具体实施方式

本文公开的流动池具有允许流动池上单个文库空间隔离的特定架构。单个文库包括较大核酸样品的相似大小(例如，小于1000bp)的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)片段，并且该片段在相应的末端具有附接的衔接子。在本文公开的一些实施例中，文库包含在引入到流动池的载体上或载体中。在本文公开的一些其他实施例中，在将样品引入到流动池后，在流动池上原位形成文库。在一些实施例中，流动池架构包括可捕获单个载体或样品的单个捕获位点。这些捕获位点位于单个室中，且因此可以在单个室内空间隔离流动池上的载体(且因此载体内或载体上的文库)或样品。在其他实施例中，流动池架构包括没有捕获位点的室。在这些其他实施例中，室本身能够物理限制一个或多个载体或样品。

载体的空间隔离和限制可有助于实现载体中或载体上包含的文库的空间隔离和限制。样品的空间隔离和限制有助于实现在流动池上从样品产生的文库的空间隔离和限制。在这些实施例中的任何一个中，从单个载体释放的或在流动池上从单个样品形成的文库可以包含在特定的室内。因此，该室架构减少了文库片段在整个流动池表面上的随机结合。此外，文库片段的转运和接种以及随后的簇生成也可能被限制在每个室内。因此，限制可导致基本上均匀的文库片段接种，且因此获得基本上均一的簇密度。在测序过程中，随着核苷酸被并入到簇的相应模板链中，单个簇产生荧光信号的“空间云(spatial cloud)”。将簇限制在室中至少可以减少空间云串扰和/或重叠，并且还可以改善空间云的识别。再进一步地，由于从任何单个室获得的阅读片段可能由相同样品产生，因此它们可用于通过以生物信息方式将短阅读片段缝合在一起来重构样品。

本文公开的流动池架构还可以提高表面积的整体利用率。

定义

除非另有说明，本文中使用的术语应被理解为采取在相关领域的通常含义。本文中使用的若干术语及其含义如下所示。

如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”指单数及复数，除非上下文另有明确指示。本文使用的术语“包含”与“包括”、“含有”或“具有……的特征”同义，并且是包含性的或开放式的且不排除额外的、未陈述的元素或方法步骤。

在整个说明书中提及“一个实施例”、“另一实施例”、“一实施例”等意味着结合该实施例描述的特定元素(例如，特征、结构、组成、配置和/或特性)包括在本文中描述的至少一个实施例中，并且在其他实施例中可能存在或不存在。另外，应当理解，除非上下文另有明确规定，对于任何实施例的所描述的元素可以以任何合适的方式在各种实施例中组合。

整个本公开(包括权利要求)中使用的术语“基本上”和“大约”用于描述和说明小的波动，例如由于处理中的变异。例如，这些术语可指低于或等于规定值的5％，例如低于或等于规定值的2％，例如低于或等于规定值的1％，例如低于或等于规定值的0.5％，例如低于或等于规定值的0.2％，例如低于或等于规定值的0.1％，例如低于或等于规定值的0.05％。

衔接子：可例如通过连接或标签化(tagmentation)与核酸分子融合的线性寡核苷酸序列。在一些实施例中，衔接子与引入到流动池的任何靶序列的3’端或5’端基本上不互补。合适的衔接子长度范围可为约10个核苷酸至约100个核苷酸，或约12个核苷酸至约60个核苷酸，或约15个核苷酸至约50个核苷酸。衔接子可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些实施例中，衔接子包括在一个或多个位置处的一个或多个可切割基团。在一些实施例中，衔接子可包括与引物的至少一部分互补的序列，例如包括通用核苷酸序列(例如P5或P7序列)的引物。在一些实施例中，衔接子可以包括有助于下游纠错、识别或测序的索引或条码序列。该索引对于核酸分子(例如片段)的样品或来源可能是独特的。在一些实施例中，衔接子可包括测序引物序列或测序结合位点。不同衔接子的组合可被并入到核酸分子中，例如DNA片段。

捕获位点：允许复合物或样品进行定位的物理改性和/或化学性质改变的流动池表面的一部分。在一个实施例中，捕获位点可包括化学捕获剂。

载体：能够具有其中包含的测序文库的水凝胶支持物或能够具有附接于其表面的测序准备核酸片段的固体支持物。

化学捕获剂：能够附接、保留或结合于目标分子(即，复合物或样品)的材料、分子或部分。一种示例性化学捕获剂包括与靶核酸的至少一部分互补或与目标分子连接的捕获核酸(例如，捕获寡核苷酸)。另一示例性化学捕获剂是接头。对于原始DNA或RNA样品，接头可在一端包括核酸结合部分，例如通过电荷或疏水相互作用结合的嵌入剂。对于细胞样品，接头可包括细胞膜结合部分(例如，针对表面蛋白的抗原)或膜穿透部分(例如，在一端的磷脂)。再另一示例性化学捕获剂包括能够结合目标分子(或连接于目标分子的连接部分)的受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)。化学捕获剂的再另一实例是能够与目标分子形成静电相互作用、氢键或共价键的化学试剂(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、Diels-Alder等)。

