倍半萜内酯氮甲基哌嗪衍生物及其盐，及其在药物制备中的用途
阅读说明：本技术 倍半萜内酯氮甲基哌嗪衍生物及其盐，及其在药物制备中的用途 (Sesquiterpene lactone N-methyl piperazine derivative and salt thereof, and application of sesquiterpene lactone N-methyl piperazine derivative and salt thereof in preparation of medicines ) 是由 不公告发明人 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及倍半萜内酯氮甲基哌嗪衍生物及其药学上可接受的盐,以及它们在药物制备中的用途,具体涉及式(I)、(II)、(III)、(IV)所示的化合物及其在药学上可接受的盐,式(I)、(II)、(III)、(IV)所示的化合物及其药学上可接受的盐和组合物在制备抗癌或辅助抗癌药物中的用途。(The invention relates to sesquiterpene lactone N-methyl piperazine derivatives and pharmaceutically acceptable salts thereof, and application of the sesquiterpene lactone N-methyl piperazine derivatives and the pharmaceutically acceptable salts thereof in medicine preparation, in particular to application of compounds shown in formulas (I), (II), (III) and (IV) and the pharmaceutically acceptable salts thereof in preparation of anti-cancer or auxiliary anti-cancer medicines.)
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体地说，本发明涉及倍半萜内酯氮甲基哌嗪衍生物及其药学上可接受的盐，以及它们在药物制备中的用途。
背景技术
倍半萜内酯是菊科植物的特征化合物和主要药效成分，具有显著的生物学和药理学活性，如抗癌、抗炎和抗痢疾作用等，是当今学者研究的热点问题之一。例如：小白菊内酯(Parthenolide，PTL)是倍半萜内酯化合物，从中药野生甘菊中提取，原本用来治疗发热、偏头痛、炎症、类风湿性关节炎等疾病。近几年发现，小白菊内酯在多种肿瘤体内外实验中发挥强抗癌活性作用，如乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、肺癌等，并且对正常细胞具有较低的毒副作用。而含笑内酯同样具有抗乳腺癌、抗脑胶质瘤、抗风湿性关节炎等作用。一系列的药理研究表明该类化合物的关键药效团是α、β-不饱和羰基(酯)结构。但是由于常见的倍半萜内酯类化合物具有水溶性较差，生物利用率低，半衰期短等缺点。
本专利针对倍半萜内酯类化合物的上述缺点，通过和氮甲基哌嗪迈克尔加成反应、成盐反应得到一系列倍半萜类衍生物。该类衍生物具有缓释对应倍半萜内酯化合物的特点。
发明内容
本发明提供了一种如式(I)、(II)、(III)、(IV)所示的倍半萜内酯氮甲基哌嗪衍生物及其药学上可接受的盐，
所述的药学上可接受的盐是与无机酸或有机酸形成的盐，包括氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、硝酸、亚磷酸、亚硫酸、碳酸、硼酸、磷钼酸、亚硒酸、甲基磺酸、取代甲基磺酸、苯基磺酸、取代苯基磺酸、富马酸、柠檬酸、马来酸、酒石酸、草酸、D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸、L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、甲酸、取代甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、油酸、月桂酸、对甲基苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、酞酸、丙二酸、丁二酸、乙醇酸、硫醇酸、甘氨酸、肌氨酸、磺酸、烟酸、甲基吡啶酸、异烟酸、二氯乙酸、苯甲酸、取代苯甲酸。其中，与富马酸形成的盐如式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)所示：
所述式(I)、(II)、(III)、(IV)及其盐可缓慢释放相应的倍半萜内酯。
所述式(I)、(II)、(III)、(IV)化合物及其盐在制备治疗癌症的药物中的用途，其中癌症优选为白血病、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肠道癌、肾癌、口腔癌、何杰金淋巴癌、胰腺癌、直肠结肠癌、子官颈癌、非何杰金淋巴癌、神经胶质瘤、黑瘤、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌或卡波西肉瘤。
所述式(I)、(II)、(III)、(IV)化合物及其盐在制备治疗癌症的辅助药物中的用途，其中癌症优选为白血病、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肠道癌、肾癌、口腔癌、何杰金淋巴癌、胰腺癌、直肠结肠癌、子官颈癌、非何杰金淋巴癌、神经胶质瘤、黑瘤、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌或卡波西肉瘤。
一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的式(I)、(II)、(III)、(IV)化合物及其盐和药学上可接受的载体或其他抗癌药物，其中癌症优选白血病、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肠道癌、肾癌、口腔癌、何杰金淋巴癌、胰腺癌、直肠结肠癌、子官颈癌、非何杰金淋巴癌、神经胶质瘤、黑瘤、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌或卡波西肉瘤。
附图说明
图1式(I)化合物及其富马酸盐(V)制备
图2式(II)化合物及其富马酸盐(VI)的制备
