创制植物单倍体诱导系的方法及其应用

文档序号：675153 发布日期：2021-04-30 浏览：13次 >En<

阅读说明：本技术 创制植物单倍体诱导系的方法及其应用 (Method for creating plant haploid induction line and application thereof ) 是由潘燕林丁琦谭超陈雅徐念李弘婧王文舒马崇烈于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本申请涉及创制植物单倍体诱导系的方法,其包括修饰植物中的CENH3基因,使其功能部分缺失。具体地,本申请涉及利用CRISPR/Cas9系统编辑水稻OsCENH3基因,从而产生水稻单倍体诱导系,其具有诱导单倍体产生的能力,这对于农业生产具有重要的意义。本申请还涵盖了利用单倍体诱导系诱导产生单倍体的方法以及单倍体诱导系用于育种、进行基因编辑、产生单倍体和产生新的单倍体诱导系的用途。(The present application relates to a method for creating a haploid inducer line of a plant, comprising modifying the CENH3 gene in the plant such that a functional part thereof is deleted. Specifically, the application relates to a rice OsCENH3 gene edited by a CRISPR/Cas9 system, so that a rice haploid induction line is generated, and the rice haploid induction line has the capability of inducing haploid generation, and has important significance for agricultural production. Also encompassed by the present application are methods of inducing haploid production using haploid inducer lines and the use of haploid inducer lines for breeding, gene editing, haploid production and the production of new haploid inducer lines.)

创制植物单倍体诱导系的方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域。具体地，本申请涉及创制植物单倍体诱导系的方法及其应用，特别涉及通过基因编辑CENH3基因而创制植物单倍体诱导系，从而应用于植物育种。

背景技术

双单倍体育种技术，是利用自发或人工诱导产生的单倍体植株加倍后获得纯合的二倍体，再从中选育目标株系的育种技术。该技术较传统的选育技术而言，具有缩短育种周期、提高育种效率的优势。从玉米的自然突变体中获得的-单倍体诱导系Stock6，具有作为父本诱导母本单倍体产生的能力，由Stock6派生出的一系列诱导系已经成功运用于商业化育种。而水稻的单倍体育种工作目前还主要依靠花粉离体培养或远源杂交等方式，受到诱导效率、基因型等因素制约，在育种上的应用很受限，当然，也有通过基因编缉技术编缉OsMATL基因，获得作为父本的单倍体诱导系(刘君涛等，2018)的报道，但也存在较多的不足之处。

CENH3广泛地存在于真核生物中，CENH3基因编码着丝粒特异性组蛋白3，是着丝粒的重要组成部分，在细胞有丝分裂和减数分裂时发挥重要作用。植物中,科学家最早从拟南芥中克隆了CENH3基因,之后相继从水稻、甘蔗、烟草、大麦、玉米、胡萝卜等植物中克隆了CENH3基因。对不同物种的CENH3氨基酸序列进行比较发现,CENH3的氨基端尾变异性很高,而羧基端组蛋白折叠区(histone fold domain,HFD)相对保守 (Britt和Kuppu,2016)。HFD区的Loop 1和α2螺旋负责将CENH3靶标到着丝粒上,因此被命名为CENP-A靶标区域(CENP-A target domain, CATD)。CENH3的翻译后修饰通常发生在其氨基端尾巴上(Bailey et al., 2013)。N端尾巴结构域和HFD结构域对于CENH3正常功能的发挥都有重要作用。

2010年,在进行拟南芥cenh3突变体的互补实验中,研究者将GFP与其CENH3融合,融合蛋白在cenh3突变体中表达后能够有效的互补其不育的表型。将GFP、组蛋白H3.3的N端尾巴与CENH3 HFD区融合,得到 GFP-tailswap蛋白,同样可以挽救cenh3突变体的胚性致死表型,该 GFP-tailswap株系高度的雄性不育,其自交后代都是正常的二倍体。作为父本与野生型植株杂交后,后代有34％的个体为单倍体(Ravi和Chan, 2010)。Maheshwari等人将GFP-CENH3、来自葡萄和玉米的CENH3引入拟南芥cenh3突变体中,这些不同版本的CENH3均能够互补cenh3突变体表型。将2个不同来源的CENH3的N末端尾巴或HFD区域调换后获得的是无功能或低效能的等位基因(Maheshwari等人，2015)。

通过TILLING(targeting induced local lesionsin genomes)技术将大麦的HvβCENH3上92位的亮氨酸(Leu,L)突变成苯丙氨酸(Phe,F),使得 CENH3不能装载到着丝粒上。另外,甜菜和AtCENH3中相应的氨基酸L 突变成F,也得到了相似的结果。AtCENH3(L130F)可以使cenh3突变体恢复正常育性,作为母本与野生型植株杂交后获得4.8％的单倍体诱导效率 (Karimi-Ashtiyani等人，2015)。Kuppu等人通过TILLING技术对拟南芥CENH3的HFD区域保守位点的氨基酸进行了点突变,P82S、A86V、G83E、 A132T和A136T位点的氨基酸变化都能够互补cenh3突变体的不育表型, 且这些植株都能自交产生正常的后代,它们与野生型株系杂交后能获得效率不等的单倍体后代(Kuppu等人，2015)。另外,分别以玉米的CENH3 RNAi和Knock-out株系为受体,导入修饰后的CENH3变体,获得单倍体诱导系。其中RNAi背景的单倍体诱导系效率只有0.16％,而Knock-out背景诱导系的单倍体诱导率最高达到了3.6％。这也是首次在作物中编辑 CENH3后得到单倍体诱导系的文献报导(Kelliher等人，2016)。

发明内容

本申请的发明人首次利用基因编缉技术，尤其是CRISPR/Cas9技术，编缉CENH3基因，尤其是OsCENH3基因，成功地创制了植物例如水稻单倍体诱导系，其实现了良好的单倍体诱导效果。

在第一方面中，本申请提供了创制植物单倍体诱导系的方法，其包括修饰植物中的CENH3基因，使其功能部分缺失。

在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，所述植物为水稻，并且所述CENH3基因为 OsCENH3基因。

在一些实施方案中，所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、TALEN、大范围核酸酶和ZFN，

在一些实施方案中，所述基因编辑通过CRISPR/Cas9进行。所述 CRISPR/Cas9包含Cas9，优选地，所述Cas9包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％或99％序列同一性的变体序列。所述CRISPR/Cas9包含导向RNA(sgRNA)，优选地，所述sgRNA靶向 OsCENH3基因的4号外显子。

在一些实施方案中，经修饰的OsCENH3基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQID NO:10、12、14、16、18和20中任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％或99％序列同一性的变体序列，或者编码SEQ ID NO:11、13、15、17、19和21中任一项所示的氨基酸序列的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％或99％序列同一性的变体序列。

在第二方面中，本申请提供了在植物中诱导单倍体的方法，其包括将通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系作为父本或母本，与另外的母本或父本杂交，从而产生单倍体后代。

在优选的实施方案中，所述植物为水稻。

在第三方面中，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系用于育种或者进行基因编辑的用途。

在第四方面中，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系用于产生单倍体的用途。

在第五方面中，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系用于产生新的单倍体诱导系的用途，其中所述单倍体诱导系中的经修饰的CENH3基因通过杂交转育的方法而转到其它植物品系中，从而产生新的单倍体诱导系。

在第六方面中，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系。在优选的实施方案中，所述单倍体诱导系为水稻单倍体诱导系。

在第七方面中，本申请提供了通过第六方面所述的单倍体诱导系产生的种子。在优选的实施方案中，所述种子中的经修饰的CENH3基因为纯合的。

在第八方面中，本申请提供了通过第二方面所述的方法产生的单倍体植物。在优选的实施方案中，所述单倍体植物为单倍体水稻。

在第九方面中，本申请提供了通过第八方面所述的单倍体植物产生的种子。

在第十方面中，本申请提供了水稻突变型OsCENH3基因，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:10、12、14、16、18和20中任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％或99％序列同一性的变体序列，或者编码SEQ ID NO:11、13、15、17、19和21中任一项所示的氨基酸序列的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％或99％序列同一性的变体序列。

在第十一方面中，本申请提供了能够靶向水稻OsCENH3基因的 sgRNA，其包含SEQID NO:7所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列组成。

附图说明

图1显示了本申请实施例1中构建的编辑载体pZZT000431的图谱。

图2显示了本申请实施例4中的花粉的碘化钾染色图，左图为E1代水稻编缉植株的花粉碘化钾染色图，右图为野生型植株的花粉碘化钾染色图。

图3显示了本申请实施例4中的结实率统计图，横坐标从左到右依次显示的是：-3表示OsCENH3基因如SEQ ID NO:10所示的E1代水稻编缉植株；-6表示OsCENH3基因如SEQID NO:12所示的E1代水稻编缉植株；-12 表示OsCENH3基因如SEQ ID NO:14所示的E1代水稻编缉植株；-18表示 OsCENH3基因如SEQ ID NO:16所示的E1代水稻编缉植株；-24表示OsCENH3基因如SEQ ID NO:18所示的E1代水稻编缉植株；-27表示OsCENH3基因如SEQ IDNO:20所示的E1代水稻编缉植株；CK表示同一品种的非编辑植株对照。

图4显示了本申请实施例6中的单倍体和二倍体，其中A显示了单倍体和二倍体植株的表型，B显示了单倍体和二倍体植株的流式细胞仪检测结果。

图5显示了本申请实施例6中的单倍体诱导率统计情况。

详细描述

提供以下定义和方法以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，本申请的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

定义

本文使用的术语“基因编辑(gene editing)”或“基因组编辑(genome edting)”，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑指能够对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂 (DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR) 来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。

本文使用的术语“CRISPR/Cas9”是指使用RNA引导链靶向内切核酸酶切割位点的内切核酸酶。参见，Jinek等人，Science 337:816-821(2013)； Cong等人，Science(2013年1月3日)；和Mali等人，Science(2013 年1月3日)。

本文使用的术语“CRISPR/Cpf1”是一类新型的CRISPR-Cas系统。目前得到广泛应用的CRISPR/Cas9系统经常会发生脱靶效应。作为 CRISPR/Cas9系统的一种潜在的对手，CRISPR-Cpf1系统作为基因编辑的新工具，进一步扩大了基因编辑靶位点的选择范围，同时几乎没有脱靶效应。Cpf1是一种新型CRISPR效应蛋白，具有许多与Cas9不同的特性，有利于克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制。

本文使用的术语“转录激活子样效应器核苷酶”或“TAL效应器核苷酶”或“TALEN”是指一类通过使TAL效应器DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制内切核酸酶。

本文使用的术语“锌指核酸酶(ZFN)”由一个DNA识别域以及一个DNA剪切域组成。DNA识别域为3～4个ZF串联结构，每个ZF约含30个氨基酸，被1个锌离子所固定，可识别并结合1个特异的三联体碱基，DNA剪切域由非特异性核酸内切酶Fok I羧基端的96个氨基酸残基组成。每个Fok I单体与1个ZFP相连构成1个ZFN，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时(6～8bp)，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导DNA定点剪切。