复合物：载体(如水凝胶支持物或固体支持物)以及附接于载体上或包含在载体内的测序准备核酸片段。载体还可以包括结合对的一个成员，其另一个成员是捕获位点的部分。

外部固定剂：一种气体、液体或粘性介质，其不与已引入到流动池室的复合物或样品混溶。气体外部固定剂可用于在复合物或样品周围产生液滴。气体外部固定剂的实例是以合适的流速指引通过流动池的空气。例如，空气可用于从流动池中吸取包含复合物或样品的流体，其形成包含复合物或样品的液体的液滴。形成的液滴起到扩散屏障的作用。液体或粘性介质用于防止从复合物中释放的或在例如流动池表面上的室内形成的测序文库的扩散。外部固定剂可形成扩散屏障，因为测序文库或任何其他多核苷酸在外部固定剂中几乎没有溶剂化。液体形式的外部固定剂实例包括疏水性油，例如矿物油、硅油、全氟化油、氟化碳油(例如，来自3M的FLUORINERT^TMFC40)或其组合。粘性介质形式的外部固定剂的实例包括含有聚合物(例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等)的缓冲剂、葡聚糖、蔗糖、甘油等。在一些实施例中，粘性介质是温度响应凝胶。温度响应凝胶在非接种温度下是非粘性的，且在接种温度下变成粘性介质。温度响应凝胶的实例包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(PEO-PPO-PEO)/锂皂石纳米颗粒复合材料。

片段：遗传物质(如DNA、RNA等)的一部分或段。

水凝胶或水凝胶基质：包含有机聚合物(天然或合成)的胶体材料，其通过共价键、离子键或氢键交联以形成包裹水分子而形成凝胶的三维开放网格结构。在一个实施例中，水凝胶包括约60％至约90％的流体，例如水，以及约10％至约30％的聚合物。水凝胶可以是多孔的，即包括开放/空隙空间。孔隙率是水凝胶的分数体积(无量纲)，即测量材料中的空隙空间并且是相对于总体积的空隙体积的分数，作为0-100％的百分比(或0-1的分数)。在一个实施例中，水凝胶的孔隙率可在约50％(0.5)至约99％(0.99)的范围内。多孔性可能足以允许试剂(例如，酶、化学品和较小尺寸的寡核苷酸(少于50个碱基对，例如，引物))的扩散，但禁止较大尺寸的核酸分子(例如，样品、片段等)的扩散。

水凝胶支持物：具有至少基本上球形的水凝胶(例如，水凝胶珠)，在其中可包含测序文库。

核酸分子：任何长度的聚合形式的核苷酸，且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。该术语可指单链或双链多核苷酸。

“靶”或“模板”核酸分子可指待分析的序列。

核酸分子中的核苷酸可包括天然存在的核酸及其功能类似物。功能类似物的实例能够以序列特异性的方式与核酸杂交，或者能够用作特定核苷酸序列复制的模板。天然存在的核苷酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似物结构可具有替代的主链连接，包括本领域已知的多个种类中的任何一种。天然存在的核苷酸通常具有脱氧核糖(例如，在DNA中发现的)或核糖(例如，在RNA中发现的)。类似物结构可具有替代糖部分，其包括本领域已知的多个种类中的任何一种。核苷酸可包括天然或非天然碱基。天然DNS可包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种，且天然RNA可包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种。可以使用任何非天然的碱基，例如锁核酸(LNA)和桥连核酸(BNA)。

引物：能够与目的靶序列杂交的核酸分子。在一个实施例中，引物用作核苷酸可在其上通过聚合酶聚合的底物。例如，扩增引物用作模板扩增和簇生成的起点。在再另一个实施例中，引物可以用作DNA或RNA合成的起点。例如，测序引物可以与合成的核酸模板链杂交，以引发与合成的核酸模板链互补的新链的合成。引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些实施例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。

样品：遗传物质的任何来源，如细胞、微生物组或核酸。在一些实施例中，细胞是包括原核或真核细胞的单一细胞。在一些实施例中，细胞为哺乳动物细胞、人类细胞或细菌细胞。在一些实施例中，核酸是长的DNA分子，包括病毒核酸、细菌核酸或哺乳动物核酸。在一些实施例中，样品通过插入结合到固体支持物(例如珠)表面上的转座子而结合(作为片段)。

测序准备核酸片段：在3’端和5’端具有衔接子的遗传物质的一部分(片段)。在测序准备核酸片段中，每个衔接子包括已知的通用序列(例如，其与流动池上的引物的至少一部分互补)和测序引物序列。两种衔接子还可以包括索引(条码或标签)序列。在一个实施例中，P5侧可包含珠索引，和P7侧可包含样品索引。测序准备核酸片段可通过例如插入到结合于固体支持物(例如，珠)的表面的转座子结合；或通过结合对或其他可切割的接头直接固定。测序准备的核酸片段也可以包含在水凝胶支持物内。

接种：在本文公开的流动池实施例的室中衔接的片段(例如，测序准备核酸片段)的固定。

测序文库：一个或多个靶核酸分子的核酸片段的集合，或者片段的扩增子。在一些实施例中，片段在其3’和5’端连接到一个或多个衔接子。在一些实施例中，测序文库由一个或多个靶核酸分子制备，并且是复合物的部分。在其他实施例中，使用样品在流动池表面上制备测序文库。

固体支持物：由刚性或半刚性材料制成的小物体，其形状具有例如球形、椭圆形、微球或其他公认的颗粒形状的特征，无论其具有规则的还是不规则的维度。固体支持物可具有附接于其上的测序文库。可用于固体载体的示例材料包括但不限于玻璃；塑料，例如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(来自Chemours Co.的)；多糖或交联多糖，如琼脂糖或Sepharose；尼龙；硝酸纤维素；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅；碳纤维、金属；无机玻璃；光纤束或各种其他聚合物。示例性固体支持物包括受控孔隙玻璃珠、顺磁性或其他磁性珠、氧化钍溶胶、Sepharose珠、纳米晶体和本领域中已知的其他物质，如例如来自BangsLaboratories,Fishers Ind的Microsphere Detection Guide中所述的。

