见，例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。

在一些实施方案中，在25℃下，以约10个反应单位(RU)的固定抗原CM5晶片使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，使用表面等离子体共振测定来测量Kd。简单地说，根据供应商的说明，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/min的流速注射，以实现大约10个反应单位(RU)的偶合蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为进行动力学测量，在25℃下以大约25μl/min的流速将目标抗体的Fab或V_HH的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射在含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单一对一朗格缪尔结合模型(Langmuir binding model)(评价软件版本3.2)计算缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)。作为比率k_off/k_on计算平衡解离常数(Kd)。参见，例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定测得的缔合速率超过10⁶M^-1 s^-1，那么可通过使用荧光淬灭技术来确定缔合速率，所述技术测量在25℃下，在增加浓度的抗原存在下，含20nM抗抗原抗体部分的PBS(pH 7.2)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪(诸如配备有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的。

2.抗体片段

在一些实施方案中，本文提供的抗体部分是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv和scFv片段(V_HH)以及下述其他片段。关于特定抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，参见美国专利5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中。

抗体片段可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于如本文所述的蛋白水解消化完整抗体以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。

3.嵌合和人源化抗体

在一些实施方案中，本文提供的抗体部分是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利4,816,567；以及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于骆驼科物种(诸如美洲驼)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法例如综述于Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步描述于以下中，例如：Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“指导选择”方法)。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人生殖系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

在一些实施方案中，对sdAb进行修饰(诸如人源化)，而不降低所述结构域对抗原的天然亲和力，并且同时降低其对异源物种的免疫原性。例如，可确定美洲驼抗体的抗体可变结构域(V_HH)的氨基酸残基，并且将例如框架区中的一个或多个骆驼科氨基酸用人共有序列中发现的其人对应物置换，不使所述多肽丧失其典型特征，即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科sdAb的人源化需要在单一多肽链中引入并且诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化形成对比，后者需要在两条链(轻链和重链)中引入氨基酸变化，并且保留两条链的装配。

可将包含V_HH结构域的单结构域抗体人源化以具有人样序列。在一些实施方案中，本文所用的V_HH结构域的FR区与人V_H框架区具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大氨基酸序列同源性中的任一者。一种示例性类别的人源化V_HH结构域的特征在于，根据Kabat编号，V_HH在位置45(诸如L45)处携带来自由以下组成的组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，并且在位置103处携带色氨酸。因此，属于此类别的多肽显示出与人V_H框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述多肽可直接施用给人而预期不由此产生不想要的免疫反应，并且没有进一步人源化的负担。

另一种示例性类别的人源化骆驼科sdAb已在WO 03/035694中有所描述并且含有通常在人来源或来自其他物种的常规抗体中发现的疏水性FR2残基，但通过位置103上的带电精氨酸残基补偿此亲水性损失，所述带电精氨酸残基取代来自双链抗体的V_H中存在的保守色氨酸残基。因此，属于这两种类别的肽显示出与人V_H框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述肽可直接施用给人而预期不由此产生不想要的免疫反应，并且没有进一步人源化的负担。

4.人抗体

在一些实施方案中，本文提供的抗体部分是人抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术产生。人抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。能够产生完全人sdAb的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如US20090307787A1、美国专利8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。

人抗体可通过向已经修饰以响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利5,770,429；描述K-M技术的美国专利7,041,870和描述技术的美国专利申请公布US 2007/0061900。来自此类动物产生的完整抗体的人可变区可进一步修饰，例如通过与不同人恒定区组合。

人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有描述(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。另外的方法包括例如美国专利7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。

还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。随后可以将此类可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。用于从抗体文库选择人抗体的技术在下文描述。

用于获得针对特定抗原或靶标的V_HH序列的一种技术涉及使能够表达重链抗体的转基因哺乳动物适当免疫(即，以便增加针对所述抗原或靶标的免疫反应和/或重链抗体)，从含有所述V_HH序列(编码所述V_HH序列的核酸序列)的所述转基因哺乳动物中获得合适的生物样品(诸如血液样品、血清样品或B细胞样品)，并且随后由所述样品开始，使用本身已知的任何合适技术(诸如本文所述方法或杂交瘤技术中的任一者)产生针对所述抗原或靶标的V_HH序列。例如，出于此目的，可使用表达重链抗体的小鼠以及WO 02/085945、WO 04/049794和WO 06/008548以及Janssens等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41):15130-5中描述的另外的方法和技术。例如，此类表达重链抗体的小鼠可表达具有任何合适(单一)可变结构域的重链抗体，所述可变结构域诸如来自天然来源的(单一)可变结构域(例如人(单一)可变结构域、骆驼科(单一)可变结构域或鲨鱼(单一)可变结构域)以及例如合成或半合成(单一)可变结构域。

5.来源于文库的抗体

本申请的抗体部分可通过筛选组合文库中具有一种或多种期望活性的抗体来分离。例如，本领域中已知用于产生噬菌体展示文库并且筛选此类文库中具有期望结合特征的抗体的多种方法。此类方法综述于例如Hoogenboom等人,Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并且进一步描述于以下中，例如：McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。用于构建sdAb文库的方法已有描述，例如，参见美国专利7371849。

如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述，在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆V_H和V_L基因的库，并且在噬菌体文库中随机再组合，随后可筛选所述噬菌体文库中的抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述，在不经任何免疫的情况下克隆初始库(例如从人)以提供针对多种非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源。最后，还可如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，通过如下方法来合成制备初始文库：由干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并且在体外完成重排。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利5,750,373和美国专利公布2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

在本文中，从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在一些实施方案中，本文提供的抗体部分是多特异性抗体，例如双特异性抗体。可制备全长抗体或抗体片段形式的双特异性抗体。用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵臼(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利5,731,168)。多特异性抗体还可通过如下方法制备：工程改造静电操纵作用来制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利4,676,980和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体；以及产生包含串联单结构域抗体的多肽(参见例如美国专利申请20110028695；以及Conrath等人,J.Biol.Chem.,2001；276(10):7346-50)。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程改造的抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。

7.抗体变体

在一些实施方案中，涵盖本文提供的抗体部分的氨基酸序列变体。例如，可期望改善抗体部分的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体部分的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码抗体部分的核酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体部分的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有期望特征，例如抗原结合。

a)取代、插入和缺失变体

在一些实施方案中，提供具有一种或多种氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目标位点包括HVR和FR。保守取代示出于表7的“优选取代“标题下。更实质性变化提供于表7的“示例性取代”标题下，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可将氨基酸取代引入目标抗体中，并且筛选具有期望活性的产物，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表7.氨基酸取代

氨基酸可根据共同侧链特性分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代将需要把这些类别之一的成员交换为另一类别。

一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如增加的亲和力、降低的免疫原性)方面具有改变(例如改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可方便地产生，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，诸如本文所述的那些。简单来说，使一个或多个HVR残基突变，使变体抗体展示在噬菌体上并且针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。

可在HVR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。可在HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行此类改变，并且测试所得变体V_H或V_L的结合亲和力。通过构建并从二级文库再选择进行的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001).)中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一者将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。随后产生二级文库。随后筛选所述文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR残基(例如一次4-6个残基)进行随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基。通常尤其靶向CDR-H3和CDR-L3。

在一些实施方案中，可在一个或多个HVR内进行取代、插入或缺失，只要此类改变基本上不降低抗体部分结合抗原的能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。此类改变可在HVR“热点”或CDR外。在上文提供的变体V_HH序列的一些实施方案中，各HVR未改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。

如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，将用于鉴定可被靶向以进行诱变的抗体部分的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以确定抗体部分与抗原的相互作用是否受影响。可在对初始取代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入另外的取代。可替代地或另外，可确定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可被靶向或消除以作为取代的候选者。可筛选变体以确定其是否含有期望特性。

氨基酸序列插入包括在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括使抗体的N端或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽融合。

b)糖基化变体

在一些实施方案中，本文提供的抗体部分被改变以增加或减少抗体部分糖基化的程度。向抗体部分添加糖基化位点或使抗体部分缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以产生或移除一个或多个糖基化位点来方便地实现。

如果抗体部分包含Fc区，则与其连接的碳水化合物可改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支化双触角寡糖，其通常由N键连接于Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及连接于双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本申请的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善特性的抗体变体。

在一些实施方案中，提供具有以下碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺乏连接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖。例如，此种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过如例如WO 2008/077546中所述，如通过MALDI-TOF质谱所测量，计算糖链中Asn297处岩藻糖相对于连接于Asn 297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的平均量来确定。Asn297是指位于Fc区中约297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297还可位于297位上游或下游约±3个氨基酸，即在294位与300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公布US 2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。关于“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷型Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请US 2003/0157108A1,Presta,L；以及WO 2004/056312A1,Adams等人，尤其实施例11)，以及敲除细胞系，诸如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。

抗体变体还提供有二等分的寡糖，例如，其中连接于抗体Fc区的双触角寡糖由GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供了在寡糖中具有至少一个连接于Fc区的半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。

c)Fc区变体

在一些实施方案中，可将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在一些实施方案中，本申请涵盖一种抗体变体，其具有一些但并非全部效应功能，从而使其成为其中抗体的体内半衰期很重要，但某些效应功能(诸如补体和ADCC)是非必要或有害的应用的期望候选者。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低/清除。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于以下中：美国专利5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可使用非放射性测定法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CYTOTOX非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外，可在体内，例如在动物模型(诸如Clynes等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型)中评估目标分子的ADCC活性。还可进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期确定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

