一种香菇寡肽的制备方法及用途
阅读说明：本技术 一种香菇寡肽的制备方法及用途 (Preparation method and application of lentinus edodes oligopeptide ) 是由 伍曾利 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种香菇寡肽的制备方法及用途。本发明提供的方法对香菇水提取物进行CTAB的处理后,依次经过碱性蛋白酶酶解、风味蛋白酶酶解、活性炭脱色后,取分子量为300～1000Da的部分,制得香菇寡肽。研究表明,采用本发明提供方法提取获得的寡肽,具有良好的收率和纯度。更重要的是,相对于其他提取方法获得的香菇肽,本发明所述方法制得的香菇寡肽具有显著的抗肿瘤活性,其效果与阳性药物(环磷酰胺)相当。(The invention relates to the technical field of biomedicine, in particular to a preparation method and application of lentinus edodes oligopeptide. According to the method, water extract of mushroom is subjected to CTAB treatment, and then sequentially subjected to alkaline protease enzymolysis, flavourzyme enzymolysis and activated carbon decoloration, and then the part with the molecular weight of 300-1000 Da is taken to prepare the mushroom oligopeptide. Research shows that the oligopeptide extracted by the method provided by the invention has good yield and purity. More importantly, compared with the lentinus edodes peptides obtained by other extraction methods, the lentinus edodes oligopeptide prepared by the method has obvious anti-tumor activity and the effect is equivalent to that of a positive medicament (cyclophosphamide).)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种香菇寡肽的制备方法及用途。
背景技术
香菇属担子菌纲、伞菌目(Agaricales)、口蘑、香菇属(Lentinus)，学名Lentinusedodes，起源于我国，是世界第二大菇，也是我国久负盛名的珍贵食用菌。我国最早栽培香菇，至今已有800多年历史。香菇也是我国著名的药用菌。历代医药学家对香菇的药性及功用均有著述。《日用本草》始入药用，云：蕈生桐、柳、枳椇木上，紫色者，名香蕈。性味甘，平。具有扶正补虚，健脾开胃，祛风透疹，化痰理气，解毒，抗癌之功效。用于正气衰弱，神倦乏力，纳呆，消化不良，贫血，佝偻病，高血压，高脂血症，慢性肝炎，盗汗，小便不禁，水肿，麻疹透发不畅，荨麻疹，毒菇中毒，肿瘤。
近年来，研究表明，香菇干品的蛋白含量为19.3％,香菇蛋白质中氨基酸种类达16种之多，必需氨基酸为7种。目前对于香菇活性物质的研究主要集中在香菇多糖的研究上。大量的研究表明，香菇多糖具有抗肿瘤的作用。事实上，除多糖外，香菇中还存在着大量的肽类物质，而这些物质也通常具有生理活性，但对于香菇肽的生理活性目前研究尚欠缺。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供具有抗肿瘤生理活性的香菇寡肽的制备方法及用途。
本发明提供的香菇寡肽的制备方法包括：
香菇经水提取获得提取液；
所述提取液经浓缩至固形物含量为30％～50％，以CTAB处理后，离心取上清液；
所述上清液依次经碱性蛋白酶酶解、风味蛋白酶酶解、活性炭脱色后，取分子量为300～1000Da的部分，制得香菇寡肽。
本发明所述的寡肽制备方法中，干香菇经提取、除多糖工艺，初步提高提取液的蛋白质含量；提取液经双酶酶解、两步纳滤等工艺提取香菇寡肽，最大限度地将香菇蛋白质水解成寡肽，再经纳滤提纯等工艺，将香菇寡肽的分子量控制在300-1000道尔顿之间。
在本发明中，所述所述香菇为干香菇的菌柄。
