一种适合工厂化生产的彩叶芋的组培快繁方法
阅读说明：本技术 一种适合工厂化生产的彩叶芋的组培快繁方法 (Tissue culture rapid propagation method of colocasia esculenta suitable for industrial production ) 是由 官锦燕 谭嘉娜 罗青文 罗剑飘 文明富 许玉婵 黄海英 于 2020-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于组织培养技术领域,是基于泰国引进的彩叶芋新品种进行2年的实验研究和生产基础上总结归纳的适合工厂化生产组培快繁研究方法,可操作性强,完全可用于指导生产。本发明首次建立了一套完整的具有高诱导率及增殖倍数的适合工厂化生产的诱导、增殖、生根和炼苗的快繁方法,形成批量快速的繁殖局面,通过控制增殖代数、培养基激素浓度和配比随着代数的变化有所改变,确保种苗的稳定性、活力与增殖系数,提高产量和质量；本发明采用边增殖边生根的生产方式,降低生产成本的同时加快生产进度,保证增殖系数的同时确保出根苗的质量,完全适合大规模工厂化的生产,极大地提高彩叶芋繁育的效率。(The invention belongs to the technical field of tissue culture, and relates to a tissue culture and rapid propagation research method suitable for industrial production, which is summarized and summarized on the basis of 2-year experimental research and production of new variety of colocasia esculenta introduced in Thailand, has strong operability and can be completely used for guiding production. The invention establishes a set of complete rapid propagation methods with high inductivity and multiplication multiple and suitable for industrial production for induction, multiplication, rooting and seedling hardening for the first time, forms a batch rapid propagation situation, ensures the stability, the activity and the multiplication coefficient of the seedlings and improves the yield and the quality by controlling the multiplication algebra, the concentration of culture medium hormone and the proportion to be changed along with the change of the algebra; the invention adopts a production mode of proliferation and rooting, reduces the production cost, accelerates the production progress, ensures the proliferation coefficient and ensures the quality of rooted seedlings, is completely suitable for large-scale industrialized production, and greatly improves the breeding efficiency of the colocasia esculenta.)
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，更具体地，涉及一种适合工厂化生产的彩叶芋的组培快繁方法。