效应功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者被取代的那些(美国专利6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两者或更多者处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利7,332,581)。

具有改善或减少的FcR结合的某些抗体变体已有描述(参见例如美国专利6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。

在一些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，所述氨基酸取代改善ADCC，例如Fc区的298、333和/或334位(残基的EU编号)处的取代。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，从而产生改变(即改善或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。

具有增加的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中，所述新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc区残基434(美国专利7,371,826)。

关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；以及WO 94/29351。

d)半胱氨酸工程改造的抗体变体

在一些实施方案中，可期望产生半胱氨酸工程改造的抗体(例如“thioMAb”)，其中抗体部分的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基存在于抗体部分的可及位点处。如本文进一步描述，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而使反应性硫醇基定位在抗体部分的可及位点，并且所述反应性硫醇基可用于使抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。在一些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造的抗体可如例如美国专利7,521,541中所述产生。

e)抗体衍生物

在一些实施方案中，本文提供的抗体部分可进一步被修饰以含有本领域已知并且易于获得的另外的非蛋白性部分。适用于衍生抗体部分的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可在制造中具有优势。所述聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化或非支化的。连接于抗体部分的聚合物的数量可改变，并且如果连接超过一个聚合物，那么其可以是相同或不同分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素确定，包括但不限于待改善的抗体部分的特定特性或功能、抗体部分衍生物是否将在限定条件下用于疗法中等。

III.制备抗CLL1构建体的方法

如本文所述的抗CLL1构建体，包括抗CLL1 sdAb、免疫效应细胞衔接子和免疫缀合物的抗体部分，可使用本领域已知或如本文所述的任何方法制备。组合物和制备抗CLL1嵌合受体和嵌合受体系统的方法描述于部分IV中。

制备sdAb的方法已有描述。参见例如Els Pardon等人,Nature Protocol,2014；9(3):674。可使用本领域已知的方法获得单结构域抗体(诸如V_HH)，诸如通过使骆驼科物种(诸如骆驼或美洲驼)免疫并且由其获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆sdAb的文库，随后通过ELISA对未选文库的个别克隆进行选择或通过使用噬菌体展示进行选择。

为了重组产生sdAb，分离编码sdAb的核酸并且将其插入可复制载体中以进一步克隆(扩增DNA)或表达。编码sdAb的DNA可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并且测序。许多载体是可获得的。载体的选择部分取决于待使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)来源。

核酸和载体

提供了包含编码本文所述的抗CLL1构建体中的任一者的一条或多条链的多核苷酸的核酸分子。

在一些实施方案中，提供了一种分离核酸，其编码本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者。在一些实施方案中，提供了一种编码抗CLL1 sdAb的分离核酸，其中所述核酸包含与SEQ ID NO:107-119和174-176中的任一者的核酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的序列。在一些实施方案中，提供了一种分离核酸，其包含选自由SEQ ID NO:107-119和174-176组成的组的核酸序列。

可使用本领域常规的重组DNA技术构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适用于在所选宿主细胞中表达的表达载体。

提供了包含编码本文所述的抗CLL1构建体中的任一者的多核苷酸的载体。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体是表达载体。

宿主细胞

在一些实施方案中，抗CLL1构建体可在原核细胞(诸如细菌细胞)中；或在真核细胞(诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。这种表达可例如根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，其包括COS 7细胞；293细胞，其包括293-6E细胞；CHO细胞，其包括CHO-S、DG44.Lec13CHO细胞和FUT8CHO细胞；细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，抗CLL1构建体可在酵母中表达。参见例如美国公布US 2006/0270045A1。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞基于其对抗CLL1构建体进行期望的翻译后修饰的能力进行选择。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于293细胞中产生的相同多肽。

可通过任何方法完成将一种或多种核酸引入期望宿主细胞中，所述方法包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性的示例性方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。可根据任何合适的方法将核酸瞬时或稳定转染于期望宿主细胞中。

本发明还提供包含本文所述的多核苷酸或载体中的任一者的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供一种包含抗CLL1构建体的宿主细胞。能够过表达异源DNA的任何宿主细胞均可以用于分离编码目标抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还参见PCT公布WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))和酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。

表达和纯化

在一些实施方案中，提供了一种制备抗CLL1构建体的方法，其中所述方法包括在适用于表达抗CLL1构建体的条件下培养包含编码抗CLL1构建体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗CLL1构建体。

抗CLL1构建体可通过任何合适的方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用层析。合适的亲和配体包括ROR1ECD和结合抗体恒定区的配体。例如，可使用蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱来结合恒定区和纯化包含恒定区的抗CLL1构建体。疏水相互作用层析(例如丁基或苯基柱)也可适用于纯化一些多肽，诸如抗体。离子交换层析(例如阴离子交换层析和/或阳离子交换层析)也可适用于纯化一些多肽，诸如抗体。混合模式层析(例如，反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可适用于纯化一些多肽，诸如抗体。本领域已知纯化多肽的多种方法。

在一些实施方案中，在无细胞系统中产生抗CLL1构建体。非限制性的示例性无细胞系统描述于例如以下文献中：Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。

还提供了通过本文所述的方法中的任一者制备的抗CLL1构建体。在一些实施方案中，在宿主细胞中制备抗CLL1构建体。在一些实施方案中，在无细胞系统中制备抗CLL1构建体。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是纯化的。在一些实施方案中，本申请提供了一种包含抗CLL1构建体的细胞培养基。在一些实施方案中，本申请提供了一种包含抗CLL1构建体的宿主细胞培养液。

IV.工程改造的免疫细胞

本申请的一个方面提供了包含如本文所述的抗CLL1嵌合受体或嵌合受体系统中的任一者的宿主细胞(诸如免疫细胞)。

因此，在一些实施方案中，提供了一种包含抗CLL1嵌合受体的工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)，所述抗CLL1嵌合受体包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1sdAb中的任一者)的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。

在一些实施方案中，提供了一种包含抗CLL1嵌合受体的工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)，所述抗CLL1嵌合受体包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)包含CD3ζ细胞内信号传导序列和来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。

在一些实施方案中，提供了一种工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列和细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列和细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一嵌合受体和第二嵌合受体各自的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导序列和来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，第二结合部分是抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些实施方案中，第二结合部分是NKG2D的细胞外结构域。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。

在一些实施方案中，提供了一种工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，第二嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，第二结合部分是抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些实施方案中，第二结合部分是NKG2D的细胞外结构域。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。

在一些实施方案中，提供了一种工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)，其包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含有包含细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域的细胞内结构域；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，第二嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，第二结合部分是抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些实施方案中，第二结合部分是NKG2D的细胞外结构域。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。

在根据上述工程改造的免疫细胞中的任一者的一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ IDNO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ IDNO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，嵌合受体还包含位于细胞外结构域的C端与跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8铰链结构域)。在一些实施方案中，嵌合受体还包含信号肽(诸如CD8信号肽)。

工程改造的免疫细胞还可表达一种或多种治疗性蛋白和/或免疫调节剂，诸如免疫检查点抑制剂。参见例如国际专利申请PCT/CN2016/073489和PCT/CN2016/087855，所述申请以引用方式整体并入本文。

核酸和载体

在一些实施方案中，提供了一种分离核酸，其编码本文提供的抗CLL1嵌合受体或嵌合受体系统中的任一者。在一些实施方案中，提供了一种核酸，其包含编码第一嵌合受体的第一多核苷酸，所述第一嵌合受体包含：包含抗CLL1 sdAb的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及编码第二嵌合受体的第二多核苷酸，所述第二嵌合受体包含：包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一多核苷酸可操作地连接于第一启动子，并且第二多核苷酸可操作地连接于第二启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸连接于相同启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸通过编码自切割肽(诸如T2A、P2A或F2A)的第三多核苷酸彼此可操作地连接。在一些实施方案中，自切割肽是P2A。在一些实施方案中，自切割肽包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:148)的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离核酸是DNA。在一些实施方案中，分离核酸是RNA。

在一些实施方案中，本申请提供了用于克隆和表达本文所述的抗CLL1嵌合受体或嵌合受体系统中的任一者的载体。在一些实施方案中，载体适于在真核细胞(诸如哺乳动物细胞)中复制和整合。在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体以及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。

已开发多种基于病毒的系统用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体中并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可分离重组病毒，并且在体外或离体递送至工程改造的哺乳动物细胞。本领域已知多种逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。本领域已知多种腺病毒载体。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自失活慢病毒载体。例如，可用本领域已知的方案包装携带嵌合受体的自失活慢病毒载体。可使用本领域已知的方法，使用所得慢病毒载体转导哺乳动物细胞(诸如原代人T细胞)。来源于逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为所述载体使得转基因可长期稳定地整合并且其可在子代细胞中繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞。

在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在一些实施方案中，载体是转座子，诸如Sleeping Beauty(SB)转座子系统或PiggyBac转座子系统。在一些实施方案中，载体是基于聚合物的非病毒载体，其包括例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)和树枝状聚合物。在一些实施方案中，载体是基于阳离子脂质的非病毒载体，诸如阳离子脂质体、脂质纳米乳剂和固体脂质纳米粒子(SLN)。在一些实施方案中，载体是基于肽的基因非病毒载体，诸如聚-L-赖氨酸。适用于基因组编辑的任何已知非病毒载体均可用于将编码嵌合受体的核酸引入工程改造的免疫细胞中。参见例如Yin H.等人,NatureRev.Genetics(2014)15:521-555；Aronovich EL等人,“The Sleeping Beauty transposonsystem:a non-viral vector for gene therapy.”Hum.Mol.Genet.(2011)R1:R14-20；以及Zhao S.等人,“PiggyBac transposon vectors:the tools of the human geneediting.”Transl.Lung Cancer Res.(2016)5(1):120-125，所述参考文献以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，通过物理方法将编码嵌合受体或嵌合受体系统的核酸中的任何一者或多者引入工程改造的免疫细胞中，所述物理方法包括但不限于电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁转染、水穿孔。