在本发明中，所述提取液的制备包括：将干香菇柄粉碎，加5～15倍重量的水，研磨至200目～300目，90℃～100℃提取2小时，经过滤获得滤液①和滤渣；所述滤渣加5～12倍重量的水，90℃～100℃提取1.5小时，经过滤，获得滤液②；合并滤液①和滤液②，6000～20000转/min离心5～30min，取上清为提取液。
一些实施例中，所述所述提取液的制备包括：将干香菇柄粉碎，加5倍重量的水，研磨至200目，90℃提取2小时，经过滤获得滤液①和滤渣；所述滤渣加5倍重量的水，90℃提取1.5小时，经过滤，获得滤液②；合并滤液①和滤液②，6000转/min离心5min，取上清为提取液。
一些实施例中，所述所述提取液的制备包括：将干香菇柄粉碎，加10倍重量的水，研磨至250目，95℃提取2小时，经过滤获得滤液①和滤渣；所述滤渣加10倍重量的水，95℃提取1.5小时，经过滤，获得滤液②；合并滤液①和滤液②，13000转/min离心10min，取上清为提取液。
一些实施例中，所述所述提取液的制备包括：将干香菇柄粉碎，加15倍重量的水，研磨至300目，100℃提取2小时，经过滤获得滤液①和滤渣；所述滤渣加15倍重量的水，100℃提取1.5小时，经过滤，获得滤液②；合并滤液①和滤液②，20000转/min离心15min，取上清为提取液。
本发明中，所述CTAB处理包括：
室温下，边搅拌边加入CTAB至其质量分数为0.5％～1.0％，继续搅拌5min后，静置30～180min。
在本发明实施例中，加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)时，采用CTAB的水溶液，其中CTAB的质量分数为5％～10％。即向提取液中加入质量分数为5％～10％的CTAB水溶液，至提取液中CTAB的质量分数为0.5％～1.0％。
一些实施例中，所述CTAB处理包括：室温下，边搅拌边加入CTAB至其质量分数为0.5％，继续搅拌5min后，静置30min。
一些实施例中，所述CTAB处理包括：室温下，边搅拌边加入CTAB至其质量分数为0.75％，继续搅拌5min后，静置30min。
一些实施例中，所述CTAB处理包括：室温下，边搅拌边加入CTAB至其质量分数为1.0％，继续搅拌5min后，静置30min。
所述CTAB处理后离心取上清液的步骤中，离心的条件为6000～20000转离心5～30min。一些实施例中，离心的条件为6000/min离心5min，或20000/min离心15min。
在本发明中，所述碱性蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入5000～40000国际单位比活力的碱性蛋白酶；pH值为8.5～9.0，45～55℃酶解20～120min。所述碱性蛋白酶酶解后，还包括碱性蛋白酶灭酶的步骤。所述灭酶的条件为90～100℃灭活5～15min。
一些实施例中，所述碱性蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入5000国际单位比活力的碱性蛋白酶；pH值为8.5，45℃酶解20min，然后90℃灭活5min。
一些实施例中，所述碱性蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入21500国际单位比活力的碱性蛋白酶；pH值为9.0，50℃酶解70min，然后95℃灭活10min。
一些实施例中，所述碱性蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入40000国际单位比活力的碱性蛋白酶；pH值为9.5，55℃酶解120min，然后100℃灭活15min。
在风味蛋白酶酶解前，将碱性蛋白酶酶解并灭酶后的溶液冷却至20℃～40℃。
本发明中，所述风味蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入5000～40000国际单位比活力的风味蛋白酶；pH值为6.5～7.5，45～55℃酶解20～120min。所述风味蛋白酶酶解后，还包括风味蛋白酶灭酶的步骤。所述灭酶的条件为90～100℃灭活5～15min。
一些实施例中，所述风味蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入5000国际单位比活力的风味蛋白酶；pH值为6.5，45℃酶解20min，然后90℃灭活5min。
一些实施例中，所述风味蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入21500国际单位比活力的风味蛋白酶；pH值为7.0，50℃酶解70min，然后95℃灭活10min。
一些实施例中，所述风味蛋白酶酶解的条件包括：每kg所述上清液加入40000国际单位比活力的风味蛋白酶；pH值为7.5，55℃酶解20min，然后90℃灭活5min。
在本发明中，所述活性炭脱色的条件包括：经过酶解的酶解液中，加入活性炭至其质量分数为0.1％～1％，70℃，搅拌脱色10～60min。脱色之后还包括过滤取滤液的步骤。