标签化：通过转座体对核酸分子(例如，DNA或RNA样品)进行修饰以在单一步骤中使核酸分子片段化和将衔接子连接到片段的5’端和3’端。标签化反应可用于制备测序文库，特别是包括固体支持物的复合物。标签化反应将随机样品片段化和衔接子连接结合成单一步骤，其提高了测序文库制备过程的效率。

转座体：整合的酶(例如，整合酶或转座酶)与包含整合识别位点(例如，转座酶识别位点)的核酸之间形成的复合物。

通用核苷酸序列：两个或更多个核酸分子共有的序列区域，其中该分子也具有彼此不同的区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可允许使用通用捕获核酸(即具有与引物的至少一部分互补的序列的衔接子)群体捕获若干不同的核酸。类似地，存在于分子集合的不同成员中的通用序列可允许使用通用序列结合位点(测序引物序列)的群体对若干不同的核酸进行扩增或复制。

流动池架构

图1示出了示例流动池10的一部分。流动池10包括基底12、限定在基底12上或基底12中的多个室14、限定在基底12中且在多个室14的每一个的周界内的多个凹陷16、附接在每个凹陷16内的引物20以及位于多个室14的每一个内的捕获位点22。

基底12通常是刚性的，且不溶于水性液体。基底12可以是单层或多层结构。合适的基底12的实例包括环氧硅氧烷、多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)或其衍生物、玻璃、改性玻璃、塑料、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、硅石(二氧化硅)、熔融二氧化硅、二氧化硅基材料、硅酸铝、硅、改性硅(例如，硼掺杂p+硅)、氮化硅(Si₃N₄)、五氧化二钽(TaO₅)或其他钽氧化物(TaO_x)、氧化铪(HaO₂)、无机玻璃等。适用于基底12的塑料的一些实例包括丙烯酸类、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(如来自Chemours Co.的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(例如来自Zeon的)、聚酰亚胺等。基底12也可以是玻璃或硅或POSS，其表面具有氧化钽或另一陶瓷氧化物的涂层。基底12也可以是玻璃或硅，其表面具有POSS涂层。合适的基底12的另一实例是绝缘体上硅基底。

基底12的形式可以是晶片、面板、矩形片、模或任何其他合适的构型。在一个实施例中，基底12可以是直径范围为约2毫米至约300毫米的圆形晶片或面板。作为更具体的实例，基底12是直径范围为约200毫米至约300毫米的晶片。在另一实施例中，基底12可以是最大尺寸高达约10英尺(～3米)的矩形片或面板。作为具体实例，基底12是宽度范围为约0.1毫米至约10毫米的模。虽然已经提供了示例尺寸，但是应当理解，可以使用具有任何合适尺寸的基底12。

多个室14可被限定在基底12上或基底12中。

图2A示出了限定在基底12上的室14的实施例。在本文公开的实施例中，当i)基底表面S₁₂限定室14的底表面和ii)隔离材料18位于基底12上并限定了室14的壁W₁₈时，室14被视为“限定在”基底12上。当绝缘体上硅基底与隔离材料18一起使用时，室14的壁W₁₈可以部分地由基底的最外层硅层和隔离材料18限定。

隔离材料18可以是疏水性材料，例如氟化聚合物、全氟化聚合物、硅聚合物或其混合物。疏水性材料的聚合物骨架可以是碳或硅或其组合。在一些实施例中，氟化聚合物为无定形含氟聚合物(其商业上可获得的实例包括来自AGC Chemicals的系列的那些，其具有以下末端功能团之一：A型：-COOH，M型：-CONH-Si(OR)_n或S型：-CF₃)、聚四氟乙烯(例如来自Chemours Co.的)、parylen(如A级、F级、HT级)、氟化烃、含氟丙烯酸共聚物(如来自Cytonix的FLUOROPEL^TM)、(十三氟-1,1,2,2-四氟辛基)三氟硅烷(FOTS)、氟硅烷或等离子体沉积的氟碳化合物，或者其混合物。作为另一个实例，疏水聚合物或疏水聚合物层可包括疏水性烃，如1-十七炔。在一些实施例中，硅聚合物是聚二甲基硅氧烷或另一种硅氧烷。当凹陷16中的材料是亲水性的时，可能特别希望的是将疏水性材料用于隔离材料18。其他聚合物可用作隔离材料18，只要所得结构能够诱导在结构上移动的液体成珠状(pearling)。或者，如果凹陷16中的材料是疏水性的，则可能希望的是将亲水性材料用于隔离材料18。隔离材料18的疏水或亲水特性可有助于将试剂导向凹陷16。

在一个实施例中，隔离材料18可被沉积在基底12上，然后使用光刻法图案化。在其中基底12是绝缘体上硅基底的实施例中，隔离材料18和最外硅层可以使用光刻法图案化。作为一个实施例，可以使用掩膜(例如，光致抗蚀剂)来限定其中隔离材料18被沉积的空间/位置。然后可以沉积分离的材料18，并移除掩膜(例如，通过剥离(lift-off)、溶解或另一合适的技术)。作为另一实施例，可以沉积隔离材料18，和然后可以在隔离材料18上沉积掩膜。可以使用光刻法对掩模进行图案化，并且可以通过等离子体蚀刻或氧气的干式蚀刻去除隔离材料18的任何暴露部分。然后可以移除掩模以揭示剩余的隔离材料18。在再另一实施例中，隔离材料18可以被层压到基底12上，或者从模具或牺牲层转移到基底12上。在再另一实施例中，可以使用微接触印刷(使用印章)、气溶胶印刷或喷墨印刷来印刷隔离材料18。