在一些实施方案中，载体包含编码如本文所述的抗CLL1构建体的核酸中的任一者。可使用本领域任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，所述方法包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择性标志物。在一些实施方案中，核酸可操作地连接于启动子。已探索各种启动子在哺乳动物细胞中的基因表达，并且在本发明中可使用本领域已知的任何启动子。启动子可大致分为组成型启动子或调节型启动子，诸如诱导型启动子。

在一些实施方案中，编码嵌合受体的核酸可操作地连接于组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文涵盖的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶合的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。已在大量研究中广泛比较了此类组成型启动子驱动转基因表达的效率。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK在原代人T细胞中驱动嵌合受体表达的效率，并且得出结论，hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且最佳地维持在CD4和CD8人T细胞中(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施方案中，编码嵌合受体的核酸可操作地连接于hEF1α启动子。

在一些实施方案中，编码嵌合受体的核酸可操作地连接于诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子。诱导型启动子可通过一种或多种条件(诸如物理条件)、工程改造的免疫细胞的微环境或工程改造的免疫细胞的生理状态、诱导物(即诱导剂)或其组合进行诱导。在一些实施方案中，诱导条件不诱导工程改造的哺乳动物细胞中和/或接受药物组合物的受试者中内源基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、照射(诸如电离辐射、光)、温度(诸如热)、氧化还原状态、肿瘤环境以及工程改造的哺乳动物细胞的活化状态。

在一些实施方案中，载体还含有选择性标志基因或报告基因，以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达嵌合受体的细胞。选择性标志物和报告基因均可侧接适当的调节序列以使得其能够在宿主细胞中表达。例如，载体可含有转录和翻译终止子、起始序列以及用于调节核酸序列表达的启动子。

在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码嵌合受体的核酸。在一些实施方案中，载体包含如下核酸，其包含编码第一嵌合受体的第一核酸序列和编码第二嵌合受体的第二核酸序列，其中第一核酸通过编码自切割肽的第三核酸可操作地连接于第二核酸。在一些实施方案中，自切割肽选自由T2A、P2A和F2A组成的组。在一些实施方案中，自切割肽是P2A。在一些实施方案中，自切割肽包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列。在一些实施方案中，载体还包含编码安全性开关抗原或表位的核酸。在一些实施方案中，安全性开关抗原或表位来源于CD52、EGFR或CD20。

免疫细胞

在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞是免疫效应细胞。“免疫效应细胞”是可执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞表达至少FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，诸如细胞毒性T细胞和/或辅助性T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺/CD8^-、CD4^-/CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD4^-/CD8^-或其组合。在一些实施方案中，T细胞在表达CAR并且结合靶细胞(诸如CLL1⁺肿瘤细胞)后产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+ T细胞在表达CAR并且结合靶细胞后裂解抗原特异性靶细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是γδT细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。在其他实施方案中，免疫细胞可来源于所建立的细胞系，例如NK-92细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤T细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞由干细胞(诸如造血干细胞、多能干细胞、iPS或胚胎干细胞)分化。

通过将CAR引入免疫细胞(诸如T细胞)中来制备工程改造的免疫细胞。在一些实施方案中，通过转染部分III中所述的分离核酸中的任一者或载体中的任一者将CAR引入免疫细胞中。在一些实施方案中，通过将蛋白质插入细胞膜中，同时使细胞通过微流体系统(诸如CELL)来将CAR引入免疫细胞(参见例如美国专利申请公布20140287509)。

将载体或分离核酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域已知的。所描述的载体可通过物理、化学或生物学方法转移到免疫细胞中。

用于将载体引入免疫细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如Sambrook等人,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York。在一些实施方案中，通过电穿孔将载体引入细胞中。

用于将载体引入免疫细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物(例如人)细胞中最广泛使用的方法。

用于将载体引入免疫细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊)。

在一些实施方案中，可通过常规方法(例如体外转录)制备编码本文所述的嵌合受体或嵌合受体系统中的任一者的RNA分子，并且随后通过已知方法(诸如mRNA电穿孔)将其引入免疫细胞中。参见例如Rabinovich等人,Human Gene Therapy 17:1027-1035。

在一些实施方案中，在引入载体或分离核酸后，使转导或转染的免疫细胞离体繁殖。在一些实施方案中，对转导或转染的免疫细胞进行培养，以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一者。在一些实施方案中，进一步评价或筛选转导或转染的免疫细胞以选择工程改造的哺乳动物细胞。

报告基因可用于鉴定潜在转染细胞和评价调节序列的功能性。通常，报告基因是如下基因，其不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达，并且编码表达通过一些易于检测的特性(例如酶促活性)显现的多肽。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如Ui-Tei等人,FEBS Letters479:79-82(2000))。合适的表达系统是众所周知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。

证实工程改造的免疫细胞中编码嵌合受体或嵌合受体系统的核酸的存在的其他方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，诸如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；生物化学测定，诸如例如通过免疫学方法(诸如ELISA和Western印迹)检测特定肽的存在或不存在。

1.免疫细胞的来源

在免疫细胞扩增和遗传修饰之前，从个体获得免疫细胞(例如T细胞)的来源。免疫细胞(例如T细胞)可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些实施方案中，可使用本领域可获得的任何数量的免疫细胞(例如T细胞)系。在一些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(诸如FICOLL^TM分离)从自受试者收集的血液单位获得免疫细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，通过单采血液分离术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液分离术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白血细胞、红血细胞和血小板。在一些实施方案中，可洗涤通过单采血液分离术收集的细胞以移除血浆级分并且将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙并且可缺乏镁或可缺乏多种(如果并非全部)二价阳离子。再次令人惊讶地，在钙不存在情况下的初始活化步骤产生放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，诸如通过使用半自动化“流通式”离心机(例如Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根据制造商的说明完成。在洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，诸如无Ca²⁺无Mg²⁺的PBS、PlasmaLyte A或具有或不具有缓冲液的其他盐水溶液。可替代地，可移除单采血液分离术样品的非期望组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方案中，例如借助于通过PERCOLL^TM梯度的离心或通过逆流离心淘析(counterflow centrifugal elutriation)来溶解红细胞并且清除单核细胞，从而从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可通过正或负选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，诸如CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和CD45RO⁺ T细胞。例如，在一些实施方案中，T细胞通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠粒(诸如M-450CD3/CD28 T)一起孵育足以正选择期望T细胞的时间段来分离。在一些实施方案中，时间段是约30分钟。在另一个实施方案中，时间段在30分钟至36小时或更长时间以及其间所有整数值的范围内。在另一个实施方案中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施方案中，时间段是10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(诸如24小时)可提高细胞产量。在与其他细胞类型相比存在较少T细胞的任何情形下，诸如在从肿瘤组织或从免疫受损个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)时，可使用更长的孵育时间分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可提高捕获CD8⁺ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞结合CD3/CD28珠粒的时间和/或通过提高或降低珠粒与T细胞的比率(如本文进一步描述)，在培养起始时或在所述过程中的其他时间点可优先选择或不选择T细胞的亚群。另外，通过增加或减少珠粒或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，在培养起始时或在其他期望时间点可优先选择或不选择T细胞的亚群。熟练技术人员将认识到还可使用多轮选择。在一些实施方案中，可期望执行选择程序并且在活化和扩增过程中使用“未选择”的细胞。“未选择”的细胞还可进行其他轮次的选择。

通过负选择富集免疫细胞(例如T细胞)群可用针对阴性选择细胞独有的表面标志物的抗体的组合完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述方法使用针对负选择细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为通过负选择富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可期望富集或正选择通常表达CD4⁺、CD25⁺、CD62Lhi、GITR⁺和FoxP3⁺的调节型T细胞。可替代地，在某些实施方案中，通过抗C25缀合的珠粒或其他类似的选择方法来清除T调节型细胞。

为了通过正选择或负选择分离期望细胞群，可改变细胞和表面(例如粒子，诸如珠粒)的浓度。在某些实施方案中，可期望显著减小珠粒与细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞与珠粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/毫升的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/毫升的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/毫升。在另一个实施方案中，使用0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5亿个细胞/毫升的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1亿个细胞/毫升的细胞浓度。在另外的实施方案中，可使用1.25或1.5亿个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度使得可更有效地捕获可弱表达目标靶抗原的细胞(诸如CD28^-阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且将期望获得。例如，使用高浓度细胞使得可更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8⁺ T细胞。

在一些实施方案中，可期望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如粒子，诸如珠粒)的混合物，使粒子与细胞之间的相互作用最小化。这可选择表达大量待与粒子结合的期望抗原的细胞。例如，在稀浓度下，与CD8⁺ T细胞相比，CD4⁺ T细胞表达更高水平的CD28，并且更有效地被捕获。在一些实施方案中，所用细胞浓度是5×10⁶个/毫升。在一些实施方案中，所用浓度可以是约1×10⁵个/毫升至1×10⁶个/毫升以及其间的任何整数值。