一些实施例中，所述活性炭脱色的条件包括：经过酶解的酶解液中，加入活性炭至其质量分数为0.1％，70℃，搅拌脱色10min。
一些实施例中，所述活性炭脱色的条件包括：经过酶解的酶解液中，加入活性炭至其质量分数为0.55％，70℃，搅拌脱色35min。
一些实施例中，所述活性炭脱色的条件包括：经过酶解的酶解液中，加入活性炭至其质量分数为1％，70℃，搅拌脱色60min。
在本发明中，所述取分子量为300～1000Da的部分包括：
所述脱色后的液体过300道尔顿分子量的纳滤膜，取截留液；
所述截留液过1000道尔顿分子量的纳滤膜，取滤过液。
在本发明中，所述取分子量为300～1000Da的部分之后，还包括浓缩至固形物含量为40％～55％，然后真空度-0.08～-0.1MPa，40～80℃真空干燥的步骤。
一些实施例中，所述取分子量为300～1000Da的部分之后，还包括浓缩至固形物含量为40％，然后真空度-0.08MPa，40℃真空干燥的步骤。
一些实施例中，所述取分子量为300～1000Da的部分之后，还包括浓缩至固形物含量为50％，然后真空度-0.09MPa，60℃真空干燥的步骤。
一些实施例中，所述取分子量为300～1000Da的部分之后，还包括浓缩至固形物含量为55％，然后真空度-0.1MPa，80℃真空干燥的步骤。
所述真空干燥后，还包括过筛的步骤，所述过筛的筛网为20～120目，具体为20目、80目或120目。
本发明所述制备方法制得的香菇寡肽。
经试验验证，本发明制备方法制得的香菇寡肽能够显著抑制小鼠肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的寿命。
本发明所述制备方法制得的香菇寡肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，其包括本发明所述制备方法制得的香菇寡肽。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括给予本发明所述制备方法制得的香菇寡肽。所述给予的方法为口服或注射。
本发明中，所述肿瘤为恶性肿瘤。一些实施例中，所述肿瘤选自肉瘤、膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。一些实施例中，所述肉瘤为平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维组织肉瘤或恶性间皮瘤。本发明实施例中，以S180A肿瘤细胞为实验对象，构建荷瘤S180A的NIH615纯系小鼠。
本发明提供的方法对香菇水提取物进行CTAB的处理后，依次经过碱性蛋白酶酶解、风味蛋白酶酶解、活性炭脱色后，取分子量为300～1000Da的部分，制得香菇寡肽。研究表明，采用本发明提供方法提取获得的寡肽，具有良好的收率和纯度。更重要的是，相对于其他提取方法获得的香菇肽，本发明所述方法制得的香菇寡肽具有显著的抗肿瘤活性，其效果与阳性药物(环磷酰胺)相当。
具体实施方式
本发明提供了一种香菇寡肽的制备方法及用途。，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的香菇寡肽的制备方法包括以下步骤：
(1)取干香菇柄，粉碎，加5～15倍质量水，用研磨机研磨至200目～300目，加热至90℃～100℃，提取2小时，过滤，得滤液①，备用；
(2)滤渣加5～12倍质量水，加热至90℃～100℃，提取1.5小时，过滤，得滤液②，备用；
(3)收集滤液①和滤液②，6000～20000转离心5～30min，取澄清液体；
(4)浓缩至固形物至30％～50％，在搅拌情况下加入5％～10％的十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为0.5％～1.0％，继续搅拌5～15min，室温静置30min-180min；
(5)6000～20000转离心5～30min，除去沉淀，取澄清液体；
(6)澄清液体用NaOH溶液调节pH值至8.5～9.0，按每kg加入5000～40000国际单位比活力的碱性蛋白酶，45～55℃酶解20～120min；酶解结束后进行酶灭活，灭活条件为90～100℃，5～15min，降温至20～40℃，备用；
(7)酶解液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，按每kg液体加入5000～40000国际单位比活力的风味蛋白酶，45～55℃酶解20～120min，酶解结束后进行酶灭活，酶灭活温度为90-100℃，灭活时间为5～15min，降温至20～40℃，备用；
(8)酶解液加入0.1％～1％的活性炭，加热至70℃，搅拌脱色10-60min，过滤，取澄清液体，备用；
(9)澄清液体过300道尔顿分子量的纳滤膜，取截留液体，截留液再过1000道尔顿的纳滤膜，取滤过液，备用；