图2B示出了限定在基底12中的室14的实施例。在本文公开的实施例中，当i)基底表面S₁₂限定室14周围的间隙区域，ii)另一基底表面S’₁₂限定室14的底表面，以及iii)基底12还限定了室14的壁W₁₂时，室14被视为“限定在”基底12中。

在该实施例中，室14可以被图案化到基底中。图案化可包括将室14蚀刻到基底12中和/或使用压印光刻。

无论形成在基底12上还是基底12中，室14可以任何合适的图案或布局分布在整个基底12上。可以设想室14的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个实施例中，室14布置成六边形网格用于紧密包装和提高的密度。其他布局可包括例如平行四边形布局(即，矩形、正方形等)、三角形布局、圆形布局等。在一些实施例中，布局或图案可以是成行和列的室14的x-y格式(如图1所示)。

室14可以具有任何合适的形状，例如圆形(如图1所示)、椭圆形、多边形(例如，三角形、四边形、五边形等)，等等。

每个室14的尺寸可以通过其开口面积、直径和/或长度和宽度来表征。如图1所示，流动池10具有位于每个室14内的多个凹陷16。因此，室14的尺寸大于各个凹陷16的尺寸。换句话说，室14的维度大于各个凹陷16的维度。在该实施例中，“维度”指每个室开口或凹陷开口所占据的面积，和/或室14或凹陷16的直径，和/或每个室14或凹陷16的长度和宽度。在图1所示的实施例中，每个室14的开口面积和直径大于每个凹陷16的开口面积和直径。每个室14的开口面积、直径或长度和宽度取决于将位于室14内的凹陷16的数量以及将位于室14内的捕获位点22的尺寸。

可以选择每个室开口所占据的面积，使得复合物(其实例在图4A至图4C中示出)可以进入室14并附接于室14中的捕获位点22。在一个实施例中，每个室开口的面积可以为至少约1μm²、至少约10μm²、至少约100μm²或更大。每个室开口所占的面积可大于或介于上述规定值之间。

在一些情况下，每个室14的直径或长度和宽度可为至少约1μm、至少约10μm、至少约20μm、至少约30μm、至少约40μm、至少约50μm、至少约100μm或更大。室直径的实例在约1μm至约1000μm的范围内。室直径的另一实例在约10μm至约50μm的范围内。当室14具有长度和宽度时，应当理解，长度和宽度可以相同或不同。

室14还可具有取决于用于形成室14的技术的深度。例如，当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷形成室壁W₁₈时，每个室14的深度可以是单层厚度。对于其他实施例，每个室14的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm或更大。在另一实施例中，深度为待引入室14中的复合物的平均直径的至少约50％。在一个实施例中，该深度可在约10μm至约30μm的范围内。该深度足以阻断释放的文库片段在相邻室14之间的横向扩散，从而在没有任何外部固定剂的情况下将释放的文库片段保持在室14内。在另一实施例中，深度为5μm或更小。应当理解，每个室14的深度可以大于、小于或介于上述规定值之间。

相邻的室14可通过另外的材料18的表面S₁₈(图2A中所示)或通过基底12的表面S₁₂(图2B中所示)分隔。平均室间距代表从一个室14的中心到相邻室14的中心的间隔(中心到中心间隔)或从一个室14的边缘到相邻室14的边缘的间隔(边缘到边缘间隔)。室14的布局或图案可以是规则的，使得平均间距的变异系数较小，或者布局或图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一情况下，平均间距可以是例如至少约1μm、至少约5μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。在一个实施例中，平均间距是室14直径的2倍。室14的特定图案的平均间距可以在从上述范围中选择的下限值之一和上限值之一之间。虽然已经提供了示例性的平均室间距值，但是应当理解，也可以使用其他平均室间距值。

多个凹陷16可被限定在基底12中。在本文公开的实施例中，当i)基底表面S₁₂或S’₁₂限定分隔凹陷16的间隙区域24，ii)另一基底表面S”₁₂限定凹陷16的底表面，以及iii)基底12也限定凹陷16的壁时，凹陷16被认为“限定在”基底12中。

凹陷16可以被图案化到基底12中。图案化可包括将凹陷16蚀刻到基底12中和/或使用压印光刻。

凹陷16的相应子集可以以任何合适的图案或布局分布在每个室14上。每个室14中凹陷16的图案可以相同，或者不同的室14中可以使用不同的凹陷16的图案。可以设想许多不同的凹陷16图案/布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个实施例中，凹陷16布置成六边形网格用于紧密堆积和提高的密度。其他布局可包括例如平行四边形布局(即，矩形、正方形等)、三角形布局、圆形布局，等等。在图1所示的实施例中，每个室14中的凹陷16围绕捕获位点22以圆形图案布置。如图1中所示，多个室14可以以第一图案(例如，2x2)布置在整个基底12上，并且相应的凹陷子集在每个室14内以第二图案(例如，圆形)布置。

每个凹陷16可以具有任何合适的形状(以及相应的三维几何结构)，例如圆形(如图1中所示)、椭圆形、多边形(例如，三角形、四边形、五边形等)，等等。

每个凹陷16的尺寸可以通过其开口面积、直径和/或长度和宽度来表征。如图1所示，流动池10具有位于每个室14内的多个凹陷16。因此，每个凹陷16的尺寸小于其所在的室14的尺寸。