在一些实施方案中，可使细胞在2-10℃下或在室温下在旋转器上以不同速度孵育不同时间长度。

还可在洗涤步骤后冷冻用于刺激的免疫细胞(例如T细胞)。不受理论的束缚，冷冻和后续解冻步骤通过移除细胞群中的粒细胞和在某种程度上移除单核细胞而提供更均匀的产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞悬浮于冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且将可用于本发明的上下文中，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，随后使细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并且储存在液氮储罐的气相中。除了在-20℃下或在液氮中立即进行不受控冷冻之外，还可使用其他受控冷冻方法。

在一些实施方案中，如本文所述将冻存的细胞解冻并且洗涤，并且在活化之前使其在室温下静置一小时。

本申请中还涵盖在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者中收集血液样品或单采血液分离术产物。因此，可在任何必需时间点收集待扩增细胞的来源，并且将期望细胞(诸如T细胞)分离并且冷冻以供后期用于任何数量的将受益于免疫疗法的疾病或病状(诸如本文所述的那些疾病或病状)的免疫疗法中。在一个实施方案中，血液样品或单采血液分离术样品是从一般健康受试者获得的。在某些实施方案中，血液样品或单采血液分离术样品是从具有发展疾病的风险，但尚未发展疾病的一般健康受试者获得的，并且将目标细胞分离并冷冻以供后期使用。在某些实施方案中，可将免疫细胞(例如T细胞)扩增、冷冻并且在后续时间使用。在某些实施方案中，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者中收集样品。在一些实施方案中，分离患者的细胞并且冷冻以供后期结合骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂(诸如氟达拉滨(fludarabine))的T细胞消融疗法、外束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)(例如在其之前、同时或之后)使用。在另一个实施方案中，将细胞在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的药剂，例如Rituxan)后的治疗之前分离，并且可冷冻以供后期用于所述治疗。

在一些实施方案中，在治疗后直接从患者获得免疫细胞(例如T细胞)。在这方面，已观察到，在某些癌症治疗，尤其是用损伤免疫系统的药物治疗之后，在治疗后不久在患者通常将从治疗中恢复的时间段期间，所获得的免疫细胞(例如T细胞)在其离体扩增能力方面的品质可以是最佳或改善的。同样，在使用本文所述的方法离体操纵之后，这些细胞可呈优选状态以供增强的植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中预期在此恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突状细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，可使用动员(例如用GM-CSF动员)和调理方案在受试者中产生如下状态，其中特定细胞类型的再殖、再循环、再生和/或扩增是有利的，尤其在治疗后的限定时间窗口期间。例示性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞和免疫系统的其他细胞。

2.免疫细胞的活化和扩增

无论在用本文所述的嵌合受体或嵌合受体系统遗传修饰免疫细胞(例如T细胞)之前或之后，通常均可使用如以下所述的方法活化和扩增免疫细胞(例如T细胞)，例如：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公布20060121005。

通常，T细胞可通过与连接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体地，可如本文所述刺激T细胞群，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)以及钙离子载体接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4⁺ T细胞或CD8⁺ T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，其可如本领域通常已知的其他方法使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。

在一些实施方案中，可通过不同方案提供T细胞的主要刺激信号和共刺激信号。例如，提供各信号的试剂可以是溶液形式或与表面偶合。当与表面偶合时，所述试剂可与相同表面(即，以“顺式”形式)偶合或与单独表面(即，以“反式”形式)偶合。可替代地，一种试剂可与表面偶合，并且另一试剂可以是溶液形式。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，并且提供主要活化信号的试剂是溶液形式或与表面偶合。在某些实施方案中，两种试剂均可以是溶液形式。在另一个实施方案中，试剂可以是可溶形式，随后与表面交联，所述表面诸如表达Fc受体的细胞或将结合所述试剂的抗体或其他结合剂。在此方面，参见例如美国专利申请公布20040101519和20060034810中的人工抗原呈递细胞(aAPC)，在本发明中预期所述细胞可用于活化和扩增T细胞。

在一些实施方案中，将T细胞与涂有试剂的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，接着培养细胞。在一个替代性实施方案中，在培养之前，不分离涂有试剂的珠粒和细胞，而是在一起培养。在另一个实施方案中，首先通过施加力(诸如磁力)浓缩珠粒和细胞以使细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。

例如，可通过使连接有抗CD3和抗CD28的顺磁珠粒接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如10⁴至10⁹个T细胞)与珠粒(例如1:1比率的M-450 CD3/CD28 T顺磁珠粒)在缓冲液，优选PBS(没有二价阳离子，诸如钙和镁)中组合。再次，普通技术人员可容易地理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可非常稀少并且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可包含目标靶细胞。因此，任何细胞数量均在本发明的背景内。在某些实施方案中，可期望显著减小粒子和细胞混合在一起的体积(即提高细胞的浓度)，以确保细胞与粒子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/毫升的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/毫升。在另一个实施方案中，使用0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5亿个细胞/毫升的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1亿个细胞/毫升的细胞浓度。在其他实施方案中，可使用1.25或1.5亿个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度使得可更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且在某些实施方案中将期望获得。例如，使用高浓度细胞使得可更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。

在一些实施方案中，可将混合物培养若干小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可培养混合物21天。在本发明的一个实施方案中，将珠粒和免疫细胞(例如T细胞)一起培养约八天。在另一个实施方案中，将珠粒和免疫细胞(例如T细胞)一起培养2-3天。还可期望若干刺激周期以使得免疫细胞(例如T细胞)的培养时间可以是60天或更久。适用于免疫细胞(例如T细胞)培养的条件包括适当的培养基(例如最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可含有增殖和活力所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或熟练技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640；AIM-V；DMEM；MEM；α-MEM；F-12；X-Vivo 15和X-Vivo 20；Optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适量血清(或血浆)或限定激素组，和/或添加有足以使免疫细胞(例如T细胞)生长和扩增的量的细胞因子。仅在实验培养物中包括抗生素(例如青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin))，而在待输注到受试者体内的细胞的培养物中不包括。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件(例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO₂))下。暴露于不同刺激时间的免疫细胞(例如T细胞)可表现出不同特征。例如，典型血液或单采血液分离术获得的外周血单核细胞产物的辅助性T细胞群(TH，CD4⁺)多于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群，所述细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，所述T细胞群包含越来越大的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可以是有利的。类似地，如果已分离TC细胞的抗原特异性亚组，则在更大程度上扩增此亚组可以是有益的。

此外，除CD4和CD8标志物外，其他表型标志物在细胞扩增过程中也显著变化，但大部分是可再现的。因此，这种可再现性使得能够针对特定目的定制活化T细胞产物。

V.药物组合物

本申请还提供了药物组合物，其包含抗CLL1构建体(包括抗CLL1 sdAb、嵌合受体、免疫效应细胞衔接子和免疫缀合物)中的任一者，或包含如本文所述的抗CLL1嵌合受体或嵌合受体系统中的任一者的工程改造的免疫细胞中的任一者，以及药学上可接受的载剂。药物组合物可通过将具有期望纯度的抗CLL1构建体或多个工程改造的免疫细胞与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.版(1980))以冻干制剂或水溶液的形式混合来制备。

可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂；抗氧化剂，其包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠；防腐剂；等张剂；稳定剂；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；螯合剂，诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。

为了将药物组合物用于体内施用，其必须是无菌的。可通过经无菌滤膜过滤来使药物组合物无菌。通常将本文的药物组合物放置到具有无菌进入口的容器(例如，静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)中。

施用途径根据已知且可接受的方法，诸如通过以合适的方式长时间段单次或多次推注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注；局部施用；吸入；或通过持续释放或延长释放方式。

本文所述的药物组合物还可含有多于一种所治疗的特定适应症所必需的活性化合物或药剂，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性化合物或药剂。可替代地或另外，组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子适合以对预期目的有效的量组合存在。

活性成分还可截留在以下中：微胶囊，其例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)；或巨乳液。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版中。

VI.治疗方法

本申请的一个方面提供治疗个体的疾病(诸如癌症)的方法，其包括向个体施用有效量的本文所述的抗CLL1构建体中的任一者。在一些实施方案中，本申请提供用于细胞免疫疗法中的方法和组合物。在一些实施方案中，细胞免疫疗法用于治疗癌症，包括但不限于血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤。本文所述的抗CLL1sdAb、免疫效应细胞衔接子、嵌合受体、免疫缀合物和工程改造的免疫细胞(诸如CAR-T细胞)中的任一者均可用于治疗癌症的方法中。示例性癌症类型包括但不限于急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于治疗与CLL1相关的其他疾病。

在一些实施方案中，提供了一种治疗个体(诸如人个体)的疾病(诸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向个体施用有效量的包含抗CLL1构建体的药物组合物，所述抗CLL1构建体包含特异性结合CLL1的sdAb部分，其中sdAb部分(例如V_HH)包含：(1)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是仅重链抗体。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是多特异性抗体，诸如双特异性抗体。在一些实施方案中，抗CLL1构建体是免疫缀合物。

在一些实施方案中，提供了一种治疗个体(诸如人个体)的疾病(诸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向个体施用有效量的包含免疫效应细胞衔接子的药物组合物，所述免疫效应细胞衔接子包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的靶细胞结合结构域，以及(b)包含特异性结合免疫效应细胞上的抗原的抗原结合片段的免疫效应细胞结合结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域中的抗原结合片段是Fab、scFv或sdAb。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与免疫效应细胞结合结构域的N端融合。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与免疫效应细胞结构域的C端融合。在一些实施方案中，靶细胞结合结构域与免疫效应细胞结合结构域通过肽接头融合。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。

