具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

膀胱癌分类系统的确定和应用：

1、材料准备：招募4028名膀胱癌患者，包括他们的基因表达谱、临床病理信息和总体生存数据(如图1所示)；对于TCGA-BLCA队列，我们从TCGAdata Portal上获得了408例患者的三级基因表达谱，保留了至少50％的样本表达的基因用于后续分析；对于进一步的外部验证队列，我们选取了GSE32894、GSE83586、GSE87304、GSE128702、GSE13507、GSE129871、GSE120736、GSE39016、GSE128701、GSE124035、GSE86411、GSE48276、GSE31684、GSE134292、GSE93527和GSE69795的队列、基因表达谱以及临床信息；TAB-4321和E-MTAB-1803队列，从ArrayExpress下载基因表达谱和成对的临床特征。

2、分类系统确定：

(1)采用无监督非负矩阵分解(NMF)算法对TCGA-BLCA队列中408例膀胱癌患者的mRNA表达谱进行显微切割，并分析了TCGA-BLCA队列中408例膀胱癌患者的mRNA表达谱作为训练队列；

(2)免疫模块获取：预设了相应的模块编号为5到10，当模块总数为9时，第一个模块丰富了免疫富集得分(immune enrichment scores，IES)较高的患者，定义为免疫模块(图2A)，免疫模块中权重最大的150个基因定义为反映免疫模块特征的样本基因；

根据生物学过程的本体论分析，这些基因参与了T细胞活化、抗原处理和提呈、B细胞活化的信号通路，并与Th1/Th2细胞分化通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路和PD-L1表达/PD-1检查点相关通路的活化有关(均P<0.05)；

(3)通过基于150个样本基因的共识聚类，将总共408名膀胱患者重新定义为免疫增强组和非免疫组(图2B)；且图2D中，显示了408名膀胱癌患者在NMF模块中的分布、免疫模块权重、样本基因聚类、最终免疫类别和免疫富集得分；

(4)收集几个与免疫相关的特征免疫相关特征基因列表，帮助确认免疫或非免疫组，并通过ssGSEA确定每个患者的每个免疫相关特征基因列表的富集分数；

观察到免疫组中免疫细胞比非免疫组中免疫细胞增多，包括T细胞(如13个T细胞签名、T细胞、CD8+T细胞和NK细胞所反映的))、B细胞(B细胞簇和B.P.Meta标记)、巨噬细胞、三级淋巴组织结构(TLS)、细胞溶解活性评分(CyT)和干扰素(IFN)标记(均P<0.05，图3A)；

(5)对活化的KEGG信号通路进行了GSEA分析，发现免疫细胞通路(包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和白细胞相关通路)、免疫应答通路(包括趋化因子信号通路、抗原处理递呈通路、细胞粘附分子cAMs和补体凝血级联通路)和促炎通路(包括Fc-Epsilon-RI、NOD样受体和FcγR介导的吞噬通路)均在免疫组中被活化从图2、图3A的结果中，显微解剖了TCGA-BLCA队列中的免疫增强组和非免疫组，并在免疫增强组中观察到活化的免疫相关标记和信号通路。

3、临床验证：

(1)根据TCGA-BLCA、GSE32894、E-MTAB-1803队列的临床资料，属于免疫活化亚组的患者总体生存情况最好，而属于免疫耗竭亚组的患者总体生存时间最短；

(2)免疫耗竭主要集中在T细胞的耗尽，反映在炎症和组织微环境、淋巴细胞以及来自细胞因子的抑制信号的改变上，这些TME上的改变可能会通过阻断免疫检查点来逃避免疫识别，这与患者较差的总体存活率有关；

(3)通过比较膀胱癌患者和接受抗CTLA-4或抗PD-1检查点治疗的黑色素瘤样本的mRNA表达谱来预测其对免疫治疗的潜在反应，免疫活化亚组的患者可以从抗PD-1治疗中受益，但非免疫活化亚组(包括免疫耗竭亚组和非免疫亚组)的患者情况并非如此；

(4)为了进一步了解这三种免疫表型之间的分子多样性，我们比较了CNA、TMB和基因突变；免疫增强组的患者表现出较低的CAN负荷，和较低的染色体臂和局灶水平的基因缺失；PD-1和PD-L1的缺失拷贝数重复证实了这种相关性，CTLA-4与免疫细胞浸润水平呈正相关；