可以选择每个凹陷开口所占据的面积，以使得复合物不能进入凹陷16。在一个实施例中，每个凹陷开口的面积可以为至少约1×10^-4μm²、至少约1×10^-3μm²、至少约1×10^-2μm²、至少约0.1μm²、至少约0.5μm²、至少约1μm²或至少约4μm²。每个凹陷开口所占据的面积可小于或介于上述规定值之间。

在一些情况下，每个凹陷16的直径或长度和宽度可为至少约1纳米、至少约50纳米、至少约100纳米、至少约500纳米或更大，只要维度小于室的直径或长度和宽度。凹陷直径的实例范围为约1纳米至约500纳米。凹陷直径的另一个实例范围为约300纳米至约2μm。

凹陷16也可以具有深度。作为示例，每个凹陷16的深度可为至少约10纳米、至少约50纳米、至少约1μm、直至约2μm。在一些实施例中，深度为约0.4μm。应当理解，每个凹陷16的深度可大于、小于或介于上述规定值之间。

在一个实施例中，凹陷16的纵横比(直径:深度)可在约1:1至约1:2的范围内，或在约1:1.25至约1:1.75的范围内。

相邻的凹陷16可通过给定室14内的间隙区域24分隔开。平均凹陷间距表示从一个凹陷16的中心到相邻凹陷16的中心的间隔(中心到中心间隔)或从一个凹陷16的边缘到相邻凹陷16的边缘的间隔(边缘到边缘间隔)。凹陷16的布局或图案可以是规则的，使得平均间距的变异系数较小，或者布局或图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一情况下，取决于室14的维度，平均间距可以是例如至少约10纳米、至少约0.1μm、至少约0.5μm或更大。可选地或附加地，平均间距可以是例如至多约0.5μm或至多约0.1μm或更小。特定凹陷16图案的平均间距可以在从上述范围中选择的下限值之一和上限值之一之间。

引物20也附接在每个凹陷16内。引物20可以是任何正向扩增引物或反向扩增引物，其包括可附接于至少存在于每个凹陷16底部(即，表面S”₁₂上)的层26的官能团。引物20可在每个凹陷16内形成捕获寡核苷酸的草坪(lawn)，捕获寡核苷酸可与测序准备核酸片段的衔接子结合。

在一个实施例中，引物20可以通过在引物20的5’端处或其附近的单点共价连接固定在层26上。该连接使得i)引物20的衔接子特异性部分游离以与其同源的测序准备核酸片段退火和ii)3’羟基游离用于引物延伸。任何合适的共价连接可用于此目的。可使用的封端引物的实例包括炔封端引物、四嗪封端引物、叠氮基封端引物、氨基封端引物、环氧基或缩水甘油基封端引物、硫代磷酸酯封端引物、硫醇封端引物、醛封端引物、肼封端引物、亚磷酰胺封端引物和三唑啉二酮封端引物。在另一实施例中，引物20可以通过非共价相互作用固定在层26上。在一个实施例中，每个引物20可包括可非共价结合层26的连接分子(例如，生物素)。在一些实施例中，使用两种不同的引物20。合适的引物20的具体例子包括用于在HISEQ^TM、HISEQX^TM、MISEQ^TM、MISEQDX^TM、MINISEQ^TM、NEXTSEQ^TM、NEXTSEQDX^TM、NOVASEQ^TM、GENOME ANALYZER^TM、ISEQ^TM和其他仪器平台上测序的Illumina Inc.出售的商用流动池表面上使用的P5和P7引物。

在一个实施例中，层26是能够非共价结合附接于引物20的连接分子的物质。作为一个实施例，连接分子为生物素，且层26为抗生物素蛋白、链霉亲和素等。在该实施例中，层26可通过微接触印刷或气溶胶印刷、沉积和抛光或另一合适的选择性沉积技术施加。

在另一实施例中，层26是能够共价附接于引物20的聚合物。凹陷16的底表面(例如，S”₁₂)可被活化，且然后可施加聚合物以形成层26。

在一些实施例中，活化可包括施加硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)。在其他实施例中，活化可包括等离子体灰化以产生可粘附于用于形成层26的聚合物的表面激活剂(例如，-OH基团)。

可用于形成层26的聚合物的一个实例包括丙烯酰胺共聚物，例如聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺，PAZAM。PAZAM和一些其他形式的丙烯酰胺共聚物通过以下结构(I)表示：

其中：

R^A选自叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的链烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、氧化腈、硝酮和硫醇；

R^B为氢或任选取代的烷基；

R^C、R^D和R^E各自独立地选自H和任选取代的烷基；

每一个-(CH₂)_p-可被任选取代；

p是1至50范围内的整数；

n是1至50,000范围内的整数；和

m是1到100,000范围内的整数。

本领域普通技术人员将认识到，结构(I)中重复出现的“n”和“m”个特征的排列是代表性的，并且单体亚单元可以以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，随机、嵌段、图案化或其组合)。

在一些实施例中，PAZAM是线性聚合物。在其他一些实施例中，PAZAM是轻微交联的聚合物。

在其他实施例中，可用于形成层26的聚合物可以是结构(I)的变体。在一个实施例中，丙烯酰胺单元可以用N,N-二甲基丙烯酰胺()替代。在该实施例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用替代，其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，且R^G和R^H各自为C1-C6烷基(而非如丙烯酰胺的情况中的H)。在该实施例中，q可以是1至100,000范围内的整数。在另一实施例中，除丙烯酰胺单元外。可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该实施例中，除重复出现的“n”和“m”个特征外，结构(I)可包括其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，且R^G和R^H各自为C1-C6烷基。在该实施例中，q可以是1至100,000范围内的整数。