在一些实施方案中，提供了一种治疗个体(诸如人个体)的疾病(诸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向个体施用有效量的包含工程改造的免疫细胞(例如T细胞)的药物组合物，所述工程改造的免疫细胞包含：抗CLL1嵌合受体，其包含：(a)包含抗CLL1sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞(诸如T细胞)的主要细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导序列来源于CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于选自由以下组成的组的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配体以及其组合。在一些实施方案中，细胞内共刺激序列来源于CD28或4-1BB。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)包含CD3ζ细胞内信号传导序列和来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含SEQ ID NO:120-132、177-179、181和229-230中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:120-132、177-179和181和229-230中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，抗CLL1嵌合受体包含SEQ ID NO:125或181的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程改造的免疫效应细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。在一些实施方案中，所述方法还包括随后施用有效量的特异性结合安全性开关抗原或表位的治疗性抗体。

在一些实施方案中，提供了一种治疗个体(诸如人个体)的疾病(诸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向个体施用有效量的包含工程改造的免疫细胞(例如T细胞)的药物组合物，所述工程改造的免疫细胞包含多特异性(例如双特异性)嵌合受体，所述嵌合受体包含：(a)包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)和特异性结合第二抗原或表位的第二sdAb(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ细胞内信号传导序列和来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列。在一些实施方案中，第二结合部分是抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些实施方案中，第二结合部分是NKG2D的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含如下多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:184-195中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:184-195中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，多特异性嵌合受体包含SEQ ID NO:184、185或188的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程改造的免疫效应细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。在一些实施方案中，所述方法还包括随后施用有效量的特异性结合安全性开关抗原或表位的治疗性抗体。

在一些实施方案中，提供了一种治疗个体(诸如人个体)的疾病(诸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向个体施用有效量的包含工程改造的免疫细胞(例如T细胞)的药物组合物，所述工程改造的免疫细胞包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞的主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)的细胞内信号传导结构域；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含细胞内共刺激序列(例如来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，提供了一种治疗个体(诸如人个体)的疾病(诸如癌症，例如AML、CML或MDS)的方法，其包括向个体施用有效量的包含工程改造的免疫细胞(例如T细胞)的药物组合物，所述工程改造的免疫细胞包含：(a)第一嵌合受体，其包含有包含抗CLL1 sdAb(诸如本文所述的抗CLL1 sdAb中的任一者)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含有包含细胞内共刺激序列(例如来源于CD28或4-1BB的细胞内共刺激序列)的细胞内信号传导结构域的细胞内结构域；(b)第二嵌合受体，其包含有包含特异性结合第二抗原或表位的第二结合部分(例如sdAb、scFv或受体的细胞外结构域)的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含免疫细胞的主要细胞内信号传导序列(例如CD3ζ细胞内信号传导序列)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第二结合部分是抗CD33或抗CD123 sdAb或scFv。在一些实施方案中，第二结合部分是NKG2D的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含以下中的任一者：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQID NO:8的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(2)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(4)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(5)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(7)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(8)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(9)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(10)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(11)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(12)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(13)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:90的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(14)包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；(15)包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体；或(16)包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CDR2以及包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDR3，或其在所述CDR中包含最多约5个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CLL1 sdAb包含如下V_HH结构域，其包含SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:94-106和171-173中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞包含双重嵌合受体构建体，所述双重嵌合受体构建体包含通过自切割肽(例如P2A肽)与第二嵌合受体融合的第一嵌合受体。在一些实施方案中，双重嵌合受体构建体包含SEQ ID NO:234-236中的任一者的氨基酸序列或其包含与SEQ ID NO:234-236中的任一者的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，工程改造的免疫效应细胞表达安全性开关抗原或表位，诸如CD52、EGFR或CD20。在一些实施方案中，所述方法还包括随后施用有效量的特异性结合安全性开关抗原或表位的治疗性抗体。

本文所述的方法适用于治疗各种癌症，包括实体癌症和液体癌症。所述方法适用于所有阶段的癌症，包括早期、晚期和转移性癌症。本文所述的方法可在辅助治疗或新辅助治疗中用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型的癌症疗法用作组合疗法，所述癌症疗法诸如化学疗法、手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等。在一些实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。

抗CLL1构建体或其药物组合物的施用可以任何方便方式进行，包括通过注射、摄入、输液、植入或移植。可将药物组合物通过动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉内或腹膜内施用给患者。在一些实施方案中，全身施用药物组合物。在一些实施方案中，通过输注(诸如静脉内输注)向个体施用药物组合物。用于免疫疗法的输注技术是本领域已知的(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。在一些实施方案中，通过皮内或皮下注射向个体施用药物组合物。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用组合物。在一些实施方案中，将组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。在一些实施方案中，将药物组合物局部施用至肿瘤部位，诸如直接施用到肿瘤细胞中，或施用至具有肿瘤细胞的组织。

本申请的药物组合物的剂量和期望药物浓度可取决于预期的特定用途而变化。适当剂量或施用途径的确定完全在普通技术人员的技能范围内。动物实验为确定人疗法的有效剂量提供可靠指导。可遵循Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of InterspeciesScaling in Toxicokinetics,”Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等人编,Pergamon Press,New York 1989,第42-46页提出的原理执行有效剂量的种间标定。在本申请的范围内，不同制剂对于不同治疗和不同病症将是有效的，并且旨在治疗特定器官或组织的施用可需要以与向另一器官或组织不同的方式递送。

在药物组合物包含本文所述的抗CLL1构建体中的任一者的一些实施方案中，取决于施用途径，以每天每千克个体体重约10ng至约100mg或更高(例如以约1mg/kg/天至10mg/kg/天)的剂量施用药物组合物。

在药物组合物包含本文所述的工程改造的免疫细胞中的任一者的一些实施方案中，以每千克个体体重至少约10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个细胞中的任一者的剂量施用药物组合物。在一些实施方案中，以每千克个体体重约10⁴至约10⁵、约10⁵至约10⁶、约10⁶至约10⁷、约10⁷至约10⁸、约10⁸至约10⁹、约10⁴至约10⁹、约10⁴至约10⁶、约10⁶至约10⁸或约10⁵至约10⁷个细胞中的任一者的剂量施用药物组合物。在一些实施方案中，以至少约1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、1×10⁷个细胞/kg或更多中的任一者的剂量施用药物组合物。

在一些实施方案中，单次施用药物组合物。在一些实施方案中，多次(诸如2、3、4、5、6次或更多次中的任一者)施用药物组合物。在一些实施方案中，每周一次至每年一次施用药物组合物。在一些实施方案中，施用之间的间隔为约1周至一年。医学领域的熟练技术人员可通过监测患者的病征并且相应地调整治疗容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。

此外，可通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用剂量。在一些实施方案中，以分割剂量(诸如约2、3、4、5次或更多次剂量中的任一者)施用药物组合物。在一些实施方案中，经约一周施用分割剂量。在一些实施方案中，将剂量均等分割。在一些实施方案中，分割剂量是总剂量的约20％、约30％和约50％。在一些实施方案中，连续分割剂量之间的间隔为约1天、2天、3天或更长时间。对于经若干天或更久的重复施用，取决于病状，持续治疗直到出现期望的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案也可以是有用的。可通过常规技术和测定容易地监测此疗法的进展。

在一些实施方案中，药物组合物的量有效引起个体的客观临床反应。在一些实施方案中，药物组合物的量有效引起个体的疾病缓解(部分或完全)。在一些实施方案中，药物组合物的量有效预防个体癌症的复发或疾病进展。在一些实施方案中，药物组合物的量有效延长个体的生存期(诸如无疾病生存期)。在一些实施方案中，药物组合物有效改善个体的生活品质。

在一些实施方案中，药物组合物的量有效抑制实体或淋巴肿瘤的生长或减小实体或淋巴肿瘤的尺寸。在一些实施方案中，实体或淋巴肿瘤的尺寸减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，提供一种抑制个体的实体或淋巴肿瘤的生长或减小其尺寸的方法。

在一些实施方案中，药物组合物的量有效抑制个体的肿瘤转移。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)转移。在一些实施方案中，提供一种抑制向淋巴结转移的方法。在一些实施方案中，提供一种抑制向肺转移的方法。在一些实施方案中，提供一种抑制向肝脏转移的方法。可通过本领域的任何已知方法评估转移，诸如通过血液测试、骨扫描、X射线扫描、CT扫描、PET扫描和活检。

VII.试剂盒和制品

还提供了包含本文所述的抗CLL1 sdAb、抗CLL1构建体(诸如嵌合受体、免疫效应细胞衔接子和免疫缀合物)或工程改造的免疫细胞的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施方案中，提供一种试剂盒，其包含本文所述的药物组合物中的任一者。在一些实施方案中，试剂盒还包含其使用说明。

本申请的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装(例如密封Mylar或塑料袋)等。试剂盒可任选地提供另外的组分，诸如缓冲液和解释性信息。因此，本申请还提供制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、柔性包装等。

制品可包含容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或病症(诸如癌症)的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示所述组合物用于治疗个体的特定疾病或病状。标签或包装插页还将包含用于向个体施用组合物的说明。标签可指示重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如2-6次施用)重构制剂。包装插页是指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明，其含有关于使用此类治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外，所述制品还可包含第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。其还可包括从商业和用户角度期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