背景技术
彩叶芋(Caladuim bicolor)，又名花叶芋，属于天南星科花叶芋属，原产南美洲，叶面色彩斑斓，飘逸潇洒，耐久观赏，是观叶植物中的上品，且在室内弱光中亦能很好地生长的习性，是目前流行的室内观叶植物。
目前，彩叶芋主要依靠块茎分株繁殖，但块茎繁殖有限，一株良好的块茎一年一次最多能分生出3～4株苗，且繁殖率低，生长慢。商业化繁殖也可以通过种子，但种子繁殖难度大，因为种子非常小，死亡率高，通过种子生长繁殖得到的植株成本太高，种子繁殖的后代极易发生变异和退化，难以保持原有的性状。
组织培养技术是目前植物快繁最有效的方法之一，具有繁殖系数高、成苗时间短和便于商品化和产业化生产的优势，且能保持品种的优良性状。目前，许多生产彩叶芋的公司和苗圃已开始利用组织培养技术进行大规模生产，快速繁殖出能够保持性状和无病毒的彩叶芋植株。
现有技术中关于彩叶芋的组培研究报道主要是针对单一品种进行组培快繁研究。而关于适合工厂化的彩叶芋组培快繁的系统研究很少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述技术缺陷，提供一种适合工业化生产的彩叶芋组培快繁方法，该方法能够批量快速的繁殖彩叶芋种苗，适应大规模种苗生产，满足市场需求。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种适合工厂化生产的彩叶芋的组培培养基，包括愈伤诱导培养基、芽诱导培养基、增殖培养基、生根培养基；
所述愈伤诱导培养基为基础培养基+3.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA；
所述芽诱导培养基为基础培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA；
所述增殖培养基包括增殖培养基A和增殖培养基B，其中增殖培养基A为基础培养基+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，增殖培养基B为基础培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；
所述生根培养基为营养培养基+0.4mg/L IBA+0.2mg/L NAA；
其中，所述基础培养基的组成为：MS培养基添加蔗糖、卡拉胶；所述营养培养基的组成为：MS培养基，添加活性炭、蔗糖、琼脂。
本发明明确了彩叶芋工厂化生产控制的代数，优化了每个培养阶段所用培养基的组分含量和培养时间，生产上完全可以采用边增殖和边生根的方式培养。发明人经过大量实验研究发现，整个生产过程中从愈伤诱导到最后一代增殖培养阶段所用激素是递减的，且每一阶段培养的代数范围也会对生产量和成本影响较大：愈伤诱导(前2代)——芽诱导(3、4代)——增殖培养阶段I(第5-9代)——增殖培养阶段Ⅱ(第10-13代)——生根培养(第4代开始)。
本发明还提供一种适合工厂化生产的彩叶芋的组培快繁方法，包括以下步骤：
S1、愈伤诱导培养：以彩叶芋卷棒状嫩叶为外植体，消毒后接种于愈伤诱导培养基中进行愈伤诱导；
S2、芽诱导培养：将S1诱导的愈伤接种于芽诱导培养基中培养，强光刺激分化出丛芽和胚状体；
S3、在增殖培养阶段I，将萌发的丛芽和胚状体依次接种于增殖培养基A培养，或者在增殖培养阶段II，将萌发的丛芽和胚状体依次接种于增殖培养基B培养，以分化出植株和胚状体；
其中，增殖培养阶段I是指彩叶芋生长的第5～9代；增殖培养阶段II是指彩叶芋生长的第10～13代；
S4、生根培养：将S3中粗壮的植株切成单株接种于生根培养基中培养，细弱的丛芽和胚状体再转接到S3的增殖培养基上进行增殖培养，从彩叶芋生长的第4代开始反复进行S3和S4的转接。
优选地，S3所述增殖培养基A培养时间为200～225天，每代40～45天；所述增殖培养基B培养时间为160～180天，每代40～45天。
S1所述诱导培养使彩叶芋嫩叶诱导出颗粒状的愈伤组织。一般开始诱导愈伤的时间为接种到诱导培养基上20～30天，也有35～50天的(与品种有关)，彩叶芋完全诱导出愈伤块再增殖一代后即可接种至S2所述芽培养基上。
S1诱导愈伤的条件：全黑暗条件，温度为25℃；S2的培养条件为：每天光照时间10～12h，强度为2000lux，温度为25℃。
优选地，S2所述将愈伤组织块培养成胚状体或芽体的时间为接种到芽诱导培养基上30天后；S4所述生根培养得到有根的完整植株。所述得到有根的完整植株的时间为接种到生根培养基上20天后。