本文使用的术语“大范围核酸酶(meganuclease)”是指能够识别14-40 碱基长度的核酸序列的归巢核酸内切酶。一些大范围核酸酶可以容忍小的归巢位点序列差异，大的识别区域仍然能够保证这些酶的高度特异性，而这反过来又可保持低水平的基因组内非特异性裂解和较低的毒性。大范围核酸酶由自我剪接RNA内含子或自我剪接蛋白内含子序列的移动序列内的开放阅读框架编码。

本文使用的术语“同一性”百分比，在两个或更多个核酸的情况下，指相同或具有相同核苷酸的指定百分比(即在指定区域内，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，约60％的同一性，优选65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更高的同一性)的两条或更多条序列或亚序列，如利用BLAST 或BLAST 2.0序列比较算法以默认参数或通过手工比对和可视检查(参阅如NCBI网站等)所测量的。

具体实施方式

通过本申请的创制植物单倍体诱导系的方法所产生的单倍体诱导系，将其用作父本或母本，与其他自交系品系进行杂交，母本上结出的种子包括二倍体和只含母本染色体的单倍体的种子。单倍体的种子可以通过细胞学检测、表型分析或分子标记检测与二倍体的种子区分。

单倍体诱导系对育种具有重要的作用，能够使得纯合速度提升，缩短育种时间，提高育种效率。本申请中的单倍体诱导系为编缉自身基因的突变体，不携带转基因成分，便于大田种植和管理，可以降低育种成本。

在第一方面中，本申请提供了创制植物单倍体诱导系的方法，其包括修饰植物中的CENH3基因，使其功能部分缺失。

在一些实施方案中，修饰导致CENH3基因发生缺失或插入突变。

在一些实施方案中，修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，植物为水稻。水稻可以包括但不限于籼稻和粳稻，并且CENH3基因为OsCENH3基因。

在一些实施方案中，OsCENH3基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、 99.5％或99.9％序列同一性的变体序列，或者编码SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的变体序列。

本文中使用的“变体序列”是指与原序列具有一定序列同一性，并且保留原序列的功能的序列。举例来说，此处的包含变体序列的 OsCENH3基因可以来自其他水稻品系，但仍编码功能性OsCENH3蛋白。

在一些实施方案中，基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、TALEN、大范围核酸酶和ZFN。

在优选的实施方案中，基因编辑通过CRISPR/Cas9进行。本领域公知，CRISPR/Cas9包含Cas9和导向RNA(sgRNA)，sgRNA能够引导 Cas9内切核酸酶特异性识别和修饰sgRNA所靶向的目标序列。在本申请中，Cas9可以包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少 90％、95％或99％序列同一性的变体序列。期望的sgRNA可以靶向 OsCENH3基因的4号外显子。优选地，sgRNA靶向SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，sgRNA包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在一些实施方案中，经修饰的OsCENH3基因包含以下序列或由以下序列组成：SEQID NO:10、12、14、16、18和20中任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的变体序列，或者编码SEQ ID NO:11、13、15、17、19和21中任一项所示的氨基酸序列的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的变体序列。

在一些实施方案中，植物为水稻。水稻可以包括但不限于籼稻或粳稻。

在一些实施方案中，另外的母本或父本可以包括但不限于籼稻雄性不育系X17和BAD2纯合突变体，该突变体是以粳稻自交系KY131为背景的。

在第三方面中，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系用于育种或者进行基因编辑的用途。

在第四方面中，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系用于产生单倍体的用途。

在第六方面中，本申请提供了通过第一方面所述的方法创制的单倍体诱导系。在优选的实施方案中，所述单倍体诱导系为水稻单倍体诱导系。

在第七方面中，本申请提供了通过第六方面所述的单倍体诱导系产生的种子。在优选的实施方案中，所述种子中的经修饰的CENH3基因为纯合的。

在第八方面中，本申请提供了通过第二方面所述的方法产生的单倍体植物。在优选的实施方案中，所述单倍体植物为单倍体水稻。

在第九方面中，本申请提供了通过第八方面所述的单倍体植物产生的种子。

在第十方面中，本申请提供了水稻突变型OsCENH3基因，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:10、12、14、16、18和20中任一项所示的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的变体序列，或者编码SEQ ID NO:11、13、15、17、19和 21中任一项所示的氨基酸序列的核苷酸序列或与其具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％、99.5％或99.9％序列同一性的变体序列。

在第十一方面中，本申请提供了能够靶向水稻OsCENH3基因的 sgRNA，其包含SEQID NO:7所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列组成。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

实施例

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中使用的植物材料包括梗稻自交系KY131和籼稻雄性不育系X17，均由中国种子集团有限公司提供。

以下实施例中使用的引物均利用European research infrastructure forbiological information(ELIXIR)的Primer3 web service设计，由上海生工公司合成。

实施例1 CRISPR/Cas9编缉载体的构建

构建载体及鉴定的一般方法为本领域技术人员所熟知。具体而言， CRISPR/Cas9载体中，改进版的Cas9在羧基端融合了核定位信号 (OsHAT-NLS)，并根据水稻中表达模式进行密码子优化，以甘蔗泛素化酶启动子SspUbi4驱动Cas9表达。改进并优化的Cas9的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。粳稻自交系KY131中OsCENH3基因序列由内部基因组测序数据获得，并经过再次克隆测序验证。OsCENH3基因的编辑位点在 OsCENH3蛋白的氨基端和羧基端的连接位置(4号外显子区域)产生碱基的插入或缺失突变以获得功能没有完全失活的3n indels突变体。

选择NGG(其中N为任意核苷酸)上游临近的20个核苷酸，将核心 12个核苷酸序列(紧邻NGG的12个核苷酸)连同NGG共15个核苷酸在 NCBI数据库中进行BLAST分析，兼顾已有基因组信息的多个水稻基因组，包括籼稻和粳稻，确保在水稻基因组中只有唯一的精确匹配。根据上述序列信息设计了导向RNA(sgRNA)(SEQ ID NO:7)，sgRNA是由引导RNA(gRNA)和骨架RNA(gRNA scaffold)核苷酸序列连接起来的一个整体分子，用水稻U3启动子驱动sgRNA表达。最终设定的sgRNA由金斯瑞公司(www.genscript.com)提供全序列合成。最后选定的由gRNA所靶向的靶位点序列如下：

ACCGCTTCCGTCCAGGCACAG(SEQ ID NO:6，靶向4号外显子)。

烟草花叶病毒启动子CaMV35S驱动的草甘膦抗性基因(CP4)作为转基因筛选标记。由此构建了编辑载体，命名为pZZT000431，其图谱参见图1。

实施例2梗稻自交系KY131的遗传转化

将构建好的编缉载体pZZT000431转化农杆菌EHA105(华中农业大学馈赠)并进行测序鉴定。由梗稻自交系KY131种子诱导产生胚性愈伤组织，与含有编缉载体pZZT000431的农杆菌EHA105共同孵育，经过筛选再生等一系列步骤完成遗传转化。农杆菌侵染水稻愈伤组织及筛选、分化流程参照Nishimura等的文献报道(A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.Nature protocols,2006,6: 2 796-2 802)。具体流程包括，水稻愈伤组织与农杆菌共培养3天后，将愈伤组织于250mg/L Carbenicillin的ddH₂O中浸泡30min，去除多余的农杆菌后置于含250mg/L Carbenicillin的筛选培养基上筛选3轮，然后将抗性愈伤转移至再生培养基上培养4周，最后将再生小苗转移至生根培养基中继续培养2周。

水稻愈伤和植株再生条件：愈伤诱导30天，愈伤继代培养14天，筛选培养42天，以上处理均在暗室进行；再生培养28天，生根培养14 天均在明室进行，条件为16小时光照8小时黑暗，温度为26摄氏度。

实施例3 OsCENH3基因编缉水稻E0转化事件的筛选和鉴定

将实施例2中的再生植株送至温室种植，取再生的E0代小苗叶片，通过CTAB法提取植物基因组DNA。DNA样品用荧光定量PCR方法进行拷贝数的检测，同时用简单序列重复(simple sequence repeat，SSR) 标记检测方法(请参考Simple Sequence RepeatMarkers in Genetic Divergence and Marker-Assisted Selection of RiceCultivars:A Review Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2015 55:41–49)和测序检测突变位点的碱基变化情况。

具体地，选取编缉载体pZZT000431上的筛选标记基因CP4作为拷贝数检测基因，设计该基因的200bp大小的扩增引物(SEQ ID NO:2和 3)，于荧光定量PCR仪上进行扩增和荧光值检测，参照CT值，估计植株对应的拷贝数(结果未示出)。在进行SSR检测实验中，在靶位点上下游设计350-500bp大小的引物对(SEQ ID NO:8和9，其中SEQ ID NO: 8的5’端标记上了荧光标记羧基荧光素(FAM))，扩增目标区域跨越切割位点，使用高保真Q5 DNA聚合酶(NEB)进行扩增，扩增片段稀释至150倍后，取1μl稀释产物与9μl HiDi试剂混合，上机ABI3730检测片段长度，根据未编辑对照样品的片段长度，计算出编缉材料对应的插入或缺失碱基数目。在进行测序的实验中，在靶标位点上下游设计500bp 扩增片段大小的引物对，且引物应距离编缉位点大于100bp(SEQ ID NO: 8和9)，使用高保真Q5 DNA聚合酶进行扩增，随后上机ABI3730进行测序。

选取低拷贝且至少一条染色体发生突变的植株作为候选编缉植株，在温室进一步培养和育种。

扩增靶位点所用的引物对：

CENH3 target4-F:CGCTTCCGTCCAGGCACAG(SEQ ID NO:8)

CENH3 target4-R:GAATAGAAATCAGTGATCTCCC(SEQ ID NO: 9)；

F：CAGCACAGGTTAAGTCTG(SEQ ID NO:2)

R：GTCTGTCTCAACGGTAAG(SEQ ID NO:3)。

实施例4 E1代水稻编缉植株的基因型和表型鉴定

OsCENH3基因完全失活后会导致植株不育，因此只改变了部分功能的突变体才能结实。收取可育植株E0代种子进行种植，在E1代分离出 GMO阴性且编缉纯合的植株进行种植。GMO检测方法请参见中国国家标准农业部953号公告6-2007号公告GB/T 19495—2004转基因产品检测标准。通过测序鉴定出靶标位置处碱基的缺失数目均为3的倍数，OsCENH3基因碱基及氨基酸变化见SEQ ID NO:10-21。

E1代植株的基本农艺性状，包括株高、分蘖数、叶长叶宽等均与野生型植株相似。

花粉活力检测通过碘化钾染色进行检测。收集稻穗的上、中、下部位各一个小穗，将花粉抖落至载玻片上，加入碘化钾染色液染色，在显微镜下观察花粉染色情况，统计被染色花粉的比例。统计发现E1 3n indels 编缉植株的花粉与野生型植株(即野生型水稻KY131)的花粉活力存在差异，花粉活力降低了10％左右。选取E1代植株的主分蘖，统计主分蘖上饱满籽粒和空壳的数量，用以下公式计算结实率：