试剂盒或制品可包括药物组合物的多次单位剂量和使用说明书，其包装数量足以在药房(例如医院药房和配混药房)中储存和使用。

实施例

以下实施例仅旨在作为本发明的示例，因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述以说明方式而非限制方式提供。

实施例1：抗CLL1 sdAb的产生

CLL1蛋白的重组细胞外结构域的制备

来自人或食蟹猴的CLL1蛋白的细胞外蛋白结构域(ECD)通过在用编码表8中的对应氨基酸序列的质粒转染的人胚肾HEK293细胞中瞬时表达来制备。

将各表达质粒与293FECTIN^TM(Life Technologies)复合，并且添加到悬浮培养的293-F细胞(源自HEK293细胞)中。转染后八天，收集培养上清液，并且通过IMAC(GEHealthcare)纯化相应可溶性蛋白，得到蛋白质批料。

表8.CLL1蛋白的细胞外结构域

免疫

根据所有现行动物福利法规，用CLL1的各重组ECD对骆驼免疫。为了进行免疫，用CFA(完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant)；初次免疫)或IFA(不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant)；加强免疫)将抗原配制为乳液。在颈部皮下施用抗原。各动物以两周间隔接受6次乳液注射，所述乳液在CFA乳液中含有200μg CLL1-His蛋白，随后接受5次含CLL1-His蛋白的IFA乳液的注射。在免疫期间的不同时间点，从动物中收集10ml血液样品并且制备血清。使用血清样品，使用基于ELISA的测定用固定的CLL1-His蛋白验证抗原特异性体液免疫反应的诱导。如图1-2所示，免疫后血清和免疫球蛋白(包括4链抗体和仅重链抗体两者)以浓度依赖性方式特异性结合CLL1-His蛋白。上次免疫后四天，收集180ml血液样品。使用Ficoll-Paque梯度(Amersham Biosciences)从血液样品中分离外周血淋巴细胞(PBL)作为骆驼HCAb的遗传来源，得到2.5×10⁸个PBL。

文库构建

使用从PBL提取的RNA作为RT-PCR的起始材料来扩增编码sdAb的基因片段。将这些片段克隆到内部噬菌粒载体中。所述载体编码与各sdAb编码序列同框的C端His标签。文库大小为约3×10⁹个。根据标准方案制备噬菌体文库，并且在过滤灭菌后储存在4℃下以供进一步使用。

选择和高通量筛选

通过固体淘选以及基于细胞的淘选来筛选噬菌体文库。对于两种淘选条件中的每一种，仅执行单轮选择。基于ELISA结果，分析各选择输出以确定富集因子(即相对于对照，洗脱液中存在的噬菌体数量)、多样性和CLL1阳性克隆的百分比。基于这些参数，选择最佳克隆用于进一步分析。为此，将各选择的输出作为库再克隆到可溶性表达载体中以进行高通量筛选。所述表达载体编码与各sdAb编码序列同框的C端His标签。挑取菌落并且使其在96深孔板(1mL体积/孔)中生长，并且通过添加IPTG和0.1％Triton诱导以在上清液中表达sdAb。

首先使用ELISA测定针对结合相应CLL1蛋白的能力筛选上清液。对阳性结合物进行测序，并且选择独特克隆进行进一步表征。

使独特克隆在2YT培养基中生长，并且通过IPTG诱导以在上清液中表达sdAb。使用FACS测定分析独特结合物的上清液结合表达CLL1的HKE293/huCLL-1细胞系和癌细胞系AML193的能力。在T200仪器上通过表面等离子体共振(SPR)确定上清液中所选结合物对重组人和食蟹猴CLL1蛋白的亲和力。使用解离相计算各sdAb的k_d值。所选抗CLL1sdAb的结合数据在表9中示出。

表9.所选sdAb的结合特性

实施例2：抗CLL1 CAR-T的产生和筛选

CAR构建体的产生

如图3和表3所示，将各分离sdAb(SEQ ID NO:94-106和171-173)与4-1BB的细胞内共刺激序列和CD3ζ的细胞内结构域一起克隆到慢病毒表达载体中。还构建具有抗CLL1scFv结构域的阳性对照CAR(CLL1 BM CAR)。将CAR构建体(SEQ ID NO:120-132和180)克隆到具有EF1α启动子的表达载体中以进行表达。CAR构建体的序列如下所示。

SEQ ID NO:120(AS82472 CAR)

SEQ ID NO:121(AS82480 CAR)

SEQ ID NO:122(AS82494 CAR)

SEQ ID NO:123(AS82505 CAR)

SEQ ID NO:124(AS82544 CAR)

SEQ ID NO:125(AS82658 CAR)

SEQ ID NO:126(AS82718 CAR)

SEQ ID NO:127(AS83180 CAR)

SEQ ID NO:128(AS83183 CAR)

SEQ ID NO:129(AS83309 CAR)

SEQ ID NO:130(AS83431 CAR)

SEQ ID NO:131(AS83478 CAR)

SEQ ID NO:132(AS83791 CAR)

SEQ ID NO:177(AS83010 CAR)

SEQ ID NO:178(AS83457 CAR)

SEQ ID NO:179(AS83591 CAR)

SEQ ID NO:180(CLL1 BM CAR)

慢病毒的制备

将包括pCMV-ΔR-8.47和pMD2.G(Addgene，目录号12259)的慢病毒包装质粒混合物与包含CAR构建体的各载体PLLV-hEF1α-CLL1以与聚乙烯亚胺的预优化比率预混合。随后将混合物添加到HEK293细胞中。过夜孵育之后收集细胞上清液。使含病毒的上清液通过0.45μm PES过滤器过滤，接着超速离心以使慢病毒沉淀。用预冷的PBS冲洗病毒沉淀物。将病毒等分并且立即储存在-80℃中。通过使用流式细胞术测定测量对supT1细胞系的转导效率来确定病毒滴度。

T淋巴细胞的收集和转导

通过单采血液分离术从健康供体中收集白细胞。使用FICOLL-PAQUE^TM PLUS培养基(GE Healthcare，目录号17-5442-02)根据制造商的方案分离外周血单核细胞(PBMC)。按照制造商的方案，使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi，目录号130-096-535)从PMBC中纯化人T细胞。随后根据制造商的方案用人T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi，目录号130-091-441)将纯化的T细胞预活化48小时，其中以1:2的珠粒与细胞比率添加抗CD3/CD28 MACSi珠粒粒子。在7μg/ml聚凝胺存在下，用各慢病毒储液转导预活化的T细胞。随后将转导细胞转移至细胞培养孵育箱以在合适条件下进行转基因表达。

体外细胞毒性测定

为了快速评价CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性，进行LDH(乳酸脱氢酶)细胞毒性测定。转导后第6天或第11天，收获转导的T细胞，并且与靶细胞(CLL1⁺ AML细胞系THP-1)以5:1或1:1的E/T比率(效应子：CAR-T/靶标：THP-1)共孵育20小时。使用来自相同批次的未转导T细胞(“UnT”)作为阴性对照。按照制造商的手册(Roche，11644793001)进行测定。通过以下等式计算细胞毒性([LDH]_E+T：从E/T共孵育释放的LDH，[LDH]_E：仅从效应子释放的LDH，[LDH]_max：从用Triton X-100处理的靶细胞释放的LDH，[LDH]_min：从未处理的靶细胞释放的LDH)：

如图4所示，相对于CLL1 BM CAR-T细胞，所有抗CLL1 CAR-T细胞均显示出针对THP-1细胞的更强细胞毒性。

通过HTRF检测的IFN-γ和TNF-α分泌

效应T细胞活化和增殖的另一量度是效应细胞因子(诸如IFN-γ和TNF-α)的产生。收集来自体外细胞毒性测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放。根据制造商的手册，针对IFN-γ(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)和TNFα(Cisbio，目录号62HTNFAPEH)进行HTRF测定。

相应细胞因子释放结果在图5A-5D中示出。所有抗CLL1 CAR-T细胞均表现出针对THP-1细胞的有效杀伤活性，并且响应于THP-1细胞释放出IFN-γ和TNF-α。

长期共培养测定

为了评价CAR-T细胞的长期杀伤功效，执行长期共培养测定，所述测定模拟体内的动态杀伤过程。用CFSE(SIGMA-ALDRICH，目录号21888-25MG-F)标记肿瘤细胞系(例如THP-1)。在不存在外源细胞因子(IL-2)的情况下，将转导或未转导的T细胞(2×10⁵个/孔)与肿瘤细胞系(例如CFSE-THP-1细胞，2×10⁵或4×10⁵个/孔)以1:1或1:2的E:T比率在24孔板中共培养。共培养2或3天后，收获细胞的一部分并且进行CD3染色。通过CFSE⁺信号鉴定肿瘤细胞。为进行连续共培养测定，随后以相同E:T比率用新鲜CFSE-THP-1细胞再激发剩余T细胞。进行共培养直到肿瘤细胞过度生长(outgrew)。各时间点的T细胞增殖率通过将所述时间点的T细胞数量除以前一时间点的T细胞数量来计算。

通过FACS检测进行长期共培养测定的代表性结果在图6A中示出。来自同一实验的计算T细胞增殖率和总T细胞计数分别在图6B和图6C中示出。数据表明，来源于sdAbAS83478的CAR-T的增殖和持久性优于CLL1 BM CAR和所测试的其余克隆。