优选地，S1所述外植体的消毒方法为：彩叶芋卷棒状嫩叶依次用75％酒精溶液和升汞溶液进行处理，最后用无菌水冲洗干净。
需严格控制消毒剂的浓度和消毒时间，防止杀死外植体细胞，影响诱导率。酒精具有强渗透性，此时酒精进入细菌的细胞内使蛋白变性，避免杀死细菌的同时损伤幼嫩的植物细胞，酒精处理方式为棉花擦拭。
具体的，S1所述升汞的质量体积浓度为0.1～0.2g/L，处理时间为5～15min。更优选地，所述升汞的质量体积浓度为0.1g/L，浸泡时间为7min。所述升汞使病菌的蛋白变性，且对细菌的消毒能力比真菌强。
优选地，S4操作为：待苗长至2～5cm，叶片数为3片时，转接到生根培养基中进行培养，剩下的芽体和胚状体转接回S3进行增殖培养。
优选地，S4生根的苗长至5～7cm，根数8条以上时，移栽到室外培养。
优选地，所述移栽为炼苗移栽，是将生根成功的袋苗置于温室中炼苗7～10天，洗净并用1000倍多菌灵处理10min后于基质中栽培。
优选地，所述基质由进口泥炭土：珍珠岩按体积比3：1混合所得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本专利是基于泰国引进的彩叶芋新品种进行2年的实验研究和生产基础上总结归纳的适合工厂化生产组培快繁研究方法，可操作性强，完全可用于指导生产。
本发明首次建立了一套完整的具有高诱导率及增殖倍数的适合工厂化生产的诱导、增殖、生根和炼苗的快繁方法，形成批量快速的繁殖局面，通过控制增殖代数、培养基激素浓度和配比随着代数的变化有所改变，确保种苗的稳定性、活力与增殖系数，提高产量和质量；本发明采用边增殖边生根的生产方式，本发明采用从第4代开始边增殖边出根的生产方式，在繁殖过程中苗形态正常，月出根系数达1.5～2倍，苗的品质优良；月繁殖系数达3～4倍，丛芽增殖活力强，无退化现象；在保证增殖系数的同时确保出根苗的质量，完全适合大规模工业化的生产，极大地提高彩叶芋繁育的效率。
附图说明
图1为培育出的彩叶芋C9的照片；
图2为彩叶芋C9组培过程中不同培养代数的照片；
图3为彩叶芋C3组培过程中不同培养代数的照片；
图4为彩叶芋C8组培过程中不同培养代数的照片；
图5为彩叶芋C10组培过程中不同培养代数的照片；
图6为彩叶芋C13组培过程中不同培养代数的照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1不同诱导培养基对彩叶芋愈伤组织诱导的影响
采集未展开的卷棒状彩叶芋嫩叶，75％酒精棉花擦拭，装入干净袋子。再于超净工作台上0.1％升汞消毒7min，无菌水冲洗4次。切成1mm薄片接种诱导培养基(诱导培养基的具体配方见表1)进行愈伤诱导培养。用黑布遮光，完全暗培养。
所述诱导培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。
每种处理接种10片嫩叶薄片，试验重复3次。根据生长情况统计出愈时间、出愈率。
平均出愈率＝愈伤组织块总数/外植体总数。
表1
由表1可知，不同的激素浓度配比对愈伤诱导率、出愈时间和愈伤状态均有较大的影响。6-BA低于2.0，较难诱导出合格的愈伤组织，6-BA在2.0～4.0之间均容易诱导出愈伤，且出愈时间呈递减趋势，结合后期愈伤诱导出芽情况，6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L配方最适合彩叶芋愈伤的诱导。
实施例2不同芽诱导培养基对彩叶芋芽诱导培养的影响
把实施例1中诱导的愈伤组织接种到芽诱导培养基中(芽诱导培养基的具体配方见表2)进行芽诱导培养。培养光照强度为2000lux，光照时间为12小时/天。
所述芽诱导培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。
每种处理接种20个芽茎段，试验重复3次。根据生长情况统计相应的胚状体和丛芽诱导时间、诱导率和芽体状态。
表2不同激素组合对彩叶芋芽与胚状体诱导的影响
据表2可知，不同激素组合对芽诱导时间、诱导率和长势影响较大，彩叶芋芽和胚状体是同时诱导出来的，且伴随着每一代，胚状体是丛芽的前身。6-BA为3.0mg/L时，丛芽较多且粗壮，但胚状体半透明，容易导致下一代苗的变异。6-BA为2.0mg/L，NAA0.1 mg/L或0.2mg/L时，丛芽和胚状体均正常，6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L诱导率最高，且丛芽多健壮，为较佳激素组合。6-BA为1.0mg/L，由于激素过低，较难诱导出丛芽和胚状体。