图3式(III)化合物及其富马酸盐(VII)的制备
图4式(IV)化合物及其富马酸盐(VIII)的制备
图5式(I)化合物在HEPES溶液中释放趋势图
图6 DMA.MCL在HEPES溶液中释放趋势图
具体实施方式
本发明提供了一种如式(I)、(II)、(III)、(IV)所示的倍半萜内酯氮甲基哌嗪衍生物及其药学上可接受的盐，
所述的药学上可接受的盐是与无机酸或有机酸形成的盐，包括氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、硝酸、亚磷酸、亚硫酸、碳酸、硼酸、磷钼酸、亚硒酸、甲基磺酸、取代甲基磺酸、苯基磺酸、取代苯基磺酸、富马酸、柠檬酸、马来酸、酒石酸、草酸、D-苹果酸、L-苹果酸、DL-苹果酸、L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸、甲酸、取代甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、油酸、月桂酸、对甲基苯磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、酞酸、丙二酸、丁二酸、乙醇酸、硫醇酸、甘氨酸、肌氨酸、磺酸、烟酸、甲基吡啶酸、异烟酸、二氯乙酸、苯甲酸、取代苯甲酸。其中，与富马酸形成的盐如式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)所示：
所述式(I)、(II)、(III)、(IV)及其盐可缓慢释放相应的倍半萜内酯。
所述式(I)、(II)、(III)、(IV)化合物及其盐在制备治疗癌症的药物中的用途，其中癌症优选为白血病、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肠道癌、肾癌、口腔癌、何杰金淋巴癌、胰腺癌、直肠结肠癌、子官颈癌、非何杰金淋巴癌、神经胶质瘤、黑瘤、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌或卡波西肉瘤。
所述式(I)、(II)、(III)、(IV)化合物及其盐在制备治疗癌症的辅助药物中的用途，其中癌症优选为白血病、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肠道癌、肾癌、口腔癌、何杰金淋巴癌、胰腺癌、直肠结肠癌、子官颈癌、非何杰金淋巴癌、神经胶质瘤、黑瘤、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌或卡波西肉瘤。
一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的式(I)、(II)、(III)、(IV)化合物及其盐和药学上可接受的载体或其他抗癌药物，其中癌症优选白血病、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、大肠癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肠道癌、肾癌、口腔癌、何杰金淋巴癌、胰腺癌、直肠结肠癌、子官颈癌、非何杰金淋巴癌、神经胶质瘤、黑瘤、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌或卡波西肉瘤
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。
实施例1：式(I)化合物及其富马酸盐(V)制备
室温下，将含笑内酯(Micheliolide，MCL)(124mg,0.5mmol)和碳酸钾(2.1g,15mmol)依次加入反应瓶中，随后加入5毫升二氯甲烷作为溶剂，室温下加入氮甲基哌嗪(751mg,7.5mmol)。室温搅拌2小时后，TLC监测反应完成。砂芯漏斗过滤反应液，少量二氯甲烷(2毫升)洗涤滤饼，得到滤液。向滤液中加入5毫升饱和氯化钠，分液，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到白色迈克尔加成产物(产率：65％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝4.25(s,1H),3.72(t,J＝10.2Hz,1H),2.63-2.46(m,4H),2.4-2.15(m,7H),2.10-1.97(m,7H),1.95-1.84(m,2H),1.60-1.50(m,5H),1.25-1.07(m,5H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝177.50,133.12,130.76,82.54,79.53,57.53,56.73,54.99,54.74,51.72,45.76,43.21,40.36,34.90,29.58,26.66,23.60,22.62.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C20H33N2O3:349.2491；found:？.室温下，将迈克尔加成产物(55mg,0.16mmol)溶于丙酮(2mL)中，然后加入富马酸(18.6mg,0.16mmol)。室温搅拌2个小时以后有白色固体析出。砂芯漏斗抽滤，乙酸乙酯洗涤滤饼得到化合物(I)(产率：57％)。1H NMR(400MHz,D2O):δ＝1H NMR(400MHz,D2O)δ6.71(s,2H),4.11(t,J＝10.3Hz,2H),3.41(s,3H),3.16-2.99(m,4H),2.99-2.89(m,4H),2.85-2.77(m,1H),2.70(d,J＝10.2Hz,1H),2.43(dd,J＝16.4,8.1Hz,1H),2.30-2.09(m,6H),1.98-1.95(m,1H),1.84-1.74(m,1H),1.71(s,3H),1.42–1.38(m,1H),1.31(s,3H).；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ＝177.43,167.09,162.41,134.66,133.14,130.77,82.61,79.55,57.51,56.03,53.57,51.42,44.05,43.48,40.37,35.88,34.90,29.60,26.62,23.63,22.64..HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C20H33N2O3:349.2491；found:349.2494.