菌落形成单位(CFU)测定

通过CFU测定评估抗CLL1 CAR-T细胞在体外对正常白血病祖细胞的潜在细胞毒性。将从脐带血(CB)免疫磁分离的CD34⁺细胞(HemaCare，目录号：CB34C-2)与测试CAR-T细胞、unT细胞或单独的培养基(未处理)以10:1的E:T(T细胞:CB细胞)比率共培养6小时。随后将每孔总数5,000个混合细胞涂板于MethoCult H4034Optimum培养基(STEMCELLTechnologies)中，并且培养5-7天，随后对菌落形成单位计数。使用BCMA和未转导的T细胞作为阴性对照。数据表示为各样品在三个培养皿中的菌落数量的平均值±SEM。

小鼠异种移植模型中的体内功效评价

对U937-Luc进行培养，重悬于HBSS^-/-中，并且以每只小鼠2x10⁶个细胞静脉内注射。肿瘤接种后每周或每两周进行一次生物发光成像(BLI)，以监测模型发展。基于BLI光子数和动物体重将动物随机分组。随机分组后，静脉内输注单次剂量的CAR-T细胞(AS82494CAR-T、AS82658 CAR-T、AS83183 CAR-T、AS83431 CAR-T、AS83478 CAR-T和阳性对照CLL1BM CAR-T)或UnT细胞。每周进行BLI成像以记录肿瘤生长。

如图7所示，在输注后2-3周后，用AS83183、AS83431或AS82658 CAR-T细胞处理的小鼠无肿瘤(BLI为约10⁶个)，而用UnT或媒介物处理的小鼠表现出快速肿瘤进展，并且必须在实验结束前实施安乐死。然而，用AS83183和AS83431 CAR-T细胞处理的小鼠在变得无肿瘤后由于不受控的CAR-T细胞扩增而死亡。这些结果显示，我们的抗CLL1 sdAb CAR-T细胞比CLL1 BM CAR更有效。

进行外周血样品的FACS分析以确定CAR-T细胞的持久性。在研究的终点，进行外周血、脾脏和骨髓样品等的FACS分析。

具有人源化免疫系统的小鼠模型中的体内毒性评价

为了在小鼠中重构人免疫系统(HIS)，向NCG小鼠输注来源于脐带血的CD34⁺细胞(HemaCare，目录号：CB34C-2)。通过流式细胞术分析来自各种人免疫亚组的外周血样品证实重构。为了制备CAR-T细胞，均如上所述，从HIS小鼠的脾脏中分离人T细胞，扩增并且用表达CAR的候选慢病毒转导。为了研究CAR-T细胞的毒性，向HIS小鼠输注2×10⁶个来源于同一CD34⁺细胞供体的CAR-T细胞。一周两次监测动物健康状态和体重，并且每周通过流式细胞术检测小鼠外周血中的人免疫细胞亚组。在指定时间点和研究结束时，对动物实施安乐死，并收获诸如脾脏和骨髓的器官，并且使用FACS分析人免疫细胞和造血干细胞的存在。

非人灵长类动物(NHP)模型中的体内毒性评价

为了制备CAR-T细胞，分离来源于食蟹猴的T细胞，扩增并且用表达CAR的候选慢病毒转导。为了研究CAR-T的短期毒性，用环磷酰胺和氟达拉滨对动物进行预处理，随后输注自体CAR-T细胞。输注后，每天监测受体动物的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的临床体征和症状。通过外周血样品的流式细胞术分析评估CAR-T细胞中的持久性和群体变化。通过ELISA或Meso Scale Discovery测定评估CRS相关的细胞因子水平。在指定时间点和研究结束时，对动物实施安乐死，收获诸如脾脏和骨髓的器官并且使用FACS分析。

实施例3：另外的抗CLL1 CAR构建体的产生和评价

CAR构建体的产生

使用来自实施例2的前沿抗CLL1 sdAb作为CLL1结合结构域来构建另外的CAR和CAR系统，如图8A-8E所示。

例如，如图8A所示的具有单特异性细胞外结构域和包含细胞内共刺激序列和CD3ζ细胞内信号传导序列的细胞内信号传导结构域的“常规CAR”可作出反应并且杀伤表达CLL1的细胞。如图8B所示的“串联CAR”通过经由肽接头融合特异性识别不同靶标的两个结合结构域以在单一CAR分子中形成细胞外结构域来构建。串联CAR可对表达两种靶分子(诸如CLL1、CD33和NKG2D配体)中的任一者的细胞作出反应。预期串联CAR同时以较高的亲和力和特异性结合表达两种靶分子的靶细胞，从而以低剂量产生改善的反应。如图8C所示，“双重CAR”通过表达针对不同靶标的两种全功能CAR构建。双重CAR可对表达CLL1或CD33、CD123或NKG2D配体中的任一者的细胞作出反应。如图8D-8E所示的“分割CAR”对表达CLL1和CD33、CD123或NKG2D配体中的任一者的细胞具有完全反应，但对仅表达CLL1、CD33、CD123或NKG2D配体中的一者的细胞仅具有边缘反应，这可产生较好的安全性概况。

安全性开关

为了限制CAR-T细胞的潜在毒性，可在CAR构建体中包括某些安全性开关。例如，将CAR-T细胞工程改造以进一步表达CD20、EGFR或CD52的全长抗原或某些肽表位序列。为了清除CAR-T细胞，可施用针对工程改造的抗原或表位的抗体，从而通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性消除CAR-T细胞。

体内抗体介导的CAR-T细胞消除

为评估完成情况并且鉴定抗体介导的CAR-T细胞消除的最佳时机，在指定时间点向植入HL-60、MV4-11、THP-1或U937的小鼠(每个群组n＝5至8只小鼠；时间点＝第0周)静脉内施用1次剂量的盐水、未转导T细胞(unT)或1.0×10⁶个CAR-T细胞。随后，在施用CAR-T后的指定时间点，通过腹膜内注射(i.p.)1次剂量的1或5mg/kg阿仑单抗(人源化抗CD52抗体)来向动物施用。如上所述，每周通过BLI和FACS定量人AML和CAR-T细胞来评估动物。收获鼠骨髓和脾脏，以通过FACS定量人AML和T细胞。在一些研究中进行鼠组织的组织病理学和免疫组织化学分析，以评估用阿仑单抗进行T细胞消融的完成情况。

如上所述，用盐水、unT或CAR-T-CD20细胞(每只小鼠1.0×10⁶个细胞)处理植入HL-60、MV4-11、THP-1或U937的另外小鼠群组(每个处理n＝5)。随后在CAR-T-CD20后4周，用1mg/kg剂量的抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab)(Roche)腹膜内处理动物来消除T细胞。通过BLI和FACS评估动物以对白血病负担和CAR-T细胞定量。

对于西妥昔单抗(cetuximab)介导的T细胞清除，如上所述，用盐水、unT或CAR-T-EGFR细胞(每只小鼠1.0×10⁶个细胞)处理植入HL-60、MV4-11、THP-1或U937的另外小鼠群组(每个处理n＝5)。随后在CAR-T-CD20后4周，用1mg/kg剂量的抗EGFR抗体西妥昔单抗(Bristol-Myers Squibb)腹膜内处理动物来消除T细胞。通过BLI和FACS评估动物以对白血病负担和CAR-T细胞定量。

CAR构建体的评价

测试具有或不具有安全性开关的CAR构建体在体外对AML细胞系的细胞毒性，测试所述CAR构建体在异种移植AML动物模型中的体内功效，通过CFU测定测试所述CAR构建体的体外造血毒性，测试所述CAR构建体在体内通过相应抗体实现的消除并且通过HIS小鼠和NHP研究测试所述CAR构建体的体内毒性。

实施例4：AS82658-28z CAR构建体的产生和评价

CAR构建体的产生

如图8A所示，将AS82658 sdAb与CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ的细胞内结构域一起克隆到慢病毒表达载体中。将CAR构建体(AS82658-28z)克隆到具有EF1α启动子的表达载体中以进行表达。AS82658-28z的序列如下所示。

SEQ ID NO:181(AS82658-28z CAR)：

CAR-T细胞的制备

如实施例2中所述制备编码AS82658-28z CAR和CLL1 BM CAR(阳性对照)的慢病毒。根据实施例2中的方案，收集T淋巴细胞并且用慢病毒转导。

体外细胞毒性测定

如实施例2中所述，使用体外LDH(乳酸脱氢酶)测定评估AS82658-28z CAR-T细胞的抗肿瘤活性。如图9A-9B所示，AS82658-28z对THP-1(具有CLL1的中等表达)和MOLM-13细胞(具有CLL1的低表达)的体外细胞毒性与CLL1 BM CAR相当。

长期共培养测定

使用长期共培养测定评估CAR-T细胞对肿瘤细胞的长期杀伤功效。用CFSE(SIGMA-ALDRICH，目录号21888-25MG-F)标记AML肿瘤细胞系(例如U937)。在不存在外源细胞因子(例如IL-2)的情况下，将转导或未转导的T细胞(1×10⁵个/孔)与肿瘤细胞系(例如CFSE-U937细胞，4×10⁵个/孔)以1:4的E:T比率在24孔板中共培养。共培养2或3天后，收获细胞的级分并且进行CD3染色。通过CFSE⁺信号鉴定肿瘤细胞。为了进行连续共培养测定，随后以相同E:T比率用新鲜CFSE-U937细胞再激发剩余T细胞。进行共培养直到肿瘤细胞在共培养物中占主导地位。各时间点的T细胞增殖率通过将所述时间点的T细胞数量除以前一时间点的T细胞数量来计算。