实施例3不同增殖培养基对彩叶芋增殖培养的影响
把实施例2中诱导的丛芽和胚状体接种到增殖培养基中(增殖培养基的具体配方见表3)进行增殖培养。培养光照强度为1500～2000lux，光照时间为12小时/天。
所述增殖培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。
本阶段数据为实验和大量生产时统计相应数据而得出的平均生根和增殖系数、苗长势。
表3不同激素组合对彩叶芋芽与胚状体增殖的影响
据表3可知，不同激素组合对彩叶芋生长的代数影响较大，在第5～9代，较高的激素(1.0<6-BA<2.0)有利于彩叶芋的增殖和出根，苗较粗壮，芽体叶较多。而在第10～13代时，较高的激素反而不利于彩叶芋的增殖，出芽量少，且大小不均匀；此时较低的激素组合反而有利于高代数的彩叶芋增殖与出根。因为植物体内的内源激素随着代数的增加不断地累积，导致代数越高时，所需的外源激素下降。根据大量的实验和生产分析得出，在第5～9代时，6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L为最佳激素组合，生根和增殖系数最高，苗健壮且数量多，均匀。在第10～13代时，6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L为最佳激素组合，生根和增殖系数较高，苗健壮且数量多。
实施例4不同生根培养基对彩叶芋组培苗生根的影响
增殖的同时分切出单株接种到生根培养基上(生根培养基的具体配方见表4)进行生根培养，培养光照强度为2000～2500lux，光照时间为12小时/天。根据实验和生产数据统计平均生根率、根系情况和植株长势。
所述生根培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，活性炭0.3g/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值5.8。
生根率＝生根植株树/总植株树×100％。
表4不同激素配比对彩叶芋组培苗生根的影响
序号
激素组合(mg/L)
生根率(％)
根系情况
植株长势
1
IBA 0.2
100
根系好，4～6条
叶柄较细弱，叶片偏黄
2
IBA 0.2+NAA0.1
100
根系很好，6～8条
叶柄壮，叶片绿
3
IBA 0.4+NAA 0.2
100
根系发达、8～12条
健壮、叶片大且翠绿
4
IBA 0.5
100
根系发达、6～8条
叶柄粗壮、叶片绿
如表4可知，彩叶芋很容易生根，不同的激素组合对根系情况和植株长势影响较明显。一定范围内，激素越高越有利于植株的生长，出新叶快，叶柄粗壮，叶片大且翠绿。IBA0.4mg/L+NAA 0.2mg/L是最佳的激素组合，植株明显最健壮、高大、叶片大且翠绿。
对比例1 NAA和IBA对彩叶芋增殖培养效果的比较
以实施例2、实施例3中所筛选出最佳芽诱导培养和增殖培养基为基础，基础培养基、细胞分裂素6-BA浓度和生长素浓度不变，更改生长素的种类(即以NAA替换IBA)配制增殖培养基。
所述培养基由基础培养基和激素组合组成，所述基础培养基包括以下组分：MS培养基，蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，pH值5.8。
表5 NAA和IBA对彩叶芋芽诱导培养效果的比较
序号
激素组合
诱导时间(d)
芽诱导率(％)
芽与胚状体长势
1
BA 2.0+NAA 0.2
25～30
95
丛芽较多且粗壮，胚状体翠绿
2
BA 2.0+IBA 0.2
30～40
75％
丛芽较少，胚状体淡黄
表6NAA和IBA对彩叶芋芽增殖培养效果的比较
由表5、表6可知：在芽诱导和芽增殖培养基中，NAA和IBA对彩叶芋生长有较明显的区别，NAA更利于彩叶芋愈伤的诱导、芽的诱导、增殖和苗的生长，而IBA相比较对彩叶芋的诱导和促进效果差。所以从整个生产的成本和效率看，NAA适合作为彩叶芋工厂化组培快繁的生长素。
图3到图6分别是不同品种的彩叶芋按照本发明上述方法进行快繁的组培照片，说明本发明所提供的上述组培培养基以及组培方法适合各种品种彩叶芋的组培快繁。
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