应当理解，可以使用其他聚合物或分子来形成层26，只要它们被功能化以与表面S”₁₂和随后施加的引物20相互作用。适用于层26的聚合物的其他实例包括具有胶体结构的那些聚合物，如琼脂糖；或聚合物网状结构，如明胶；或交联的聚合物结构，如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、无硅烷丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化形式。合适的聚丙烯酰胺聚合物的实例可以从丙烯酰胺和丙烯酸或含乙烯基的丙烯酸，或从形成[2+2]光环加成反应的单体合成。适用于层26的聚合物的再其他实例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。

用于用形成层26的聚合物使凹陷16功能化的方法可取决于室14是被限定在基底12上还是基底12中。

例如，当室14通过隔离材料18限定在基底12上时，应当理解，基底表面S₁₂和S”₁₂可进行处理以使凹陷16功能化，和然后隔离材料18可被附接于表面S₁₂以限定室14。在一个实施例中，可以使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物沉积在基底表面S₁₂和S”₁₂上。在另一实施例中，基底表面S₁₂和S”₁₂可暴露于等离子体灰化。聚合物(其将形成层26)然后可以使用旋涂，或者浸渍或浸涂，或者材料在正压力或负压力下的流动，或者另一合适的技术施加到活化的基底表面S₁₂和S”₁₂。在一个实施例中，聚合物可以存在于混合物(例如，与水或与乙醇和水)中。取决于聚合物，施加的混合物可暴露于固化过程以在表面S₁₂和S”₁₂上形成(共价键合的)层26。在一个实施例中，固化可以在从室温(例如，约25℃)至约95℃范围的温度下进行约1毫秒至约几天的时间。然后可以进行抛光以便从表面S₁₂除去层26，同时使表面S”₁₂上的层26保持至少基本上完整。在这些实施例中，隔离材料18然后可如本文所述形成在表面S₁₂上(例如，光刻法、印刷、膜转移或层压等)。

对于另一实施例，当室14限定在基底12中时，应当理解，选择性沉积技术可用于使凹陷16功能化。在该实施例中，可以通过微接触印刷、气溶胶印刷或喷墨印刷来沉积硅烷或硅烷衍生物和然后聚合物混合物。

可进行接枝处理以将引物20接枝到凹陷16中的层26上。在一个实施例中，接枝可包括流过沉积(flow through deposition)(例如，使用临时结合的盖)、浸涂(dunkcoating)、喷涂、水洼分配(puddle dispensing)，或通过将引物20附接到凹陷16中的层26上的另一合适方法。这些示例技术中的每一种可利用引物溶液或混合物，其可包括引物、水、缓冲剂和催化剂。采用任何一种接枝方法，引物20与凹陷16中的聚合物层26的反应性基团反应，并且对间隙区域24、其他基底表面S₁₂或S’₁₂或隔离材料18没有亲和力。因此，引物20选择性地接枝到凹陷16中的聚合物层26。

本文公开的流动池10的实例包括位于多个室14的每一个内的捕获位点22。图1、图2A和图2B示出了捕获位点22的一个实施例，且图3A至图3C示出了捕获位点22的其他实施例。

捕获位点22能够物理和/或化学地将复合物或样品固定在特定室16内。物理固定利用图3A所示的实施例是可能的。化学固定涉及本文定义的化学捕获剂28。当捕获位点22能够化学固定时，所使用的化学捕获剂28可部分地取决于待引入流动池10中的复合物或样品。

在本文公开的一些实施例中，捕获位点22能够捕获引入流动池10中的复合物。在本文公开的其他实施例中，捕获位点22能够捕获样品，其然后在流动池表面上进行进一步处理以生成文库。

在图1、图2A和图2B中，捕获位点22形成在室14的中心处。应当理解，捕获位点22可以位于室14内的任何期望的位置，这可取决于凹陷16的布置。捕获位点22在整个基底12上的位置可以是均一的(例如，每个捕获位点22基本上处于每个室14内的相同位置(例如，中心、最左侧等))或可以是非均一的(例如，捕获位点22在不同室24内位于不同位置)。

捕获位点22可具有任何合适的形状、几何结构和尺寸，其可能至少部分地取决于捕获位点22的构型(例如贴片、孔、突出物等)、其中形成捕获位点22的室14的维度以及将由捕获位点22捕获的复合物或样品的类型。

在图1、图2A和图2B所示的实施例中，捕获位点22是施加在间隙区域24一部分上的化学捕获剂28。可以使用本文公开的化学捕获剂28的任何实例。在一个实施例中，化学捕获剂28可以使用微接触印刷、气溶胶印刷等沉积在期望的位置。在另一实施例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可用于限定化学捕获剂28将被沉积的空间/位置。然后可以沉积化学捕获剂28，并移除掩膜(例如，通过剥离、溶解或另一合适的技术)。在该实施例中，化学捕获剂28可形成化学捕获剂28的单层或薄层，其可被称为贴片。

图3A、图3B和图3C示出了捕获位点22的其他实施例。应当理解，任何捕获位点22可用于流动池10的任何实施例中，包括具有限定在基底12上的室14(并且包括额外材料18)的那些或具有限定在基底12中的室14的那些。