在重复肿瘤刺激测定中，CAR-T细胞的杀伤功效在图10A中示出。阳性对照CLL1 BMCAR-T细胞在5轮肿瘤刺激后耗尽，而AS82658-28z CAR-T细胞直到9轮肿瘤刺激为止仍持续存在。此外，AS8265-28z CAR-T细胞在体外的增殖快于CLL1 BM CAR(图10B)。这些结果表明，AS82658-28z CAR-T细胞在体外具有比CLL1 BM CAR-T细胞更有效的抗肿瘤活性。

通过HTRF检测的IFN-γ和GM-CSF分泌

效应T细胞活化和增殖的另一量度是效应细胞因子(诸如IFN-γ和GM-CSF)的产生。收集来自长期共培养测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放。根据制造商的手册，针对IFN-γ(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)和GM-CSF(Cisbio，目录号62HGMCSFPEG)进行HTRF测定。

代表性细胞因子释放测定的结果在图11A-11B中示出。在较晚时间点(共培养开始后的5、7、10和12天)，在与U937细胞的共培养物中，AS82658-28z CAR-T细胞分泌的IFN-γ和GM-CSF的水平高于CLL1 BM CAR-T细胞。

菌落形成单位(CFU)测定

通过体外CFU测定评估抗CLL1 CAR-T细胞对正常造血干细胞(HSC)的潜在毒性。将从脐带血(CB)免疫磁分离的CD34⁺细胞(HemaCare，目录号：CB34C-2)与测试CAR-T细胞、unT细胞或单独的培养基(未处理)以10:1的E:T(T细胞:CB细胞)比率共培养6小时。随后将每孔总数5,000个混合细胞涂板于MethoCult H4034Optimum培养基(STEMCELL Technologies)中，并且培养5-7天，随后对菌落形成单位计数。使用未转导的T细胞作为阴性对照。使用CLL1 BM CAR-T细胞作为阳性对照。数据表示为各样品在三个培养皿中的菌落数量的平均值±SEM。

如图12A所示，与媒介物对照相比，与UnT细胞一起预孵育的HSC未表现出异常发育，因为UnT组的菌落数量与培养基组的菌落数量相同。与UnT相比，与AS82658-28z CAR-T细胞或CLL1 BM CAR-T细胞一起预孵育的HSC的发育均受抑制，因为与UnT组中相比，这些组中形成的菌落较少(图12B)。AS82658-28z CAR组与CLL1 BM CAR组之间没有显著差异。这些数据表明抗CLL1 CAR-T疗法可能影响造血功能，并且AML治疗可能需要HSC移植。

小鼠异种移植模型中的体内功效评价

如实施例2中所述，在U937-Luc异种移植小鼠模型中评价AS82658-28z CAR-T细胞的体内功效。

如图13所示，在注射后2-3周后，用AS82658-28z CAR-T细胞或CLL1 BM CAR-T细胞处理的小鼠无肿瘤(BLI为约10⁶个)，而用UnT或媒介物处理的小鼠表现出快速肿瘤进展，并且必须在实验结束前实施安乐死。AS82658-28z CAR-T细胞在体内的抗肿瘤活性与CLL1 BM相当。

实施例5：抗CLL1/CD33串联CAR构建体的产生和评价

CAR构建体的产生

如图8B所示的示例性串联CAR通过经由肽接头融合特异性识别不同靶标(CLL1和CD33)的两个结合结构域以在单一CAR分子中形成细胞外结构域来构建。如图8B和表4所示，将抗CLL1/CD33串联CAR与CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ的细胞内结构域一起克隆到慢病毒表达载体中。还构建AS49264 CAR，其包含抗CD33 sdAb结构域作为细胞外结构域，以及CD28的细胞内共刺激序列和CD3ζ的细胞内结构域。将CAR构建体克隆到具有EF1α启动子的表达载体中以进行表达。示例性串联CAR的序列如下所示。

SEQ ID NO:184(Tan1)：

SEQ ID NO:185(Tan2)：

SEQ ID NO:186(Tan3)：

SEQ ID NO:187(Tan4)：

SEQ ID NO:188(Tan5)：

SEQ ID NO:189(Tan6)：

SEQ ID NO:190(Tan7)：

SEQ ID NO:191(Tan8)：

SEQ ID NO:192(Tan9)：

SEQ ID NO:193(Tan10)：

SEQ ID NO:194(Tan11)：

SEQ ID NO:195(Tan12)：

SEQ ID NO:196(AS49264 CAR)：

CAR-T细胞的制备

如实施例2中所述制备编码串联CAR(Tan 1-Tan 12)、AS82658-28z CAR和AS49264CAR(阳性对照)的慢病毒。根据实施例2中的方案，收集T淋巴细胞并且用慢病毒转导。

体外细胞毒性测定

如实施例2中所述，使用体外LDH(乳酸脱氢酶)测定评估串联CAR-T细胞的抗肿瘤活性。

如图14所示，串联CAR对THP-1的体外细胞毒性高于两种单一靶标CAR-T细胞(AS82658-28z或AS49264 CAR-T)，这表明针对两种靶标(例如CLL1和CD33)的串联CAR比单一靶标CAR更有效地消除肿瘤。

长期共培养测定

如实施例2中所述，使用长期共培养测定评估CAR-T细胞对肿瘤细胞的长期杀伤功效。

在重复肿瘤刺激测定中，各种串联CAR-T细胞的杀伤功效在图15A中示出。抗CLL1单一靶标CAR-T细胞(AS82658-28z CAR-T)和抗CD33单一靶标CAR-T细胞(AS49264 CAR-T)在3轮肿瘤刺激后耗尽，而大多数串联CAR-T细胞直到4或5轮肿瘤刺激为止仍持续存在。此外，串联CAR-T细胞在体外的增殖快于AS82658-28z或AS49264 CAR-T细胞(图15B)。这些结果还表明，CLL1/CD33串联CAR-T细胞在体外具有比两种单一靶标CAR-T细胞更有效的抗肿瘤活性。

通过HTRF检测的IFN-γ和GM-CSF分泌

如实施例3中所述评估在与肿瘤细胞的长期共培养物中，串联CAR-T细胞的细胞因子释放(IFN-γ和GM-CSF)。

代表性细胞因子释放测定的结果在图16A-16B中示出。串联CAR-T细胞与单一靶标CAR-T细胞(AS82658-28z和AS49264 CAR-T)在体外响应于U937细胞释放相当水平的细胞因子。

实施例6：抗CLL1/CD33双重CAR构建体的产生和评价

CAR构建体的产生

如图8C所示，示例性双重CAR通过分别表达针对CLL1和CD33的两种全功能CAR构建。将表6所示的双重CAR构建体克隆到具有EF1α启动子的表达载体中以进行表达。抗CD33sdAb、AS49814、AS50073和AS67190的序列在表5中示出。示例性双重CAR构建体和个别CAR的序列如下所示。

SEQ ID NO:234(双重1)：

SEQ ID NO:235(双重2)：

SEQ ID NO:236(双重3)：

SEQ ID NO:229(AS82472-28z CAR)：

SEQ ID NO:230(AS82494-28z CAR)：

SEQ ID NO:231(AS49814 CAR)：

SEQ ID NO:232(AS50073 CAR)：

SEQ ID NO:233(AS67190 CAR)：

CAR-T细胞的制备

如实施例2中所述制备编码双重CAR构建体(双重1-双重3)以及其中所含的个别CAR的慢病毒。根据实施例2中的方案，收集T淋巴细胞并且用慢病毒转导。

体外细胞毒性测定

如实施例2中所述，使用体外LDH(乳酸脱氢酶)测定评估双重CAR-T细胞的抗肿瘤活性。

如图17A-17C所示，双重CAR-T细胞对THP-1的体外细胞毒性强于抗CLL1 CAR-T细胞，并且与抗CD33 CAR-T细胞相当。这些数据表明，针对两种不同靶标(例如CLL1和CD33)的双重CAR-T细胞比单一靶标抗CLL1 CAR-T细胞更有效地消除肿瘤。

小鼠异种移植模型中的体内功效评价

对HL-60-Luc(人白血病细胞系)进行培养，重悬于HBSS^-/-中，并且以每只小鼠1x10⁷个细胞静脉内注射。肿瘤接种后每周或每两周进行一次生物发光成像(BLI)，以监测模型发展。基于BLI光子数和动物体重将动物随机分组。随机分组后，静脉内输注单次剂量的CAR-T细胞或UnT细胞。每周进行BLI成像以记录肿瘤生长。

如图18B和18D所示，在注射后3-4周后，用双重CAR-T细胞(双重1、双重2和双重3)处理的小鼠无肿瘤(BLI为约10⁶个)，而用UnT或媒介物处理的小鼠表现出快速肿瘤进展，并且必须在实验结束前实施安乐死。用双重CAR-T细胞处理的小鼠的肿瘤生长显著慢于用单一靶标CAR T细胞(AS82472 CAR、AS49814 CAR和AS67190 CAR)处理的小鼠。与实施例5的结果组合，这些数据表明双重靶标CAR-T细胞(串联CAR或双重CAR)比单一靶标CAR-T细胞更有效地作为肿瘤疗法。