(10)滤过液浓缩至固形物为40％～55％，真空度为-0.8至-0.1MPa，温度为40℃～80℃进行真空干燥，干燥物进行粉碎，过20～120目筛网，得香菇寡肽。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中风味蛋白酶型号为Flavourzyme 500MG，来自诺维信(中国)投资有限公司。所述碱性蛋白酶型号为Alcalase2.4L，来自诺维信(中国)投资有限公司。本发明中所述干香菇为鲜香菇经干燥制得的产品，干燥工艺包括风干、烘干、晾晒或烤制等。本发明实施例中所述干香菇是指干香菇的菌柄，即为香菇菌盖下面中央的子实体的柄。本发明中所述室温是指室内温度，优选为18～30℃。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
取干香菇10kg，粉碎，加5倍水，用研磨机研磨至200目，加热至90℃，提取2小时，过滤，得滤液30.5kg。滤渣加5倍水，加热至90℃，提取1.5小时，过滤，得滤液35.1kg。收集两次滤液，6000转/min离心5min，得澄清液体55.2kg，澄清液浓缩至固形物至30％，得浓缩液7.4kg，浓缩液在搅拌情况下加入5％的十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为0.5％，继续搅拌5min，室温静置30min。6000转/min离心5min，除去沉淀，得澄清液体6.5kg。
澄清液体用NaOH溶液调节pH值至8.5，按每kg加入5000国际单位比活力的碱性蛋白酶，45℃酶解20min；酶解结束后进行酶灭活，灭活条件为90℃，5min，降温至20℃。酶解液用NaOH溶液调节pH值至6.5，按每kg液体加入5000国际单位比活力的风味蛋白酶，45℃酶解20min，酶解结束后进行酶灭活，酶灭活温度为90℃，灭活时间为5min，降温至20℃。酶解液加入0.1％的活性炭，加热至70℃，搅拌脱色10min，过滤，取澄清液体5.6kg。
澄清液体过300道尔顿分子量的纳滤膜，得截留液体2.2kg，截留液再过1000道尔顿的纳滤膜，得滤过液1.6kg，滤过液浓缩至固形物为40％，真空度为-0.08MPa，温度为40℃进行真空干燥，干燥物进行粉碎，过20目筛网，得香菇寡肽粉416g。
检验结果：
寡肽提取得率：4.16％(寡肽粉重量/干香菇粉重量×100)
寡肽纯度：96.28％(参照标准：GB18186-2000)；
分子量范围：300-1000道尔顿(参照标准：JY/T024-1996)
实施例2：
取干香菇10kg，粉碎，加10倍水，用研磨机研磨至250目，加热至95℃，提取2小时，过滤，得滤液80.2kg。滤渣加10倍水，加热至95℃，提取1.5小时，过滤，得滤液85.5kg。收集两次滤液，13000转/min离心10min，得澄清液体132.8kg，澄清液浓缩至固形物至35％，得浓缩液8.0kg，浓缩液在搅拌情况下加入5％的十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为0.75％，继续搅拌5min，室温静置30min。6000转/min离心5min，除去沉淀，得澄清液体7.8kg。
澄清液体用NaOH溶液调节pH值至9.0，按每kg加入21500国际单位比活力的碱性蛋白酶，50℃酶解70min；酶解结束后进行酶灭活，灭活条件为95℃，10min，降温至30℃。酶解液用NaOH溶液调节pH值至7.0，按每kg液体加入21500国际单位比活力的风味蛋白酶，50℃酶解70min，酶解结束后进行酶灭活，酶灭活温度为95℃，灭活时间为10min，降温至30℃。酶解液加入0.55％的活性炭，加热至70℃，搅拌脱色35min，过滤，取澄清液体5.8kg。
澄清液体过300道尔顿分子量的纳滤膜，得截留液体2.4kg，截留液再过1000道尔顿的纳滤膜，得滤过液1.7kg，滤过液浓缩至固形物为50％，真空度为-0.09MPa，温度为60℃进行真空干燥，干燥物进行粉碎，过80目筛网，得香菇寡肽粉462g。
检验结果：
寡肽提取得率：4.62％(寡肽粉重量/干香菇粉重量×100)
寡肽纯度：98.02％(参照标准：GB18186-2000)；
分子量范围：300-1000道尔顿(参照标准：JY/T024-1996)
实施例3：
取干香菇10kg，粉碎，加15倍水，用研磨机研磨至300目，加热至100℃，提取2小时，过滤，得滤液112kg。滤渣加15倍水，加热至100℃，提取1.5小时，过滤，得滤液116kg。收集两次滤液，20000转/min离心15min，得澄清液体193kg，澄清液浓缩至固形物至50％，得浓缩液8.6kg，浓缩液在搅拌情况下加入5％的十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为1.0％，继续搅拌5min，室温静置30min。20000转/min离心15min，除去沉淀，得澄清液体8.3kg。