结实率＝饱满籽粒数量/(饱满籽粒数量+空壳数量)×100％。

通过统计不同E1代植株的结实率和编缉类型，发现在3n indels突变体中，突变体的结实率较野生型植株的结实率下降了10-20％(图4)。

实施例5水稻单倍体诱导系与不同品系的杂交

种植E1代编缉植株的种子，苗期经GMO、SSR和测序检测，保留不含转基因成分的纯合突变体(3n indels)作为杂交亲本。播种不同批次的籼稻雄性不育系X17材料，选择合适于杂交的批次用于实验。具体地，当突变体作为父本时，母本材料为籼稻雄性不育系X17，实验前一天将已开花的母本小穗剪掉，套袋。实验当天10时左右，突变体开花较盛时，将父本的小穗与母本靠近，花粉抖落至母本柱头上，套袋标注好授粉时间及父母本信息，待成熟后收种。以突变体作为母本时，BAD2纯合突变体作为父本，前一天将母本已开花的小穗去除，未开花小穗剪去颖花上部至花药刚好破，用装有干净水的喷雾器持续喷淋至整个花药浸没在水中，20min后轻弹去除水分，再用镊子将花药夹出，再喷一次水，使得颖壳中剩余花药完全失活，套袋。实验当天10时左右，将父本的小穗与已去雄的母本靠近，花粉抖落至母本柱头上，套袋标注好授粉时间及父母本信息，待成熟后收种。

实施例6水稻单倍体诱导系诱导单倍体效果的检测

将实施例5中得到的种子全部播种，去除未萌发的种子，所有成活的植株均取样进行检测。首先通过SSR测定杂交种子数和自交种子数，然后利用流式细胞仪进行倍性检测。具体地，以能出苗的种子数来作为总数，所有的苗都经过SSR检测，排除真的杂交种(SSR结果为杂合) 和自交种(SSR纯合，与母本基因型一致)后剩余的植株(初步认为是单倍体或单倍体加倍的双单倍体)进行流式细胞仪倍性检测。单倍体和二倍体植株表型和流式细胞仪检测结果分别见图4中的A和B。检测结果表明，CENH3(-3)突变体的单倍体诱导率为6.7％(图5)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请的技术方案作了详尽的描述，但在这些技术方案的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

本申请中使用的序列如下：

SEQ ID NO:1

在水稻中表达的Cas9的核苷酸序列

ATGCCGAAGAAGCGCCGCCGCGTGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTCGACAT CGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCGT CCAAGAAGTTCAAGGTGCTCGGCAACACCGACCGCCACTCCATCAAGAAGAA CCTCATCGGCGCCCTCCTCTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGCC TCAAGCGCACCGCCCGCCGCCGCTACACCCGCCGCAAGAACCGCATCTGCTAC CTCCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCA CCGCCTCGAGGAGTCCTTCCTCGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGCCAC CCGATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCGAC CATCTACCACCTCCGCAAGAAGCTCGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTCC GCCTCATCTACCTCGCCCTCGCCCACATGATCAAGTTCCGCGGCCACTTCCTCA TCGAGGGCGACCTCAACCCGGACAACTCCGACGTGGACAAGCTCTTCATCCAG CTCGTGCAGACCTACAACCAGCTCTTCGAGGAGAACCCGATCAACGCCTCCGG CGTGGACGCCAAGGCCATCCTCTCCGCCCGCCTCTCCAAGTCCCGCCGCCTCG AGAACCTCATCGCCCAGCTCCCGGGCGAGAAGAAGAACGGCCTCTTCGGCAAC CTCATCGCCCTCTCCCTCGGCCTCACCCCGAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTC GCCGAGGACGCCAAGCTCCAGCTCTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTCGA CAACCTCCTCGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTCTTCCTCGCCGCCA AGAACCTCTCCGACGCCATCCTCCTCTCCGACATCCTCCGCGTGAACACCGAG ATCACCAAGGCCCCGCTCTCCGCCTCCATGATCAAGCGCTACGACGAGCACCA CCAGGACCTCACCCTCCTCAAGGCCCTCGTGCGCCAGCAGCTCCCGGAGAAGT ACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTCGAGAA GATGGACGGCACCGAGGAGCTCCTCGTGAAGCTCAACCGCGAGGACCTCCTCC GCAAGCAGCGCACCTTCGACAACGGCTCCATCCCGCACCAGATCCACCTCGGC GAGCTCCACGCCATCCTCCGCCGCCAGGAGGACTTCTACCCGTTCCTCAAGGA CAACCGCGAGAAGATCGAGAAGATCCTCACCTTCCGCATCCCGTACTACGTGG GCCCGCTCGCCCGCGGCAACTCCCGCTTCGCCTGGATGACCCGCAAGTCCGAG GAGACCATCACCCCGTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCG CCCAGTCCTTCATCGAGCGCATGACCAACTTCGACAAGAACCTCCCGAACGAG AAGGTGCTCCCGAAGCACTCCCTCCTCTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGA GCTCACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGCAAGCCGGCCTTCCTCT CCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACCAACCGCAA GGTGACCGTGAAGCAGCTCAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCG ACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGCTTCAACGCCTCCCTCGGCACC TACCACGACCTCCTCAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTCGACAACGAGGA GAACGAGGACATCCTCGAGGACATCGTGCTCACCCTCACCCTCTTCGAGGACC GCGAGATGATCGAGGAGCGCCTCAAGACCTACGCCCACCTCTTCGACGACAAG GTGATGAAGCAGCTCAAGCGCCGCCGCTACACCGGCTGGGGCCGCCTCTCCCG CAAGCTCATCAACGGCATCCGCGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTCGACT TCCTCAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGCAACTTCATGCAGCTCATCCACGAC GACTCCCTCACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGG CGACTCCCTCCACGAGCACATCGCCAACCTCGCCGGCTCCCCGGCCATCAAGA AGGGCATCCTCCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAGGTGATGGG CCGCCACAAGCCGGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGCGAGAACCAGACC ACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAGCGCATGAAGCGCATCGAGGAGG GCATCAAGGAGCTCGGCTCCCAGATCCTCAAGGAGCACCCGGTGGAGAACAC CCAGCTCCAGAACGAGAAGCTCTACCTCTACTACCTCCAGAACGGCCGCGACA TGTACGTGGACCAGGAGCTCGACATCAACCGCCTCTCCGACTACGACGTGGAC CACATCGTGCCGCAGTCCTTCCTCAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCT CACCCGCTCCGACAAGAACCGCGGCAAGTCCGACAACGTGCCGTCCGAGGAG GTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGCCAGCTCCTCAACGCCAAGCTCAT CACCCAGCGCAAGTTCGACAACCTCACCAAGGCCGAGCGCGGCGGCCTCTCCG AGCTCGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGCCAGCTCGTGGAGACCCGCCAGATC ACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTCGACTCCCGCATGAACACCAAGTACGACGA GAACGACAAGCTCATCCGCGAGGTGAAGGTGATCACCCTCAAGTCCAAGCTCG TGTCCGACTTCCGCAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGCGAGATCAACAAC TACCACCACGCCCACGACGCCTACCTCAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTCAT CAAGAAGTACCCGAAGCTCGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGT ACGACGTGCGCAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCAC CGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCAC CCTCGCCAACGGCGAGATCCGCAAGCGCCCGCTCATCGAGACCAACGGCGAG ACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGCGACTTCGCCACCGTGCGCAAGGTGCTCTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGC GGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTCCCGAAGCGCAACTCCGACAAGCTCATCGC CCGCAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCGACC GTGGCCTACTCCGTGCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAA GCTCAAGTCCGTGAAGGAGCTCCTCGGCATCACCATCATGGAGCGCTCCTCCT TCGAGAAGAACCCGATCGACTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAA GAAGGACCTCATCATCAAGCTCCCGAAGTACTCCCTCTTCGAGCTCGAGAACG GCCGCAAGCGCATGCTCGCCTCCGCCGGCGAGCTCCAGAAGGGCAACGAGCTC GCCCTCCCGTCCAAGTACGTGAACTTCCTCTACCTCGCCTCCCACTACGAGAAG CTCAAGGGCTCCCCGGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTCTTCGTGGAGCAGC ACAAGCACTACCTCGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGC GTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAGGTGCTCTCCGCCTACAACAAGCA CCGCGACAAGCCGATCCGCGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTCTTCACCC TCACCAACCTCGGCGCCCCGGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGAC CGCAAGCGCTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTCGACGCCACCCTCATCCACCA GTCCATCACCGGCCTCTACGAGACCCGCATCGACCTCTCCCAGCTCGGCGGCG A C