在图3A和图3B中，捕获位点22包括限定在基底12中的孔30。孔可以以与凹陷16相同的方式“限定”在基底12中。根据所使用的基底12，可以使用蚀刻、光刻法和/或压印形成孔30。在一个实施例中，孔30可以与凹陷16同时形成。

孔30可以具有任何合适的形状和几何结构，包括本文对于凹陷16所描述的那些的任何一种。

在图3A所示的实施例中，孔30的开口维度大于多个凹陷16中每一个的开口维度。在这一实施例中，“开口维度”指每个孔开口和每个凹陷开口所占据的面积，和/或每个孔开口和每个凹陷开口的直径和/或每个孔开口和每个凹陷开口的长度和宽度。孔30的开口维度可取决于待引入其中的复合物或样品的尺寸。在图3A所示的实施例中，凹陷16小于孔30，部分地使得凹陷16不能物理地容纳复合物或样品。在图3A中，凹陷16的深度小于孔30的深度，尽管应当理解，直径或长度和宽度也可以较小。在其他实施例中，孔30的尺寸可以与凹陷16的尺寸相似或相同。在一个实施例中，化学捕获剂28包括引物20，且因此任何凹陷16可用作孔30以捕获复合物或样品。

在一些实施例中，孔30不向其添加额外的化学捕获剂28。在这些实施例中，开口维度使得复合物或样品能够通过尺寸排除自组装到孔30中，而不是凹陷16中。

在其他实施例中，孔30向其添加了额外的化学捕获剂28(如图3A中的虚影所示)。可以使用本文公开的化学捕获剂28的任何实例。在一个实施例中，化学捕获剂28可以使用微接触印刷沉积在孔30中。在另一实施例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可用于在孔30中沉积化学捕获剂28。在这些实施例中，通过尺寸排除和通过化学捕获剂28与引入流动池10中的复合物或样品之间的结合亲和力，开口维度使得复合物或样品能够自组装到孔30中，而不是凹陷16中。

图3B中的捕获位点22包括孔30和在其表面上具有化学捕获剂28的捕获珠32。捕获珠32尺寸可设计为适配到孔30而非凹陷16中。在一些实施例中，捕获珠32可与相邻的间隙区域24共面或延伸略高于相邻的间隙区域24，从而最终附接于其上的复合物或样品不被限制在孔30内。在一个实施例中，捕获珠32选自二氧化硅、超顺磁材料、聚苯乙烯和丙烯酸酯。本文公开的化学捕获剂28的任何实例可用于捕获珠32的表面上，并且可在捕获珠32被引入孔30之前被涂布在捕获珠32上。

孔30的深度(在图3A或3B中)可以根据化学捕获剂28是否被引入其中以及捕获珠32是否被引入其中而变化。深度可以选择为至少容纳这些材料(即，材料包含在孔30内)。在一个实施例中，孔30的深度范围为约1纳米至约5微米。在其他实施例中，孔30的深度范围为约1纳米至约100纳米，或约1微米至约5微米。其他深度也是可能的。

在图3C中，捕获位点22包括限定在基底12中或基底12的表面S₁₂上的突出部34。突出部34是从相邻表面向外(向上)延伸的三维结构。当在基底12中形成突出部34时，基底12被图案化(例如，通过蚀刻、光刻法、压印等)使得其延伸到相邻的周围间隙区域24之上。当在基底12上形成突出部34时，附加材料18被图案化(例如，通过蚀刻、光刻法、压印等)使得其延伸到相邻的周围基底表面S¹²之上。

尽管任何合适的三维几何结构可用于突出部34，但具有至少基本平坦的顶面的几何结构可能是希望的。示例性的突出部几何结构包括球体、圆柱体、立方体、多角形棱柱(例如，矩形棱柱、六角棱柱等)等等。

如图3C所示，化学捕获剂28被施加在突出部34的顶表面上。可以使用本文公开的化学捕获剂28的任何实例，并且可以使用任何沉积技术将化学捕获剂28施加到突出部34的顶表面。

在某些情况下，可能希望每个室14具有一个捕获位点22。在其他情况下，可能希望每个室14具有多个隔离的捕获位点22。单个室14中的捕获位点22的数量可有助于控制给定室14内被捕获的复合物的数量。

再次参见图2A和图2B，流动池10还可包括粘结至隔离材料18或基底12的盖36。盖36可被定位以使得其限定单个流动通道(与多个室14流体连通)或多个流体隔离的流动通道(其每个与多个室14的子集流体连通)。

盖36可以是对指向凹陷16的激发光透明的任何材料。例如，盖可以是玻璃(例如，硼硅酸盐、熔融二氧化硅等)、塑料等。合适的硼硅酸盐玻璃的商业可得实例为D可从Schott North America，Inc.获得。合适的塑料材料(即环烯烃聚合物)的商业可得实例为从Zeon Chemicals L.P.可得的产品。

盖36可使用任何合适的技术进行粘结，例如激光焊接、扩散粘结、阳极粘结、共晶接合、等离子体激活粘结、玻璃浆料键合或本领域已知的其他方法。在一个实施例中，间隔层可用于将盖36粘结到隔离材料18或基底12的部分。间隔层可以是将至少一些隔离材料18或基底12与盖36一起密封的任何材料。