澄清液体用NaOH溶液调节pH值至9.5，按每kg加入40000国际单位比活力的碱性蛋白酶，55℃酶解120min；酶解结束后进行酶灭活，灭活条件为100℃，15min，降温至40℃。酶解液用NaOH溶液调节pH值至7.5，按每kg液体加入40000国际单位比活力的风味蛋白酶，55℃酶解120min，酶解结束后进行酶灭活，酶灭活温度为100℃，灭活时间为15min，降温至40℃。酶解液加入1％的活性炭，加热至70℃，搅拌脱色60min，过滤，取澄清液体6.4kg。
澄清液体过300道尔顿分子量的纳滤膜，得截留液体2.5kg，截留液再过1000道尔顿的纳滤膜，得滤过液1.8kg，滤过液浓缩至固形物为55％，真空度为-0.1MPa，温度为80℃进行真空干燥，干燥物进行粉碎，过120目筛网，得香菇寡肽粉505g。
检验结果：
寡肽提取得率：5.05％(寡肽粉重量/干香菇粉重量×100)
寡肽纯度：95.19％(参照标准：GB18186-2000)；
分子量范围：300-1000道尔顿(参照标准：JY/T024-1996)
对比例1：
参照专利ZL201110155206.8的方法制备香菇多肽。
对比例2：
取干香菇10kg，粉碎，加20倍水，用研磨机研磨至120目，加热至80℃，提取1小时，过滤，得滤液168kg。滤渣加18倍水，加热至80℃，提取1小时，过滤，得滤液145kg。收集两次滤液，5000转/min离心31min，得澄清液体298kg，澄清液浓缩至固形物至52％，得浓缩液10.5kg，浓缩液在搅拌情况下加入6％的十六烷基三甲基溴化铵溶液至终浓度为0.8％，继续搅拌16min，室温静置20min。5000转/min离心32min，除去沉淀，得澄清液体9.4kg。
澄清液体用NaOH溶液调节pH值至8.0，按每kg加入4000国际单位比活力的碱性蛋白酶，40℃酶解130min；酶解结束后进行酶灭活，灭活条件为85℃，20min，降温至40℃。酶解液用NaOH溶液调节pH值至6.0，按每kg液体加入4000国际单位比活力的风味蛋白酶，40℃酶解130min，酶解结束后进行酶灭活，酶灭活温度为85℃，灭活时间为20min，降温至40℃。酶解液加入1.5％的活性炭，加热至75℃，搅拌脱色65min，过滤，取澄清液体6.4kg。澄清液体过300道尔顿分子量的纳滤膜，得截留液体2.3kg，截留液再过1000道尔顿的纳滤膜，得滤过液1.6kg，滤过液浓缩至固形物为56％，真空度为-0.1MPa，温度为100℃进行真空干燥，干燥物进行粉碎，过120目筛网，得香菇寡肽粉441g。
检验结果：
寡肽提取得率：4.41％(寡肽粉重量/干香菇粉重量×100)
寡肽纯度：65.19％(参照标准：GB18186-2000)；
分子量范围：300-1000道尔顿(参照标准：JY/T024-1996)
试验实施例：香菇寡肽的抗肿瘤功能
1.试验药品：
样品：本发明实施例1、2、3制备的香菇寡肽
对比例1(专利ZL201110155206.8)及对比例2样品
分子量大于1000道尔顿的香菇肽
分子量小于300道尔顿的香菇氨基酸
对照品：环磷酰胺。
2.动物：NIH615纯系小鼠。
3.瘤株：SI180A、EAC和L615小鼠由中国医学科学院血液研究所提供。
4.实验方法与结果
(1)香菇寡肽对小鼠S180的影响
取NIH纯系小鼠，体重20±2g，雌雄兼用，按《全国抗肿瘤药物体内筛选规程》的方法接种，瘤源为接种6天-9天肿瘤生长良好的S180A，取出腹水，用灭菌的生理盐水按l:4比例稀释制成肿瘤细胞混悬液(5×106细胞/ml)。分别以0.2ml/R接种于小鼠右侧腋窝皮下或者接种于小鼠腹腔内。
24h后随机分组，每组10只，分别每天腹腔或者皮下注射给药一次，香菇寡肽的剂量为60mg/kg，环磷酰胺的剂量为60mg/kg，对照组给同体积的生理盐水，连续给药10d，停药后次日将接种皮下的小鼠处死，取出瘤块称重，计算抑瘤率。接种腹腔的小鼠停药后观察寿命天数，计算生命延长率。结果见下表。
表3：香菇寡肽对小鼠S180的影响
注：与空白对照组比较，*P<0.01；与对比例1、对比例2、分子量大于1000道尔顿的香菇肽样品及分子量小于300道尔顿的香菇氨基酸样品比较，#P<0.01。
表4：香菇寡肽对小鼠S180A的影响
注：与空白对照组比较，*P<0.01；与对比例1、对比例2、分子量大于1000道尔顿的香菇肽、分子量小于300道尔顿的香菇氨基酸比较，#P<0.01。
从试验结果可以看出，香菇寡肽具有显著的对抗小鼠S180的作用，无论是对实体瘤S180还是对腹水型S180(S180A)都具有强大的对抗作用，效果比对比例1(专利ZL201110155206.8)及对比例2制备的香菇肽、分子量大于1000道尔顿的香菇肽、分子量小于300道尔顿的香菇氨基酸均好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。