SEQ ID NO:2

引物F

CAGCACAGGTTAAGTCTG

SEQ ID NO:3

引物R

GTCTGTCTCAACGGTAAG

SEQ ID NO:4

野生型水稻OsCENH3基因序列

ACGCCGCTTCAGTTTGAAAACCCACCGCCACGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG CCGCCGACGCCGAGATGGCTCGCACGAAGCACCCGGCGGTGAGGAAGTCGAA GGCGGAGCCCAAGAAGAAGCTCCAGTTCGAACGCTCCCCTCGGCCGTCGAAG GCGCAGCGCGCTGGTGGTGAGCGCGCGCTCTCTCCCCCTCTGCGTTTCTTTTTT TTTTTCCTTTTTCTTTCAATGGCGGTGGATGGTGAAGCTTATGCCCCCCCCCCCC CCTTCCCGCCTCTTGCTTGTCCCCTTTGCAGGCGGCACGGGTACCTCGGCGACC ACGGTGCGTGCGGGAGCGGGTCTTTCGTTTGGTGATTTTTTGATTTTGTGGGGG GATATGTTTTTGTTTTGTATCTTGGCTGGATGGATGGCTTGCTCACCACCTGTTTG ATGGAATGCAGAGGAGCGCGGCTGGAACATCGGCTTCAGGTGCGTTCTCTTGG GGGGGTTTCTAGGGTTATTCATGGGCTCGTTGGAGCTTTTCCTTTCTGTCTCTTG GATTCCGGGGGACCTGAGGGGCTCAATGTGTCCCTTTTCTTGCTCTGTTTTACCG TGTGCTGTACTTTCCTCATCGTTGTTTTCTGAATATATTATAAGAACAGTAGTTGC AGAAAGATCTTCAATTGCTCATCAGTCAAAGCTTTTCTTGTTTTCATTCTGAAAT AATAGCAAATCCAGTTTGGTCCATGGAGGGGTTATCTGAAACATTATGACCATAA AACATGGTATTAAGCATTGCTAGCCAAGAAATGTGTGGTTTTTAGACACGATGTTGATAGGTGATTTTTATGCTCATCCATTATTAGTCTTTGCATCGTGGGAACTGATTT AGTAAACTTTCTTTAGTGTCATGGTTCAAATAGCGTCTGTTCTACCTAGATGATA GGTATCCATATGGAAGTCTTGGCTTTGGAATTGCTCTCCTTTTGTTCTCCTGTGAT TAAATAACTTTAACATGTGTGTGAAGCAGGGACGCCTAGGCAGCAAACGAAGC AGAGGAAGCCACACCGCTTCCGTCCAGGCACAGTGGCACTGCGGGAGATCAG GAAATTTCAGAAAACCACCGAACTGCTGATCCCGTTTGCACCATTTTCTCGGCT GGTGGGTACATCCTGAACCTGCCTTCTCTCTATATCAAATATTTCGTAGTGCAAA CTTGTGTGATGGAAGCTTTTTGTGCCGATAAAATTTGCAGGTCAGGGAGATCAC TGATTTCTATTCAAAGGATGTGTCACGGTGGACCCTTGAAGCTCTCCTTGCATTG CAAGAGGTCAGTGGTCAAACCTGTTTATTATAAGTTTACAACTGATGGCTTAGTT AGGGAAGGGTCAGACTGAATTATACTGTTTAAATTCCATTCTGCTTCAAGACTCA AGTCACGGCTCAAGAGTGTAACTGAAAAATGTACAAATCTTCCATGATCAATAA AATGAATATCTCTGTGTGTTGATTTATGAGTCAGATTGCTAAATTATTATCCTTTTT CAGTAGAACACCTATATACTACAAATATGCAACCTCCCTATTTTGTTGTGTCTGTT CAAGATTGCTATCATAGAGTATACCAATTTCAGTTCCTTCTTTCCAGCCATGTCTGTTTCTGCATAACCAGGAAAAGGAACAAAGAGCTGACTTAATTCTCACAAAATAA ATTATGTTATTTACTTGCTGTCCTGCAAATTTCCAGTGGTTTTCCCTCTCCTGCAG GCAGCAGAATACCACTTAGTGGACATATTTGAAGTGTCAAATCTCTGCGCCATCC ATGCTAAGCGTGTTACCATCAGTAAGTTGTCATTCTGAATGAACTTTTCTCTTTCT TTTTCTCCCTTTATATTATTATGCTAAATGGATATCATATATGCCACAGCCTACATGA TATCATATACGCATCCACTTCAAAAGCATTCTATTTTTTTATAGGAATAACATTCTA ATTGCAGGATGATTCTTAATACATGTGTTTATATTTAATGTCATATCTAGTTTTCAT ACTCTTAAATTTATCATGATTATTGATTAAACATAGGGAGAATTAGTTGGTTTGTGAGTTTTGAGGTGTGAAATATGCTGCTTGCTATTCCCTGTAAAGCTTATCAGCGTT GTCATTGTGTGGTTTAACAAATAAACGTTTGTTCTGCAGTGCAAAAGGACATGC AACTTGCCAGGCGTATCGGTGGGCGGAGGCCATGGTGAAAATTTGTTTGCGAGC CATGCAGCATGATGGACAAGGAGCAACATGTGTCGTTGATTAACATTTTAGAAA GTAGTGTAGATGTATCTTCACATAGGGATCAACTTACCCTTCGTTCCCATTCTAAT TCAGTTGATGTTAGTATTTACCTTTTGCTCCATTTGGATTGGTCGAATTCAGGATT TCATCAAACAGTCGATTGTGAAATGTGAACCAGGAATTGTTGTGTTGATTGCAAT AATGGGTTCCTCTCACCTGCTTCTTCCATC

SEQ ID NO:5

野生型水稻OsCENH3蛋白序列

MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSPRPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASAG TPRQQTKQRKPHRFRPGTVALREIRKFQKTTELLIPFAPFSRLVREITDFYSKDVSRW TLEALLALQEAAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQLARRIGGRRPW

SEQ ID NO:6

编辑载体pZZT000431所靶向的靶位点序列(靶向4号外显子)

ACCGCTTCCGTCCAGGCACAG

SEQ ID NO:7

导向RNA(sgRNA)的核苷酸序列

ACCGCTTCCGTCCAGGCACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT

SEQ ID NO:8

引物CENH3 target4-F

CGCTTCCGTCCAGGCACAG

SEQ ID NO:9

引物CENH3 target4-R

GAATAGAAATCAGTGATCTCCC

SEQ ID NO:10

CENH3(-3)核苷酸序列

ACGCCGCTTCAGTTTGAAAACCCACCGCCACGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG CCGCCGACGCCGAGATGGCTCGCACGAAGCACCCGGCGGTGAGGAAGTCGAA GGCGGAGCCCAAGAAGAAGCTCCAGTTCGAACGCTCCCCTCGGCCGTCGAAG GCGCAGCGCGCTGGTGGTGAGCGCGCGCTCTCTCCCCCTCTGCGTTTCTTTTTT TTTTTCCTTTTTCTTTCAATGGCGGTGGATGGTGAAGCTTATGCCCCCCCCCCCC CCTTCCCGCCTCTTGCTTGTCCCCTTTGCAGGCGGCACGGGTACCTCGGCGACC ACGGTGCGTGCGGGAGCGGGTCTTTCGTTTGGTGATTTTTTGATTTTGTGGGGG GATATGTTTTTGTTTTGTATCTTGGCTGGATGGATGGCTTGCTCACCACCTGTTT GATGGAATGCAGAGGAGCGCGGCTGGAACATCGGCTTCAGGTGCGTTCTCTTG GGGGGGTTTCTAGGGTTATTCATGGGCTCGTTGGAGCTTTTCCTTTCTGTCTCTT GGATTCCGGGGGACCTGAGGGGCTCAATGTGTCCCTTTTCTTGCTCTGTTTTACCGTGTGCTGTACTTTCCTCATCGTTGTTTTCTGAATATATTATAAGAACAGTAG TTGCAGAAAGATCTTCAATTGCTCATCAGTCAAAGCTTTTCTTGTTTTCATTCTG AAATAATAGCAAATCCAGTTTGGTCCATGGAGGGGTTATCTGAAACATTATGA CCATAAAACATGGTATTAAGCATTGCTAGCCAAGAAATGTGTGGTTTTTAGAC ACGATGTTGATAGGTGATTTTTATGCTCATCCATTATTAGTCTTTGCATCGTGG GAACTGATTTAGTAAACTTTCTTTAGTGTCATGGTTCAAATAGCGTCTGTTCTA CCTAGATGATAGGTATCCATATGGAAGTCTTGGCTTTGGAATTGCTCTCCTTTT GTTCTCCTGTGATTAAATAACTTTAACATGTGTGTGAAGCAGGGACGCCTAGG CAGCAAACGAAGCAGAGGAAGCCACACCGCTTCCGTCCAGCAGTGGCACTGC GGGAGATCAGGAAATTTCAGAAAACCACCGAACTGCTGATCCCGTTTGCACCA TTTTCTCGGCTGGTGGGTACATCCTGAACCTGCCTTCTCTCTATATCAAATATTT CGTAGTGCAAACTTGTGTGATGGAAGCTTTTTGTGCCGATAAAATTTGCAGGTC AGGGAGATCACTGATTTCTATTCAAAGGATGTGTCACGGTGGACCCTTGAAGC TCTCCTTGCATTGCAAGAGGTCAGTGGTCAAACCTGTTTATTATAAGTTTACAA CTGATGGCTTAGTTAGGGAAGGGTCAGACTGAATTATACTGTTTAAATTCCATT CTGCTTCAAGACTCAAGTCACGGCTCAAGAGTGTAACTGAAAAATGTACAAAT CTTCCATGATCAATAAAATGAATATCTCTGTGTGTTGATTTATGAGTCAGATTG CTAAATTATTATCCTTTTTCAGTAGAACACCTATATACTACAAATATGCAACCT CCCTATTTTGTTGTGTCTGTTCAAGATTGCTATCATAGAGTATACCAATTTCAGT TCCTTCTTTCCAGCCATGTCTGTTTCTGCATAACCAGGAAAAGGAACAAAGAG CTGACTTAATTCTCACAAAATAAATTATGTTATTTACTTGCTGTCCTGCAAATTT CCAGTGGTTTTCATACCACTTAGTGGACATATTTGAAGTGTCAAATCTCTGCGC CATCCATGCTAAGCGTGTTACCATCAGTAAGTTGTCATTCTGAATGAACTTTTC TCTTTCTTTTTCTCCCTTTATATTATTATGCTAAATGGATATCATATATGCCACA GCCTACATGATATCATATACGCATCCACTTCAAAAGCATTCTATTTTTTTATAG GAATAACATTCTAATTGCAGGATGATTCTTAATACATGTGTTTATATTTAATGT CATATCTAGTTTTCATACTCTTAAATTTATCATGATTATTGATTAAACATAGGG AGAATTAGTTGGTTTGTGAGTTTTGAGGTGTGAAATATGCTGCTTGCTATTCCC TGTAAAGCTTATCAGCGTTGTCATTGTGTGGTTTAACAAATAAACGTTTGTTCT GCAGTGCAAAAGGACATGCAACTTGCCAGGCGTATCGGTGGGCGGAGGCCAT GGTGAAAATTTGTTTGCGAGCCATGCAGCATGATGGACAAGGAGCAACATGTG TCGTTGATTAACATTTTAGAAAGTAGTGTAGATGTATCTTCACATAGGGATCAA CTTACCCTTCGTTCCCATTCTAATTCAGTTGATGTTAGTATTTACCTTTTGCTCC ATTTGGATTGGTCGAATTCAGGATTTCATCAAACAGTCGATTGTGAAATGTGA ACCAGGAATTGTTGTGTTGATTGCAATAATGGGTTCCTCTCACCTGCTTCTTCC ATC

SEQ ID NO:11

CENH3(-3)氨基酸序列

MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSPRPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASAGTPRQQTKQRKPHRFRP----TVALREIRKFQKTTELLIPFAPFSRLVREITDFYSKDVSR WTLEALLALQEAAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQLARRIGGRRPW

SEQ ID NO:12

CENH3(-6)核苷酸序列

ACGCCGCTTCAGTTTGAAAACCCACCGCCACGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG CCGCCGACGCCGAGATGGCTCGCACGAAGCACCCGGCGGTGAGGAAGTCGAA GGCGGAGCCCAAGAAGAAGCTCCAGTTCGAACGCTCCCCTCGGCCGTCGAAG GCGCAGCGCGCTGGTGGTGAGCGCGCGCTCTCTCCCCCTCTGCGTTTCTTTTTT TTTTTCCTTTTTCTTTCAATGGCGGTGGATGGTGAAGCTTATGCCCCCCCCCCCC CCTTCCCGCCTCTTGCTTGTCCCCTTTGCAGGCGGCACGGGTACCTCGGCGACC ACGGTGCGTGCGGGAGCGGGTCTTTCGTTTGGTGATTTTTTGATTTTGTGGGGG GATATGTTTTTGTTTTGTATCTTGGCTGGATGGATGGCTTGCTCACCACCTGTTT GATGGAATGCAGAGGAGCGCGGCTGGAACATCGGCTTCAGGTGCGTTCTCTTG GGGGGGTTTCTAGGGTTATTCATGGGCTCGTTGGAGCTTTTCCTTTCTGTCTCTT GGATTCCGGGGGACCTGAGGGGCTCAATGTGTCCCTTTTCTTGCTCTGTTTTACCGTGTGCTGTACTTTCCTCATCGTTGTTTTCTGAATATATTATAAGAACAGTAG TTGCAGAAAGATCTTCAATTGCTCATCAGTCAAAGCTTTTCTTGTTTTCATTCTG AAATAATAGCAAATCCAGTTTGGTCCATGGAGGGGTTATCTGAAACATTATGA CCATAAAACATGGTATTAAGCATTGCTAGCCAAGAAATGTGTGGTTTTTAGAC ACGATGTTGATAGGTGATTTTTATGCTCATCCATTATTAGTCTTTGCATCGTGG GAACTGATTTAGTAAACTTTCTTTAGTGTCATGGTTCAAATAGCGTCTGTTCTA CCTAGATGATAGGTATCCATATGGAAGTCTTGGCTTTGGAATTGCTCTCCTTTT GTTCTCCTGTGATTAAATAACTTTAACATGTGTGTGAAGCAGGGACGCCTAGG CAGCAAACGAAGCAGAGGAAGCCACACCGCTTCCGTCCAGTGGCACTGCGGG AGATCAGGAAATTTCAGAAAACCACCGAACTGCTGATCCCGTTTGCACCATTT TCTCGGCTGGTGGGTACATCCTGAACCTGCCTTCTCTCTATATCAAATATTTCG TAGTGCAAACTTGTGTGATGGAAGCTTTTTGTGCCGATAAAATTTGCAGGTCAG GGAGATCACTGATTTCTATTCAAAGGATGTGTCACGGTGGACCCTTGAAGCTCT CCTTGCATTGCAAGAGGTCAGTGGTCAAACCTGTTTATTATAAGTTTACAACTG ATGGCTTAGTTAGGGAAGGGTCAGACTGAATTATACTGTTTAAATTCCATTCTG CTTCAAGACTCAAGTCACGGCTCAAGAGTGTAACTGAAAAATGTACAAATCTT CCATGATCAATAAAATGAATATCTCTGTGTGTTGATTTATGAGTCAGATTGCTA AATTATTATCCTTTTTCAGTAGAACACCTATATACTACAAATATGCAACCTCCC TATTTTGTTGTGTCTGTTCAAGATTGCTATCATAGAGTATACCAATTTCAGTTCC TTCTTTCCAGCCATGTCTGTTTCTGCATAACCAGGAAAAGGAACAAAGAGCTG ACTTAATTCTCACAAAATAAATTATGTTATTTACTTGCTGTCCTGCAAATTTCC AGTGGTTTTCATACCACTTAGTGGACATATTTGAAGTGTCAAATCTCTGCGCCA TCCATGCTAAGCGTGTTACCATCAGTAAGTTGTCATTCTGAATGAACTTTTCTC TTTCTTTTTCTCCCTTTATATTATTATGCTAAATGGATATCATATATGCCACAGC CTACATGATATCATATACGCATCCACTTCAAAAGCATTCTATTTTTTTATAGGAATAACATTCTAATTGCAGGATGATTCTTAATACATGTGTTTATATTTAATGTCA TATCTAGTTTTCATACTCTTAAATTTATCATGATTATTGATTAAACATAGGGAG AATTAGTTGGTTTGTGAGTTTTGAGGTGTGAAATATGCTGCTTGCTATTCCCTG TAAAGCTTATCAGCGTTGTCATTGTGTGGTTTAACAAATAAACGTTTGTTCTGC AGTGCAAAAGGACATGCAACTTGCCAGGCGTATCGGTGGGCGGAGGCCATGG TGAAAATTTGTTTGCGAGCCATGCAGCATGATGGACAAGGAGCAACATGTGTC GTTGATTAACATTTTAGAAAGTAGTGTAGATGTATCTTCACATAGGGATCAACTTACCCTTCGTTCCCATTCTAATTCAGTTGATGTTAGTATTTACCTTTTGCTCCAT TTGGATTGGTCGAATTCAGGATTTCATCAAACAGTCGATTGTGAAATGTGAAC CAGGAATTGTTGTGTTGATTGCAATAATGGGTTCCTCTCACCTGCTTCTTCCAT C

SEQ ID NO:13

CENH3(-6)氨基酸序列

MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSPRPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASAGTPRQQTKQRKPHRFRP----VALREIRKFQKTTELLIPFAPFSRLVREITDFYSKDVSR WTLEALLALQEAAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQLARRIGGRRPW

SEQ ID NO:14

CENH3(-12)核苷酸序列

ACGCCGCTTCAGTTTGAAAACCCACCGCCACGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG CCGCCGACGCCGAGATGGCTCGCACGAAGCACCCGGCGGTGAGGAAGTCGAA GGCGGAGCCCAAGAAGAAGCTCCAGTTCGAACGCTCCCCTCGGCCGTCGAAG GCGCAGCGCGCTGGTGGTGAGCGCGCGCTCTCTCCCCCTCTGCGTTTCTTTTTT TTTTTCCTTTTTCTTTCAATGGCGGTGGATGGTGAAGCTTATGCCCCCCCCCCCC CCTTCCCGCCTCTTGCTTGTCCCCTTTGCAGGCGGCACGGGTACCTCGGCGACC ACGGTGCGTGCGGGAGCGGGTCTTTCGTTTGGTGATTTTTTGATTTTGTGGGGG GATATGTTTTTGTTTTGTATCTTGGCTGGATGGATGGCTTGCTCACCACCTGTTT GATGGAATGCAGAGGAGCGCGGCTGGAACATCGGCTTCAGGTGCGTTCTCTTG GGGGGGTTTCTAGGGTTATTCATGGGCTCGTTGGAGCTTTTCCTTTCTGTCTCTT GGATTCCGGGGGACCTGAGGGGCTCAATGTGTCCCTTTTCTTGCTCTGTTTTACCGTGTGCTGTACTTTCCTCATCGTTGTTTTCTGAATATATTATAAGAACAGTAG TTGCAGAAAGATCTTCAATTGCTCATCAGTCAAAGCTTTTCTTGTTTTCATTCTG AAATAATAGCAAATCCAGTTTGGTCCATGGAGGGGTTATCTGAAACATTATGA CCATAAAACATGGTATTAAGCATTGCTAGCCAAGAAATGTGTGGTTTTTAGAC ACGATGTTGATAGGTGATTTTTATGCTCATCCATTATTAGTCTTTGCATCGTGG GAACTGATTTAGTAAACTTTCTTTAGTGTCATGGTTCAAATAGCGTCTGTTCTA CCTAGATGATAGGTATCCATATGGAAGTCTTGGCTTTGGAATTGCTCTCCTTTT GTTCTCCTGTGATTAAATAACTTTAACATGTGTGTGAAGCAGGGACGCCTAGG CAGCAAACGAAGCAGAGGAAGCCACACCGCTTCAAGGCACTGCGGGAGATCA GGAAATTTCAGAAAACCACCGAACTGCTGATCCCGTTTGCACCATTTTCTCGGC TGGTGGGTACATCCTGAACCTGCCTTCTCTCTATATCAAATATTTCGTAGTGCA AACTTGTGTGATGGAAGCTTTTTGTGCCGATAAAATTTGCAGGTCAGGGAGAT CACTGATTTCTATTCAAAGGATGTGTCACGGTGGACCCTTGAAGCTCTCCTTGC ATTGCAAGAGGTCAGTGGTCAAACCTGTTTATTATAAGTTTACAACTGATGGCT TAGTTAGGGAAGGGTCAGACTGAATTATACTGTTTAAATTCCATTCTGCTTCAA GACTCAAGTCACGGCTCAAGAGTGTAACTGAAAAATGTACAAATCTTCCATGA TCAATAAAATGAATATCTCTGTGTGTTGATTTATGAGTCAGATTGCTAAATTAT TATCCTTTTTCAGTAGAACACCTATATACTACAAATATGCAACCTCCCTATTTT GTTGTGTCTGTTCAAGATTGCTATCATAGAGTATACCAATTTCAGTTCCTTCTTT CCAGCCATGTCTGTTTCTGCATAACCAGGAAAAGGAACAAAGAGCTGACTTAA TTCTCACAAAATAAATTATGTTATTTACTTGCTGTCCTGCAAATTTCCAGTGGTT TTCATACCACTTAGTGGACATATTTGAAGTGTCAAATCTCTGCGCCATCCATGC TAAGCGTGTTACCATCAGTAAGTTGTCATTCTGAATGAACTTTTCTCTTTCTTTT TCTCCCTTTATATTATTATGCTAAATGGATATCATATATGCCACAGCCTACATG ATATCATATACGCATCCACTTCAAAAGCATTCTATTTTTTTATAGGAATAACAT TCTAATTGCAGGATGATTCTTAATACATGTGTTTATATTTAATGTCATATCTAGT TTTCATACTCTTAAATTTATCATGATTATTGATTAAACATAGGGAGAATTAGTT GGTTTGTGAGTTTTGAGGTGTGAAATATGCTGCTTGCTATTCCCTGTAAAGCTT ATCAGCGTTGTCATTGTGTGGTTTAACAAATAAACGTTTGTTCTGCAGTGCAAA AGGACATGCAACTTGCCAGGCGTATCGGTGGGCGGAGGCCATGGTGAAAATTT GTTTGCGAGCCATGCAGCATGATGGACAAGGAGCAACATGTGTCGTTGATTAA CATTTTAGAAAGTAGTGTAGATGTATCTTCACATAGGGATCAACTTACCCTTCG TTCCCATTCTAATTCAGTTGATGTTAGTATTTACCTTTTGCTCCATTTGGATTGG TCGAATTCAGGATTTCATCAAACAGTCGATTGTGAAATGTGAACCAGGAATTG TTGTGTTGATTGCAATAATGGGTTCCTCTCACCTGCTTCTTCCATC

SEQ ID NO:15

CENH3(-12)氨基酸序列

MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSPRPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASAGTPRQQTKQRKPHRF----KALREIRKFQKTTELLIPFAPFSRLVREITDFYSKDVSRWT LEALLALQEAAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQLARRIGGRRPW

SEQ ID NO:16

CENH3(-18)核苷酸序列

ACGCCGCTTCAGTTTGAAAACCCACCGCCACGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG CCGCCGACGCCGAGATGGCTCGCACGAAGCACCCGGCGGTGAGGAAGTCGAA GGCGGAGCCCAAGAAGAAGCTCCAGTTCGAACGCTCCCCTCGGCCGTCGAAG GCGCAGCGCGCTGGTGGTGAGCGCGCGCTCTCTCCCCCTCTGCGTTTCTTTTTT TTTTTCCTTTTTCTTTCAATGGCGGTGGATGGTGAAGCTTATGCCCCCCCCCCCC CCTTCCCGCCTCTTGCTTGTCCCCTTTGCAGGCGGCACGGGTACCTCGGCGACC ACGGTGCGTGCGGGAGCGGGTCTTTCGTTTGGTGATTTTTTGATTTTGTGGGGG GATATGTTTTTGTTTTGTATCTTGGCTGGATGGATGGCTTGCTCACCACCTGTTT GATGGAATGCAGAGGAGCGCGGCTGGAACATCGGCTTCAGGTGCGTTCTCTTG GGGGGGTTTCTAGGGTTATTCATGGGCTCGTTGGAGCTTTTCCTTTCTGTCTCTT GGATTCCGGGGGACCTGAGGGGCTCAATGTGTCCCTTTTCTTGCTCTGTTTTACCGTGTGCTGTACTTTCCTCATCGTTGTTTTCTGAATATATTATAAGAACAGTAG TTGCAGAAAGATCTTCAATTGCTCATCAGTCAAAGCTTTTCTTGTTTTCATTCTG AAATAATAGCAAATCCAGTTTGGTCCATGGAGGGGTTATCTGAAACATTATGA CCATAAAACATGGTATTAAGCATTGCTAGCCAAGAAATGTGTGGTTTTTAGAC ACGATGTTGATAGGTGATTTTTATGCTCATCCATTATTAGTCTTTGCATCGTGG GAACTGATTTAGTAAACTTTCTTTAGTGTCATGGTTCAAATAGCGTCTGTTCTA CCTAGATGATAGGTATCCATATGGAAGTCTTGGCTTTGGAATTGCTCTCCTTTT GTTCTCCTGTGATTAAATAACTTTAACATGTGTGTGAAGCAGGGACGCCTAGG CAGCAAACGAAGCAGAGGAAGCCAGCAGTGGCACTGCGGGAGATCAGGAAAT TTCAGAAAACCACCGAACTGCTGATCCCGTTTGCACCATTTTCTCGGCTGGTGG GTACATCCTGAACCTGCCTTCTCTCTATATCAAATATTTCGTAGTGCAAACTTG TGTGATGGAAGCTTTTTGTGCCGATAAAATTTGCAGGTCAGGGAGATCACTGA TTTCTATTCAAAGGATGTGTCACGGTGGACCCTTGAAGCTCTCCTTGCATTGCA AGAGGTCAGTGGTCAAACCTGTTTATTATAAGTTTACAACTGATGGCTTAGTTA GGGAAGGGTCAGACTGAATTATACTGTTTAAATTCCATTCTGCTTCAAGACTCA AGTCACGGCTCAAGAGTGTAACTGAAAAATGTACAAATCTTCCATGATCAATA AAATGAATATCTCTGTGTGTTGATTTATGAGTCAGATTGCTAAATTATTATCCT TTTTCAGTAGAACACCTATATACTACAAATATGCAACCTCCCTATTTTGTTGTG TCTGTTCAAGATTGCTATCATAGAGTATACCAATTTCAGTTCCTTCTTTCCAGCC ATGTCTGTTTCTGCATAACCAGGAAAAGGAACAAAGAGCTGACTTAATTCTCA CAAAATAAATTATGTTATTTACTTGCTGTCCTGCAAATTTCCAGTGGTTTTCAT ACCACTTAGTGGACATATTTGAAGTGTCAAATCTCTGCGCCATCCATGCTAAGC GTGTTACCATCAGTAAGTTGTCATTCTGAATGAACTTTTCTCTTTCTTTTTCTCC CTTTATATTATTATGCTAAATGGATATCATATATGCCACAGCCTACATGATATC ATATACGCATCCACTTCAAAAGCATTCTATTTTTTTATAGGAATAACATTCTAATTGCAGGATGATTCTTAATACATGTGTTTATATTTAATGTCATATCTAGTTTTCA TACTCTTAAATTTATCATGATTATTGATTAAACATAGGGAGAATTAGTTGGTTT GTGAGTTTTGAGGTGTGAAATATGCTGCTTGCTATTCCCTGTAAAGCTTATCAG CGTTGTCATTGTGTGGTTTAACAAATAAACGTTTGTTCTGCAGTGCAAAAGGAC ATGCAACTTGCCAGGCGTATCGGTGGGCGGAGGCCATGGTGAAAATTTGTTTG CGAGCCATGCAGCATGATGGACAAGGAGCAACATGTGTCGTTGATTAACATTT TAGAAAGTAGTGTAGATGTATCTTCACATAGGGATCAACTTACCCTTCGTTCCC ATTCTAATTCAGTTGATGTTAGTATTTACCTTTTGCTCCATTTGGATTGGTCGAA TTCAGGATTTCATCAAACAGTCGATTGTGAAATGTGAACCAGGAATTGTTGTGT TGATTGCAATAATGGGTTCCTCTCACCTGCTTCTTCCATC

SEQ ID NO:17

CENH3(-18)氨基酸序列

MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSPRPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASAGTPRQQTKQRKP----AVALREIRKFQKTTELLIPFAPFSRLVREITDFYSKDVSRWTLE ALLALQEAAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQLARRIGGRRPW

SEQ ID NO:18

CENH3(-24)核苷酸序列

ACGCCGCTTCAGTTTGAAAACCCACCGCCACGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG CCGCCGACGCCGAGATGGCTCGCACGAAGCACCCGGCGGTGAGGAAGTCGAA GGCGGAGCCCAAGAAGAAGCTCCAGTTCGAACGCTCCCCTCGGCCGTCGAAG GCGCAGCGCGCTGGTGGTGAGCGCGCGCTCTCTCCCCCTCTGCGTTTCTTTTTT TTTTTCCTTTTTCTTTCAATGGCGGTGGATGGTGAAGCTTATGCCCCCCCCCCCC CCTTCCCGCCTCTTGCTTGTCCCCTTTGCAGGCGGCACGGGTACCTCGGCGACC ACGGTGCGTGCGGGAGCGGGTCTTTCGTTTGGTGATTTTTTGATTTTGTGGGGG GATATGTTTTTGTTTTGTATCTTGGCTGGATGGATGGCTTGCTCACCACCTGTTT GATGGAATGCAGAGGAGCGCGGCTGGAACATCGGCTTCAGGTGCGTTCTCTTG GGGGGGTTTCTAGGGTTATTCATGGGCTCGTTGGAGCTTTTCCTTTCTGTCTCTT GGATTCCGGGGGACCTGAGGGGCTCAATGTGTCCCTTTTCTTGCTCTGTTTTACCGTGTGCTGTACTTTCCTCATCGTTGTTTTCTGAATATATTATAAGAACAGTAG TTGCAGAAAGATCTTCAATTGCTCATCAGTCAAAGCTTTTCTTGTTTTCATTCTG AAATAATAGCAAATCCAGTTTGGTCCATGGAGGGGTTATCTGAAACATTATGA CCATAAAACATGGTATTAAGCATTGCTAGCCAAGAAATGTGTGGTTTTTAGAC ACGATGTTGATAGGTGATTTTTATGCTCATCCATTATTAGTCTTTGCATCGTGG GAACTGATTTAGTAAACTTTCTTTAGTGTCATGGTTCAAATAGCGTCTGTTCTA CCTAGATGATAGGTATCCATATGGAAGTCTTGGCTTTGGAATTGCTCTCCTTTT GTTCTCCTGTGATTAAATAACTTTAACATGTGTGTGAAGCAGGGACGCCTAGG CAGCAAACGAAGCAGAGGACAGTGGCACTGCGGGAGATCAGGAAATTTCAGA AAACCACCGAACTGCTGATCCCGTTTGCACCATTTTCTCGGCTGGTGGGTACAT CCTGAACCTGCCTTCTCTCTATATCAAATATTTCGTAGTGCAAACTTGTGTGAT GGAAGCTTTTTGTGCCGATAAAATTTGCAGGTCAGGGAGATCACTGATTTCTAT TCAAAGGATGTGTCACGGTGGACCCTTGAAGCTCTCCTTGCATTGCAAGAGGT CAGTGGTCAAACCTGTTTATTATAAGTTTACAACTGATGGCTTAGTTAGGGAAG GGTCAGACTGAATTATACTGTTTAAATTCCATTCTGCTTCAAGACTCAAGTCAC GGCTCAAGAGTGTAACTGAAAAATGTACAAATCTTCCATGATCAATAAAATGA ATATCTCTGTGTGTTGATTTATGAGTCAGATTGCTAAATTATTATCCTTTTTCAG TAGAACACCTATATACTACAAATATGCAACCTCCCTATTTTGTTGTGTCTGTTC AAGATTGCTATCATAGAGTATACCAATTTCAGTTCCTTCTTTCCAGCCATGTCT GTTTCTGCATAACCAGGAAAAGGAACAAAGAGCTGACTTAATTCTCACAAAAT AAATTATGTTATTTACTTGCTGTCCTGCAAATTTCCAGTGGTTTTCATACCACTT AGTGGACATATTTGAAGTGTCAAATCTCTGCGCCATCCATGCTAAGCGTGTTAC CATCAGTAAGTTGTCATTCTGAATGAACTTTTCTCTTTCTTTTTCTCCCTTTATA TTATTATGCTAAATGGATATCATATATGCCACAGCCTACATGATATCATATACG CATCCACTTCAAAAGCATTCTATTTTTTTATAGGAATAACATTCTAATTGCAGG ATGATTCTTAATACATGTGTTTATATTTAATGTCATATCTAGTTTTCATACTCTT AAATTTATCATGATTATTGATTAAACATAGGGAGAATTAGTTGGTTTGTGAGTT TTGAGGTGTGAAATATGCTGCTTGCTATTCCCTGTAAAGCTTATCAGCGTTGTC ATTGTGTGGTTTAACAAATAAACGTTTGTTCTGCAGTGCAAAAGGACATGCAA CTTGCCAGGCGTATCGGTGGGCGGAGGCCATGGTGAAAATTTGTTTGCGAGCC ATGCAGCATGATGGACAAGGAGCAACATGTGTCGTTGATTAACATTTTAGAAA GTAGTGTAGATGTATCTTCACATAGGGATCAACTTACCCTTCGTTCCCATTCTA ATTCAGTTGATGTTAGTATTTACCTTTTGCTCCATTTGGATTGGTCGAATTCAGG ATTTCATCAAACAGTCGATTGTGAAATGTGAACCAGGAATTGTTGTGTTGATTG CAATAATGGGTTCCTCTCACCTGCTTCTTCCATC

SEQ ID NO:19

CENH3(24)氨基酸序列

MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSPRPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASAG TPRQQTKQR----TVALREIRKFQKTTELLIPFAPFSRLVREITDFYSKDVSRWTLEAL LALQEAAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQLARRIGGRRPW

SEQ ID NO:20

CENH3(-27)核苷酸序列

ACGCCGCTTCAGTTTGAAAACCCACCGCCACGTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG CCGCCGACGCCGAGATGGCTCGCACGAAGCACCCGGCGGTGAGGAAGTCGAA GGCGGAGCCCAAGAAGAAGCTCCAGTTCGAACGCTCCCCTCGGCCGTCGAAG GCGCAGCGCGCTGGTGGTGAGCGCGCGCTCTCTCCCCCTCTGCGTTTCTTTTTT TTTTTCCTTTTTCTTTCAATGGCGGTGGATGGTGAAGCTTATGCCCCCCCCCCCC CCTTCCCGCCTCTTGCTTGTCCCCTTTGCAGGCGGCACGGGTACCTCGGCGACC ACGGTGCGTGCGGGAGCGGGTCTTTCGTTTGGTGATTTTTTGATTTTGTGGGGG GATATGTTTTTGTTTTGTATCTTGGCTGGATGGATGGCTTGCTCACCACCTGTTT GATGGAATGCAGAGGAGCGCGGCTGGAACATCGGCTTCAGGTGCGTTCTCTTG GGGGGGTTTCTAGGGTTATTCATGGGCTCGTTGGAGCTTTTCCTTTCTGTCTCTT GGATTCCGGGGGACCTGAGGGGCTCAATGTGTCCCTTTTCTTGCTCTGTTTTACCGTGTGCTGTACTTTCCTCATCGTTGTTTTCTGAATATATTATAAGAACAGTAG TTGCAGAAAGATCTTCAATTGCTCATCAGTCAAAGCTTTTCTTGTTTTCATTCTG AAATAATAGCAAATCCAGTTTGGTCCATGGAGGGGTTATCTGAAACATTATGA CCATAAAACATGGTATTAAGCATTGCTAGCCAAGAAATGTGTGGTTTTTAGAC ACGATGTTGATAGGTGATTTTTATGCTCATCCATTATTAGTCTTTGCATCGTGG GAACTGATTTAGTAAACTTTCTTTAGTGTCATGGTTCAAATAGCGTCTGTTCTA CCTAGATGATAGGTATCCATATGGAAGTCTTGGCTTTGGAATTGCTCTCCTTTT GTTCTCCTGTGATTAAATAACTTTAACATGTGTGTGAAGCAGGGACGCCTAGG CAGCAAACGAAGCAGAGGAAGCCACTGCGGGAGATCAGGAAATTTCAGAAAA CCACCGAACTGCTGATCCCGTTTGCACCATTTTCTCGGCTGGTGGGTACATCCT GAACCTGCCTTCTCTCTATATCAAATATTTCGTAGTGCAAACTTGTGTGATGGA AGCTTTTTGTGCCGATAAAATTTGCAGGTCAGGGAGATCACTGATTTCTATTCA AAGGATGTGTCACGGTGGACCCTTGAAGCTCTCCTTGCATTGCAAGAGGTCAG TGGTCAAACCTGTTTATTATAAGTTTACAACTGATGGCTTAGTTAGGGAAGGGT CAGACTGAATTATACTGTTTAAATTCCATTCTGCTTCAAGACTCAAGTCACGGC TCAAGAGTGTAACTGAAAAATGTACAAATCTTCCATGATCAATAAAATGAATA TCTCTGTGTGTTGATTTATGAGTCAGATTGCTAAATTATTATCCTTTTTCAGTAG AACACCTATATACTACAAATATGCAACCTCCCTATTTTGTTGTGTCTGTTCAAG ATTGCTATCATAGAGTATACCAATTTCAGTTCCTTCTTTCCAGCCATGTCTGTTT CTGCATAACCAGGAAAAGGAACAAAGAGCTGACTTAATTCTCACAAAATAAAT TATGTTATTTACTTGCTGTCCTGCAAATTTCCAGTGGTTTTCATACCACTTAGTG GACATATTTGAAGTGTCAAATCTCTGCGCCATCCATGCTAAGCGTGTTACCATC AGTAAGTTGTCATTCTGAATGAACTTTTCTCTTTCTTTTTCTCCCTTTATATTATT ATGCTAAATGGATATCATATATGCCACAGCCTACATGATATCATATACGCATCC ACTTCAAAAGCATTCTATTTTTTTATAGGAATAACATTCTAATTGCAGGATGAT TCTTAATACATGTGTTTATATTTAATGTCATATCTAGTTTTCATACTCTTAAATT TATCATGATTATTGATTAAACATAGGGAGAATTAGTTGGTTTGTGAGTTTTGAG GTGTGAAATATGCTGCTTGCTATTCCCTGTAAAGCTTATCAGCGTTGTCATTGT GTGGTTTAACAAATAAACGTTTGTTCTGCAGTGCAAAAGGACATGCAACTTGC CAGGCGTATCGGTGGGCGGAGGCCATGGTGAAAATTTGTTTGCGAGCCATGCA GCATGATGGACAAGGAGCAACATGTGTCGTTGATTAACATTTTAGAAAGTAGT GTAGATGTATCTTCACATAGGGATCAACTTACCCTTCGTTCCCATTCTAATTCA GTTGATGTTAGTATTTACCTTTTGCTCCATTTGGATTGGTCGAATTCAGGATTTC ATCAAACAGTCGATTGTGAAATGTGAACCAGGAATTGTTGTGTTGATTGCAAT AATGGGTTCCTCTCACCTGCTTCTTCCATC

SEQ ID NO:21

CENH3(-27)氨基酸序列

MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSPRPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASAGTPRQQTKQRKP----LREIRKFQKTTELLIPFAPFSRLVREITDFYSKDVSRWTLEALL ALQEAAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQLARRIGGRRPW

备注：SEQ ID NO:11、13、15、17、19和21中的“----”表示编辑导致的氨基酸缺失的位置。

参考文献

[1]刘君涛、姚莉、梁大伟、张亚、刘春霞、刘宇博、王艳丽和T·J·凯利海尔(2018)一种用基因编辑创制的水稻单倍体诱导系及其创制方法和应用发明专利；

[2]Britt,A.B.,and Kuppu,S.(2016).Cenh3:an emerging player in haploidinduction technology.Frontiers in plant science 7,357.

[3]Bailey,A.O.,Panchenko,T.,Sathyan,K.M.,Petkowski,J.J.,Pai,P.-J.,Bai,D.L., Russell,D.H.,Macara,I.G.,Shabanowitz,J.,and Hunt,D.F.(2013).Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation ofcentromeric chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences 110,11827-11832.

[4]Ravi,M.,and Chan,S.W.(2010).Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination.Nature 464,615.

[5]Maheshwari,S.,Tan,E.H.,West,A.,Franklin,F.C.H.,Comai,L.,and Chan,S.W. (2015).Naturally occurring differences in CENH3 affect chromosomesegregation in zygotic mitosis of hybrids.PLoS genetics 11,e1004970.

[6]Karimi-Ashtiyani,R.,Ishii,T.,Niessen,M.,Stein,N.,Heckmann,S.,Gurushidze,M., Banaei-Moghaddam,A.M.,Fuchs,J.,Schubert,V.,and Koch,K.(2015).Point mutation impairs centromeric CENH3 loading and induces haploidplants.Proceedings of the National Academy of Sciences 112,11211-11216.

[7]Kuppu,S.,Tan,E.H.,Nguyen,H.,Rodgers,A.,Comai,L.,Chan,S.W.,andBritt,A.B. (2015).Point mutations in centromeric histone induce post-zygoticincompatibility and uniparental inheritance.PLoS genetics 11,e1005494.

[8]Kelliher,T.,Starr,D.,Wang,W.,McCuiston,J.,Zhong,H.,Nuccio,M.L.,andMartin, B.(2016).Maternal haploids are preferentially induced by CENH3-tailswap transgenic complementation in maize.Frontiers in plant science 7,414.

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 创制植物单倍体诱导系的方法及其应用

<130> 19C13564CN

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4125

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgccgaaga agcgccgccg cgtggacaag aagtactcca tcggcctcga catcggcacc 60

aactccgtgg gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgccgtccaa gaagttcaag 120