实施例2：式(II)化合物及其富马酸盐(VI)的制备
室温下，将小白菊内酯(Parthenolide，PTL)(124mg,0.5mmol)和碳酸钾(2.1g,15mmol)依次加入反应瓶中，随后加入5毫升二氯甲烷作为溶剂，室温下加入氮甲基哌嗪(751mg,7.5mmol)。室温搅拌2小时后，TLC监测反应完成。砂芯漏斗过滤反应液，少量二氯甲烷(2毫升)洗涤滤饼，得到滤液。向滤液中加入5毫升饱和氯化钠，分液，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到白色迈克尔加成产物(产率：71％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝5.17(d,J＝10.1Hz,1H),3.92(t,J＝9.1Hz,1H),2.75(d,J＝9.1Hz,1H),2.65-2.53(m,3H),2.50-2.45(m,1H),2.45-2.14(m,9H),2.13-2.07(m,4H),2.05-1.89(m,4H),1.64-1.53(m,4H),1.19-1.04(m,4H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ＝176.91,134.65,124.27,81.66,65.70,61.19,56.51,54.87,53.24,47.59,45.81,44.99,40.67,36.22,28.99,23.71,16.93,16.83.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C20H33N2O3:349.2491；found:？.室温下，将迈克尔加成产物(53mg,0.15mmol)溶于丙酮(2mL)中，然后加入富马酸(18mg,0.15mmol)。室温搅拌2个小时以后有白色固体析出。砂芯漏斗抽滤，乙酸乙酯洗涤滤饼得到化合物(II)(产率：84％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝6.57(s,3H),5.21(d,J＝10.3Hz,1H),3.97(t,J＝9.1Hz,1H),2.97-2.76(m,4H),2.75-2.46(m,9H),2.42-2.28(m,1H),2.26-2.12(m,2H),2.10-1.86(m,5H),1.68-1.59(s,3H),1.20(s,2H),1.11(td,J＝12.7,5.8Hz,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ＝176.83,166.89,134.54,124.41,81.73,65.65,61.28,55.46,53.33,51.29,47.20,45.37,43.44,40.64,36.28,30.80,28.91,23.75,16.95,16.81.HRMS(ESI):m/z[M+Na]+calcd forC20H32N2NaO3:371.2311；found:371.2315.
实施例3:式(III)化合物及其富马酸盐(VII)的制备
室温下，将土木香内酯(Alantolactone)(0.5mmol)溶于2毫升二氯甲烷。然后分批次加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA,100mg，0.58mmol)。TLC检测反应完成后，加入饱和硫代硫酸钠溶液5毫升，然后用10毫升二氯甲烷萃取水相三遍。收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。使用硅胶柱层析法过滤粗品(洗脱剂＝石油醚/乙酸乙酯，比例：5:2)得到环氧化产物(产率88％).
室温下，将环氧化产物(124mg,0.5mmol)和碳酸钾(2.1g,15mmol)依次加入反应瓶中，随后加入5毫升二氯甲烷作为溶剂，室温下加入氮甲基哌嗪(751mg,7.5mmol)。室温搅拌2小时后，TLC监测反应完成。砂芯漏斗过滤反应液，少量二氯甲烷(2毫升)洗涤滤饼，得到滤液。向滤液中加入5毫升饱和氯化钠，分液，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到迈克尔加成产物(产率：62％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝4.62-4.57(m,1H),3.34(s,1H),3.21-3.15(m,2H),2.87-2.80(m,1H),2.78-2.65(m,3H),2.53-2.35(m,6H),2.30(s,3H),1.88-1.79(m,3H),1.59(dd,J＝14.8,2.7Hz,1H),1.51-1.49(m,2H),1.44-1.41(m,2H),1.39-1.34(m,1H),1.19(s,3H),1.12(d,J＝7.8Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝176.92,75.88,68.10,57.23,55.13,54.96,45.95,39.61,38.82,37.84,37.73,35.91,32.06,29.60,24.09,17.73,16.48.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C20H33N2O3:349.2491；found:349.2495.