(5)在染色体高度不稳定(也称为高CNA)的肿瘤中，通过MHC-I类途径的抗原呈递受到抑制，而且高CNA在免疫逃避中起着关键作用；此外，接受免疫检查点阻断治疗的患者如果表现出较低的CAN负荷，就会有持久的临床收益并获得更好的生存；

(5)提取每个亚群的特定突变基因发现：突变型TP53、TTN、PIC3CA和RB1在免疫增强组中的比例高于非免疫组；

(6)携带突变PIK3CA的结直肠癌患者CD3+和CD8+细胞密度的中位数较高，免疫治疗的临床受益率也较高(50％对8.6％)；此外，在免疫活化的亚组中ERBB2突变的比率很高，ERBB2扩增或过表达是乳腺癌抗ERBB2靶向治疗的生物标志物，激活的ERBB2癌基因通过诱导CCL2和PD-1配体调节肿瘤浸润性免疫细胞的募集和激活以及曲妥珠单抗的活性；ERBB2基因的V659E突变与在体外中对阿法替尼和拉帕替尼治疗的敏感性改变有关，且EP300基因突变率在免疫耗竭亚组中最高；

(7)在CBP/EP300对调节性T细胞(Treg)中的重要性上，因为在小鼠调节T细胞(Treg)中缺失EP300或CBP会导致Treg抑制功能受损；肿瘤内Tregs抑制效应T细胞对肿瘤抗原的反应，产生免疫抑制的微环境，这与肿瘤的不良预后有关。

综上，在4028名膀胱癌患者中定义并验证了一种新的分类器，将他们分为免疫活化亚组、免疫耗竭亚组和非免疫组。免疫活化亚组患者可从单次抗PD-1免疫治疗中获益更多，对于免疫耗竭亚组患者，免疫检查点阻断治疗加转化生长因子-β抑制剂或EP300抑制剂显示更好的疗效。

实施例2：

肿瘤免疫微环境免疫耗竭表型以基质细胞活化为特征：

成纤维细胞、间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells，MSCs)和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是肿瘤间质的关键成分，支持和连接肿瘤细胞，特别是在肿瘤的晚期，肿瘤细胞的遗传和表观遗传改变是由活化的基质成分驱动的；MSCs作为肿瘤的内在调节因子，可以分泌抑制可溶性因子，改变细胞表面标志物，从而抑制免疫微环境。MSCs对PD-L1的调节影响T细胞增殖的抑制和T调节细胞(T regulatory cells,Tregs)的诱导，MSCs通过减少前炎症因子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的表达，或通过促进2型因子-白细胞介素-10和白细胞介素13的表达，来抑制免疫过程。

(1)采用预先定义的基质活化标志，将免疫组进一步划分为免疫活化和免疫耗竭两种免疫表型，以反映免疫应答状态；

(2)在TCGA-BLCA队列中，11.0％(45/408)的膀胱癌患者由活化的免疫表型和失活的间质表型定义，属于免疫活化亚组，而另外27.0％(110/408)的患者属于免疫耗竭亚组，具有活化的间质表型(图3A)；

成纤维细胞分泌的细胞外基质细胞因子(C-ECM)可以募集免疫抑制细胞，转化生长因子-β是免疫微环境中公认的免疫抑制剂，TME中的Treg细胞和MDSC细胞可以反映免疫耗竭状态；

结果显示，免疫耗竭亚组的TITR、Wnt/TGF-β、转化生长因子-β1活化和C-ECM的表达特征均高于免疫活化亚组(均P<0.05，图3A)。TIM-3和LAG3与免疫耗竭状态相关，在免疫耗竭亚组中观察到TIM-3(P＝0.008)和LAG3(P＝0.218)升高；根据图3A的结果，将免疫类别分为免疫活化和免疫耗尽两个亚组，免疫耗竭标记TIM-3和LAG3证实了免疫耗竭亚组的间质富集评分、TITR、MDSC和Wnt/TGF-表达特征增加。

实施例3：

免疫和非免疫组间遗传表型的异质性：

为了证实免疫细胞在免疫和非免疫类别中的浸润，比较408例膀胱癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的丰度，通过TCGA样本HE染色的全片图像预先估计。

结果表明，免疫组TIL丰度高于非免疫组(P<0.001，图3B)，与免疫组和非免疫组的定义一致；此外，观察到免疫增强组PD-L1的表达水平高于非免疫组(P<0.001，图3C)。