gtgctcggca acaccgaccg ccactccatc aagaagaacc tcatcggcgc cctcctcttc 180

gactccggcg agaccgccga ggccacccgc ctcaagcgca ccgcccgccg ccgctacacc 240

cgccgcaaga accgcatctg ctacctccag gagatcttct ccaacgagat ggccaaggtg 300

gacgactcct tcttccaccg cctcgaggag tccttcctcg tggaggagga caagaagcac 360

gagcgccacc cgatcttcgg caacatcgtg gacgaggtgg cctaccacga gaagtacccg 420

accatctacc acctccgcaa gaagctcgtg gactccaccg acaaggccga cctccgcctc 480

atctacctcg ccctcgccca catgatcaag ttccgcggcc acttcctcat cgagggcgac 540

ctcaacccgg acaactccga cgtggacaag ctcttcatcc agctcgtgca gacctacaac 600

cagctcttcg aggagaaccc gatcaacgcc tccggcgtgg acgccaaggc catcctctcc 660

gcccgcctct ccaagtcccg ccgcctcgag aacctcatcg cccagctccc gggcgagaag 720

aagaacggcc tcttcggcaa cctcatcgcc ctctccctcg gcctcacccc gaacttcaag 780

tccaacttcg acctcgccga ggacgccaag ctccagctct ccaaggacac ctacgacgac 840

gacctcgaca acctcctcgc ccagatcggc gaccagtacg ccgacctctt cctcgccgcc 900

aagaacctct ccgacgccat cctcctctcc gacatcctcc gcgtgaacac cgagatcacc 960

aaggccccgc tctccgcctc catgatcaag cgctacgacg agcaccacca ggacctcacc 1020

ctcctcaagg ccctcgtgcg ccagcagctc ccggagaagt acaaggagat cttcttcgac 1080

cagtccaaga acggctacgc cggctacatc gacggcggcg cctcccagga ggagttctac 1140

aagttcatca agccgatcct cgagaagatg gacggcaccg aggagctcct cgtgaagctc 1200

aaccgcgagg acctcctccg caagcagcgc accttcgaca acggctccat cccgcaccag 1260

atccacctcg gcgagctcca cgccatcctc cgccgccagg aggacttcta cccgttcctc 1320

aaggacaacc gcgagaagat cgagaagatc ctcaccttcc gcatcccgta ctacgtgggc 1380

ccgctcgccc gcggcaactc ccgcttcgcc tggatgaccc gcaagtccga ggagaccatc 1440

accccgtgga acttcgagga ggtggtggac aagggcgcct ccgcccagtc cttcatcgag 1500

cgcatgacca acttcgacaa gaacctcccg aacgagaagg tgctcccgaa gcactccctc 1560

ctctacgagt acttcaccgt gtacaacgag ctcaccaagg tgaagtacgt gaccgagggc 1620

atgcgcaagc cggccttcct ctccggcgag cagaagaagg ccatcgtgga cctcctcttc 1680

aagaccaacc gcaaggtgac cgtgaagcag ctcaaggagg actacttcaa gaagatcgag 1740

tgcttcgact ccgtggagat ctccggcgtg gaggaccgct tcaacgcctc cctcggcacc 1800

taccacgacc tcctcaagat catcaaggac aaggacttcc tcgacaacga ggagaacgag 1860

gacatcctcg aggacatcgt gctcaccctc accctcttcg aggaccgcga gatgatcgag 1920

gagcgcctca agacctacgc ccacctcttc gacgacaagg tgatgaagca gctcaagcgc 1980

cgccgctaca ccggctgggg ccgcctctcc cgcaagctca tcaacggcat ccgcgacaag 2040

cagtccggca agaccatcct cgacttcctc aagtccgacg gcttcgccaa ccgcaacttc 2100

atgcagctca tccacgacga ctccctcacc ttcaaggagg acatccagaa ggcccaggtg 2160

tccggccagg gcgactccct ccacgagcac atcgccaacc tcgccggctc cccggccatc 2220

aagaagggca tcctccagac cgtgaaggtg gtggacgagc tcgtgaaggt gatgggccgc 2280

cacaagccgg agaacatcgt gatcgagatg gcccgcgaga accagaccac ccagaagggc 2340

cagaagaact cccgcgagcg catgaagcgc atcgaggagg gcatcaagga gctcggctcc 2400

cagatcctca aggagcaccc ggtggagaac acccagctcc agaacgagaa gctctacctc 2460

tactacctcc agaacggccg cgacatgtac gtggaccagg agctcgacat caaccgcctc 2520

tccgactacg acgtggacca catcgtgccg cagtccttcc tcaaggacga ctccatcgac 2580

aacaaggtgc tcacccgctc cgacaagaac cgcggcaagt ccgacaacgt gccgtccgag 2640

gaggtggtga agaagatgaa gaactactgg cgccagctcc tcaacgccaa gctcatcacc 2700

cagcgcaagt tcgacaacct caccaaggcc gagcgcggcg gcctctccga gctcgacaag 2760

gccggcttca tcaagcgcca gctcgtggag acccgccaga tcaccaagca cgtggcccag 2820

atcctcgact cccgcatgaa caccaagtac gacgagaacg acaagctcat ccgcgaggtg 2880

aaggtgatca ccctcaagtc caagctcgtg tccgacttcc gcaaggactt ccagttctac 2940

aaggtgcgcg agatcaacaa ctaccaccac gcccacgacg cctacctcaa cgccgtggtg 3000

ggcaccgccc tcatcaagaa gtacccgaag ctcgagtccg agttcgtgta cggcgactac 3060

aaggtgtacg acgtgcgcaa gatgatcgcc aagtccgagc aggagatcgg caaggccacc 3120

gccaagtact tcttctactc caacatcatg aacttcttca agaccgagat caccctcgcc 3180

aacggcgaga tccgcaagcg cccgctcatc gagaccaacg gcgagaccgg cgagatcgtg 3240

tgggacaagg gccgcgactt cgccaccgtg cgcaaggtgc tctccatgcc gcaggtgaac 3300

atcgtgaaga agaccgaggt gcagaccggc ggcttctcca aggagtccat cctcccgaag 3360

cgcaactccg acaagctcat cgcccgcaag aaggactggg acccgaagaa gtacggcggc 3420

ttcgactccc cgaccgtggc ctactccgtg ctcgtggtgg ccaaggtgga gaagggcaag 3480

tccaagaagc tcaagtccgt gaaggagctc ctcggcatca ccatcatgga gcgctcctcc 3540

ttcgagaaga acccgatcga cttcctcgag gccaagggct acaaggaggt gaagaaggac 3600

ctcatcatca agctcccgaa gtactccctc ttcgagctcg agaacggccg caagcgcatg 3660

ctcgcctccg ccggcgagct ccagaagggc aacgagctcg ccctcccgtc caagtacgtg 3720

aacttcctct acctcgcctc ccactacgag aagctcaagg gctccccgga ggacaacgag 3780

cagaagcagc tcttcgtgga gcagcacaag cactacctcg acgagatcat cgagcagatc 3840

tccgagttct ccaagcgcgt gatcctcgcc gacgccaacc tcgacaaggt gctctccgcc 3900

tacaacaagc accgcgacaa gccgatccgc gagcaggccg agaacatcat ccacctcttc 3960

accctcacca acctcggcgc cccggccgcc ttcaagtact tcgacaccac catcgaccgc 4020

aagcgctaca cctccaccaa ggaggtgctc gacgccaccc tcatccacca gtccatcacc 4080

ggcctctacg agacccgcat cgacctctcc cagctcggcg gcgac 4261

<210> 2

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcacaggt taagtctg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctgtctca acggtaag 18

<210> 4

<211> 2500

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

acgccgcttc agtttgaaaa cccaccgcca cgtcgccgcc gccgccgccg ccgccgccga 60

cgccgagatg gctcgcacga agcacccggc ggtgaggaag tcgaaggcgg agcccaagaa 120

gaagctccag ttcgaacgct cccctcggcc gtcgaaggcg cagcgcgctg gtggtgagcg 180

cgcgctctct ccccctctgc gtttcttttt ttttttcctt tttctttcaa tggcggtgga 240

tggtgaagct tatgcccccc cccccccctt cccgcctctt gcttgtcccc tttgcaggcg 300

gcacgggtac ctcggcgacc acggtgcgtg cgggagcggg tctttcgttt ggtgattttt 360

tgattttgtg gggggatatg tttttgtttt gtatcttggc tggatggatg gcttgctcac 420

cacctgtttg atggaatgca gaggagcgcg gctggaacat cggcttcagg tgcgttctct 480

tgggggggtt tctagggtta ttcatgggct cgttggagct tttcctttct gtctcttgga 540

ttccggggga cctgaggggc tcaatgtgtc ccttttcttg ctctgtttta ccgtgtgctg 600

tactttcctc atcgttgttt tctgaatata ttataagaac agtagttgca gaaagatctt 660

caattgctca tcagtcaaag cttttcttgt tttcattctg aaataatagc aaatccagtt 720

tggtccatgg aggggttatc tgaaacatta tgaccataaa acatggtatt aagcattgct 780

agccaagaaa tgtgtggttt ttagacacga tgttgatagg tgatttttat gctcatccat 840

tattagtctt tgcatcgtgg gaactgattt agtaaacttt ctttagtgtc atggttcaaa 900

tagcgtctgt tctacctaga tgataggtat ccatatggaa gtcttggctt tggaattgct 960

ctccttttgt tctcctgtga ttaaataact ttaacatgtg tgtgaagcag ggacgcctag 1020

gcagcaaacg aagcagagga agccacaccg cttccgtcca ggcacagtgg cactgcggga 1080

gatcaggaaa tttcagaaaa ccaccgaact gctgatcccg tttgcaccat tttctcggct 1140

ggtgggtaca tcctgaacct gccttctctc tatatcaaat atttcgtagt gcaaacttgt 1200

gtgatggaag ctttttgtgc cgataaaatt tgcaggtcag ggagatcact gatttctatt 1260

caaaggatgt gtcacggtgg acccttgaag ctctccttgc attgcaagag gtcagtggtc 1320

aaacctgttt attataagtt tacaactgat ggcttagtta gggaagggtc agactgaatt 1380

atactgttta aattccattc tgcttcaaga ctcaagtcac ggctcaagag tgtaactgaa 1440

aaatgtacaa atcttccatg atcaataaaa tgaatatctc tgtgtgttga tttatgagtc 1500

agattgctaa attattatcc tttttcagta gaacacctat atactacaaa tatgcaacct 1560

ccctattttg ttgtgtctgt tcaagattgc tatcatagag tataccaatt tcagttcctt 1620

ctttccagcc atgtctgttt ctgcataacc aggaaaagga acaaagagct gacttaattc 1680

tcacaaaata aattatgtta tttacttgct gtcctgcaaa tttccagtgg ttttccctct 1740

cctgcaggca gcagaatacc acttagtgga catatttgaa gtgtcaaatc tctgcgccat 1800

ccatgctaag cgtgttacca tcagtaagtt gtcattctga atgaactttt ctctttcttt 1860

ttctcccttt atattattat gctaaatgga tatcatatat gccacagcct acatgatatc 1920

atatacgcat ccacttcaaa agcattctat ttttttatag gaataacatt ctaattgcag 1980

gatgattctt aatacatgtg tttatattta atgtcatatc tagttttcat actcttaaat 2040

ttatcatgat tattgattaa acatagggag aattagttgg tttgtgagtt ttgaggtgtg 2100

aaatatgctg cttgctattc cctgtaaagc ttatcagcgt tgtcattgtg tggtttaaca 2160

aataaacgtt tgttctgcag tgcaaaagga catgcaactt gccaggcgta tcggtgggcg 2220

gaggccatgg tgaaaatttg tttgcgagcc atgcagcatg atggacaagg agcaacatgt 2280

gtcgttgatt aacattttag aaagtagtgt agatgtatct tcacataggg atcaacttac 2340

ccttcgttcc cattctaatt cagttgatgt tagtatttac cttttgctcc atttggattg 2400

gtcgaattca ggatttcatc aaacagtcga ttgtgaaatg tgaaccagga attgttgtgt 2460

tgattgcaat aatgggttcc tctcacctgc ttcttccatc 2582

<210> 5

<211> 165

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

Met Ala Arg Thr Lys His Pro Ala Val Arg Lys Ser Lys Ala Glu Pro

1 5 10 15

Lys Lys Lys Leu Gln Phe Glu Arg Ser Pro Arg Pro Ser Lys Ala Gln

20 25 30

Arg Ala Gly Gly Gly Thr Gly Thr Ser Ala Thr Thr Arg Ser Ala Ala

35 40 45

Gly Thr Ser Ala Ser Ala Gly Thr Pro Arg Gln Gln Thr Lys Gln Arg

50 55 60

Lys Pro His Arg Phe Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu Arg Glu Ile Arg

65 70 75 80

Lys Phe Gln Lys Thr Thr Glu Leu Leu Ile Pro Phe Ala Pro Phe Ser

85 90 95

Arg Leu Val Arg Glu Ile Thr Asp Phe Tyr Ser Lys Asp Val Ser Arg

100 105 110

Trp Thr Leu Glu Ala Leu Leu Ala Leu Gln Glu Ala Ala Glu Tyr His

115 120 125

Leu Val Asp Ile Phe Glu Val Ser Asn Leu Cys Ala Ile His Ala Lys

130 135 140

Arg Val Thr Ile Met Gln Lys Asp Met Gln Leu Ala Arg Arg Ile Gly

145 150 155 160

Gly Arg Arg Pro Trp

165

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accgcttccg tccaggcaca g 21

<210> 7

<211> 98

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accgcttccg tccaggcaca ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgct 100

<210> 8

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcttccgtc caggcacag 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaatagaaat cagtgatctc cc 22

<210> 10

<211> 2477

<212> DNA/RNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 10