室温下，将迈克尔加成产物(173mg,0.5mmol)溶于丙酮(7mL)中，然后加入富马酸(58mg，0.5mmol)。室温搅拌2个小时以后有白色固体析出。砂芯漏斗抽滤，乙酸乙酯洗涤滤饼得到化合物(III)(产率56％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝6.58(s,2H),4.63-4.52(m,1H),3.46(d,J＝4.9Hz,1H),3.17(s,1H),3.08(dd,J＝10.1,8.0Hz,1H),2.95-2.70(m,6H),2.68-2.56(m,3H),2.54-2.48(m,2H),2.09(s,1H),1.82-1.62(m,3H),1.50-1.40(m,4H),1.32-1.20(m,2H),1.13-1.00(m,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ＝176.57,166.72,134.39,75.03,67.28,56.59,54.20,53.24,43.58,38.81,38.48,37.49,37.32,35.21,31.60,30.68,29.34,23.72,17.49,16.13.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C20H33N2O3:349.2491；found:349.2491.
实施例4:式(IV)化合物及其富马酸盐(VIII)的制备
在0℃下，将SeO2(38.17mg，0.344mmol)溶解在CH2Cl2(4mL)中，加入TBHP(0.172mL)，30分钟后，将异土木香内酯(isoalantolactone)(232.15mg，1mmol)溶解在CH2Cl2(3mL)中缓慢的加入到上述体系中，反应体系在室温下搅拌24小时，TLC监测反应完之后，加入饱和硫代硫酸钠水溶液，用CH2Cl2萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，过硅胶色谱柱(石油醚/乙酸乙酯＝5:1至2:1)得烯丙位氧化产物(产率50％)。1H NMR(400MHz,MeOD):δ＝5.96(s,1H),5.60(s,1H),4.88(s,1H),4.51-4.44(m,2H),4.15(s,1H),3.08-2.97(m,1H),2.36(dd,J＝12.5,1.5Hz,1H),2.04(dd,J＝15.6,1.4Hz,1H),1.69-1.59(m,4H),1.53(dd,J＝15.7,4.7Hz,1H),1.27-1.14(m,2H),0.70(s,3H).
室温下，将烯丙位氧化产物(125.3mg，0.5mmol)溶于CH2Cl2(2mL)中，分批加入m-CPBA(114.7mg，0.66mmol)，反应体系在室温下搅拌2h，反应混合物用饱和硫代硫酸钠溶液淬灭，收集的有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得粗品。柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝1：1)得到环氧化产物(产率72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝6.11(s,1H),5.56(s,1H),4.50(td,J＝4.8,1.4Hz,1H),3.42(t,J＝2.8Hz,1H),2.98-2.89(m,1H),2.80(d,J＝4.0Hz,1H),2.64(d,J＝4.0Hz,1H),2.37(s,1H),2.27(dd,J＝13.2,2.4Hz,1H),2.20(dd,J＝15.7,1.4Hz,1H),1.88-1.81(m,2H),1.74-1.64(m,1H),1.60-1.51(m,2H),1.40-1.33(m,1H),1.02-0.96(m,4H).
室温下，将环氧化产物(230mg,0.87mmol)和碳酸钾(3.6g,26mmol)依次加入反应瓶中，随后加入5毫升二氯甲烷作为溶剂，室温下加入氮甲基哌嗪(1.4mL,13mmol)。室温搅拌2小时后，TLC监测反应完成。砂芯漏斗过滤反应液，少量二氯甲烷(2毫升)洗涤滤饼，得到滤液。向滤液中加入5毫升饱和氯化钠，分液，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到迈克尔加成产物(产率：65％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝4.46(d,J＝1.5Hz,1H),3.41(t,J＝2.8Hz,1H),2.97-2.87(m,1H),2.80(d,J＝4.1Hz,1H),2.73-2.69(m,1H),2.64-2.39(m,12H),2.28(s,4H),2.24-2.14(m,2H),1.84-1.83(m,1H),1.71-1.63(m,1H),1.56-1.51(m,2H),1.38-1.32(m,1H),0.95(s,3H),0.70(q,J＝12.8Hz,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝177.56,77.84,72.58,61.26,54.87,52.99,52.76,49.80,45.87,45.36,41.60,39.32,37.34,34.92,34.38,26.94,18.02,16.12.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C20H33N2O4:365.2440；found:365.2441.