由于基因拷贝数改变(CNA)、肿瘤突变负荷(TMB)和肿瘤抗原与肿瘤免疫活化之间存在串扰，在非免疫型患者中，染色体臂和局灶的基因缺失水平均增加(P_Armdel<0.001，P_focal-del＝0.007)，但CNA扩增不明显(P_arm-Amp＝0.733，P_focal-Amp＝0.065)(图3D)，这反映了免疫浸润与基因CNA缺失呈正相关。

使用在线工具TIMER，重复确认免疫浸润与基因CNA缺失、PD-1、PD-L1和CTLA-4的整体深度缺失和臂水平缺失之间的关联，以及三个主要的免疫检查点与免疫细胞浸润的减少，特别是CD4+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞的减少。

免疫组TMB高于非免疫组(P＝0.001，图3E)，而肿瘤抗原水平无差异(P＝0.109，图3F)；进一步比较了免疫亚群中的特异性基因突变，ERBB2(P＝0.035)、KMT2A(P＝0.013)、PKHD1(P＝0.007)和MDN1(P＝0.015)突变与免疫活化亚组(图3G)相似，而EP300(P＝0.020)、HMCN1(P＝0.014)、AKAP9(P＝0.003)和MACF1(P＝0.016)突变在免疫耗竭亚组中更为丰富(图3H)。

综上所述，免疫类别与较低的拷贝数缺失、较高的TIL丰度、较高的TMB和较高的PD-L1相关，但与肿瘤抗原无关，免疫表型中的特异性突变基因是多样的。

实施例4：

免疫活化亚组的患者的治疗反应：

1、为了评估三种新定义的免疫表型对膀胱癌患者免疫治疗的反应：

(1)收集348例患者的基因表达谱和临床结果，这些患者来自大型的II期试验IMlive 210队列，研究了阿替唑珠单抗阻断PD-L1的临床治疗作用。

(2)观察终点为对抗PD-L1治疗的反应，包括完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、稳定期(stable disease,SD)、进展期(progressivedisease,PD)。客观有效率(objective response rate，ORR)包括CR和PR患者，疾病控制率(disease control rate,DCR)包括CR、PR和SD患者。

(3)根据TCGA-BLCA训练队列产生的150个DEGs，首次将患者分为免疫增强亚组(237/348，65.2％)和非免疫组(121/348，34.8％)。

(4)免疫增强亚族中，间质细胞活化预测阴性的85例(24.4％)为免疫活化亚组，其余142例(142/348)为免疫耗竭亚组(图4A)。

其中，免疫组患者的免疫特征明显丰富，包括预定义的免疫富集评分、免疫细胞亚群评分、免疫信号评分以及多个免疫细胞的签名(均P<0.05)。在免疫活化亚群和免疫耗竭亚群的分离中，MDSC、TITR、Treg细胞、Wnt/TGFβ、转化生长因子β-1和C-ECM特征在免疫耗竭亚群中表现出较高的富集分数，这与TCGA-BLCA训练队列中的特征一致。

观察到免疫活化亚组中半数以上的患者能从抗PD-L1治疗中获益，客观有效率为24.66％，疾病控制率为52.06％；然而，免疫耗竭亚组中的大多数患者在抗PD-L1治疗后出现PD结果(P＝0.028，图4B)。更重要的是，如果只关注CR和PD的治疗结果，发现免疫活化亚组的患者显示出最高的有效率(20.5％比15.1％比4.8％，图4C)。

综合图4的结果，新定义的三型免疫表型膀胱癌患者可以区分在免疫活化亚组中接受抗PD-L1治疗的合适患者群体。

2、为了验证免疫活化亚群的免疫治疗效果：

使用SubMap分析比较了IMLIGN210队列、MD Anderson黑色素瘤队列和免疫活化亚群TCGA-BLCA、GSE32894、E-MTAB-1803队列中应答者的基因表达分布。

发现，在IMLITY 210队列中，上述三个队列中免疫活化亚组的患者与抗PD-L1治疗无效的患者相比，具有更相似的基因分布，但在非免疫活化亚组中，这些患者的基因分布不同(均为Bonferroni校正P<0.05)(图5A)。

此外，还观察到了与MDAnderson黑色素瘤队列比较的一致结果，免疫活化亚组的患者在抗PD-1治疗中受益更多(均为Bonferroni校正P<0.05)(图5B)。

此外，发现在免疫活化亚组中的患者表现出较好的预后，而在免疫耗竭亚组的患者预后较差(图5C)。

结合图5的结果，免疫活化亚组的患者可以从抗PD-1或抗PD-L1治疗中受益更多，并且平均总生存期最长。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。