室温下，将迈克尔加成产物(233mg,mmol)溶于丙酮(8mL)中，然后加入富马酸(73mg，0.64mmol)。室温搅拌2个小时以后有白色固体析出。砂芯漏斗抽滤，乙酸乙酯洗涤滤饼得到化合物(IV)(产率：56％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝6.57(s,2H),4.48(s,1H),3.16-3.12(m,1H),2.77-2.47(m,13H),2.09(s,4H),1.98-1.94(m,1H),1.78-1.70(m,1H),1.63-1.53(m,2H),1.49(dd,J＝15.4,4.0Hz,1H),1.34-1.16(m,3H),0.84(s,3H),0.76-0.57(m,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ＝177.80,167.27,134.91,77.95,71.54,61.34,53.72,52.79,48.45,44.51,44.10,41.78,38.86,37.25,35.18,34.72,31.16,28.15,18.40,15.90.HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C20H33N2O4:365.2440；found:365.2443.
实施例5:式(I)化合物与DMA.MCL释放MCL比较试验
式(I)化合物在HEPES溶液中的释放试验：
溶液配制：
HEPES缓冲溶液(浓度：10mmol/L)：称取4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)237.9mg，加入新鲜的纯水，定容至100ml。用1mol/L的氢氧化钠溶液调至pH＝7.4，即得。
式(V)化合物溶液：称取式(V)化合物24.40mg，置50ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
试验步骤：
准确量取式(I)化合物溶液20μl，至PE管中，加入HEPES缓冲溶液980μl，混匀，立即放入37℃水浴中，分别于0、0.5、1、2、4、6、8、24小时时取样，测定。
实验仪器：
METTLER TOLEDO NewClassicMS电子天平；Waters高效液相色谱仪：AllianceWaters e2695 Separations Module、2998 PDA Detector检测器、Waters Empowers 3色谱工作站。
色谱条件:
色谱柱：ODS-SP，250×4.6mm，5μm、流动相A：乙腈-水-磷酸(10:90:0.1)、流动相B：乙腈-水-磷酸(70:30:0.1)、检测波长：210nm、流速：1.0ml/min。
梯度：
进样量：20μl。
试验结果：
式(I)化合物在HEPES溶液中释放趋势图见说明书附图图5。
DMA.MCL在HEPES溶液中的释放试验：
溶液配制：
HEPES缓冲溶液(浓度：10mmol/L):
称取4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)237.9mg，加入新鲜的纯水，定容至100ml。用1mol/L的氢氧化钠溶液调至pH＝7.4，即得。
ACT001溶液:
称取ACT001(批号：20170901)21.88mg，置50ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
试验步骤：准确量取ACT001溶液20μl，至PE管中，加入HEPES缓冲溶液980μl，混匀，立即放入37℃水浴中，分别于0、0.5、1、2、4、6、8、24小时时取样，测定。
实验仪器：METTLER TOLEDO NewClassic MS电子天平；Waters高效液相色谱仪：Alliance Waters e2695 Separations Module、2998 PDA Detector检测器、WatersEmpowers 3色谱工作站。
色谱条件:
色谱柱：ODS-SP，250×4.6mm，5μm；流动相A：乙腈-水-磷酸(10:90:0.1)；流动相B：乙腈-水-磷酸(70:30:0.1)；检测波长：210nm；流速：1.0ml/min。
梯度：
进样量：20μl。
试验结果：
DMA.MCL在HEPES溶液中释放趋势图见说明书附图图6。
本发明提供的(I)化合物释放MCL比DMA.MCL释放MCL的速度更慢。
实施例6:生物活性评价
细胞按常规方法进行复苏，传代：从液氮中取出冻存管，37℃水浴使冻存液融化，600～800r/min离心5min，弃上清液，U118MG的培养液为DMEM，用完全培养基重悬细胞，37℃、5％CO2环境下培养。
待细胞铺满培养皿底部70～80％时，吸弃培养液，用PBS缓冲液5～10ml清洗后加入0.25％胰酶1～2ml(能够铺满瓶底即可)消化，在培养箱中放置一段时间直至细胞变圆，立即加入完全培养基终止消化，合并消化细胞悬液，1000rpm/min离心5min，弃去上清，用完全培养基重悬细胞，轻轻吹散细胞，计数，定容到3000个cell/孔，每孔95μL，接种到96孔板中。
接种细胞后隔天加药，每个板分为空白组、阴性对照组和10个药物组，每个组6个复孔，每孔加药10μL，孵育72h，药物终浓度详见excel。孵育到相应时间，向每孔加入10μLCCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)，培养箱内孵育1-4h，酶标仪测定在450nm处的OD值，计算IC50。数据用EXCEL软件处理求解不同浓度下的抑制率，SPSS拟合IC50值。
抑制率％＝{1-(药物孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)}*100％
实验结果：
本发明的用途和方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。