尽管未示出，但是应当理解，可以在基底12和盖36之间或基底12和凹陷16之间加入一个或多个附加层。这些附加的层可被选择以用作用于用渐逝场激励凹陷16的平面波导。

应当理解，本文也考虑了其他流动池架构。作为一个实例，流动池10可包括室14和捕获位点22，但不包括凹陷16。在这些实施例中，引物20可以附接于室14的底表面上，而不是在离散的凹陷16中。室14的底表面可以用层26和引物20功能化。在一些实施例中，层26可被施加到整个底表面(除了其中形成捕获位点22的地方)。在这些实施例中，可以在室14的整个底表面上形成至少基本上均匀的引物20草坪。在其他实施例中，层26可作为在室14内彼此空间隔离的岛(例如，圆形、三角形、矩形等形状)施加。从流动池10上捕获的特定复合物释放的文库片段或在流动池10上原位形成的文库片段可以在室14内随机分布(与限制在室14的凹陷16内相反)。图5(i)至图5(iii)示出了这种流动池架构的实施例。

作为另一实施例，流动池10可包括捕获位点22而没有室14或凹陷16。在这些实施例中，捕获位点22可以在整个基底上以所需的几何结构定位，并且引物20可以附接于捕获位点22周围的基底12的表面上。从流动池10上捕获的特定复合物释放的文库片段或在流动池10上原位形成的文库片段可以随机分布在基底12上，并且释放的文库片段的限制可以通过控制反应-扩散来实现。

作为又一实施例，流动池10可包括凹陷16和捕获位点22，但不包括室14。在这些实施例中，捕获位点22可以在整个基底12上以期望的几何结构定位，并且引物20可以如本文所述附接在每个凹陷16内。从流动池10上捕获的特定复合物释放的文库片段或在流动池10上原位形成的文库片段可以随机分布在复合物附近的凹陷16中，并且释放的文库片段的限制可以通过控制反应-扩散来实现。

在再其他的实施例中，不包括捕获位点22，因为室14的壁具有足以捕捉引入到流动池10的复合物或样品中的一个或多个的高度。足以捕捉一个或多个复合物或样品的高度对应于引入到流动池10的复合物或样品的平均直径的至少约50％的室深度。在一个实施例中，壁的高度或室14的深度为10微米或更高。在该实施例中，给定室14中的复合物或样品的数量/量是随机的，并且将由泊松分布确定。

在本文公开的任何实施例中，应当理解，引物20可不位于凹陷16和/或室14侧壁上，部分原因是层26可能不位于侧壁上。这有助于防止文库片段在侧壁上接种。

本文公开的流动池架构可用于多种应用，包括测序技术，例如链接长阅读(linkedlong read)测序应用、高通量蛋白质生物标志物研究、微生物组研究或单细胞组学。例如，本文公开的流动池架构和方法可用于分析用DNA标记的抗体的结合。在这一实施例中，抗体标记附接于具有P5/P7衔接子的独特的DNA序列，该序列被引入流动池架构中。抗体可被切割，且释放的P5/P7引物被接种到流动池上。接种的引物使得能够识别哪个抗体被附接。

用于流动池架构的复合物

流动池架构可能特别适合与本文公开的复合物实施例一起使用。如本文所述，复合物包括载体(例如，水凝胶支持物或固体支持物)和附接于载体或包含于载体内的测序准备核酸片段。合适的复合物的实施例示于图4A至图4C中。尽管描述了用于制备复合物的一些示例性方法，但应当理解，也可以使用其他方法，只要测序准备核酸片段附接于载体上或包含在载体内。

图4A示出了包括固体支持物42和附接于固体支持物42的测序准备核酸片段44的复合物40A。

在一个实施例中，为形成该复合物40A，衔接子序列(52，52’)通过结合对的一个成员46与固体支持物42结合。在一个实施例中，该衔接子序列包括第一测序引物序列(例如，阅读片段1测序引物序列)、与流动池10A-10I上的引物20之一的至少一部分互补的第一序列(例如，P5’序列)。如所述的，该衔接子序列与结合对的一个成员46(例如，生物素)结合，使得其可以与固体支持物42(其包括结合对的另一个成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等))的表面结合。该衔接子序列也可以包括索引序列。

Y-衔接子可与转座酶(例如，两个Tn5分子)混合以形成转座体。Y-衔接子可包括两个相互杂交的拼接末端序列。拼接末端序列之一可附接至第二测序引物序列(例如，阅读片段2测序引物序列)、与流动池10A-10I上的引物36之一的至少一部分互补的第二序列(例如，P5’序列)以及任选的索引/条码序列。第二测序引物序列和第二序列共同构成衔接子序列48、48’。

然后可以执行标签化过程。包括样品(例如，DNA)的流体(例如，标签化缓冲液)可添加到转座体和具有与其结合的衔接子序列的固体支持物42。当样品接触转座体时，DNA被标签化(片段化并用固体支持物42上的衔接子序列52、52’标记)且与Y-衔接子结合(例如，通过游离拼接末端序列的连接)。样品的顺序标签化导致转座体之间的多个桥连分子。为完成测序准备片段，进行进一步延伸和连接以确保片段50、50’附接到序列48和48’。然后可以通过十二烷基硫酸钠(SDS)处理或者加热或蛋白酶K消化去除转座酶。

所得的复合物40A显示于图4A中。桥连分子是测序准备核酸片段44，其各自包括片段50、50’和附接在任一端的衔接子序列48和52或48’和50’。衔接子序列52、52’是最初与固体支持物42结合的那些序列，且包括第一测序引物序列、与流动池引物互补的第一序列和结合复合物的一个成员46。衔接子序列48、48’来自Y-衔接子，且包括与另一流动池引物互补的第二序列和第二测序引物序列。因为每个测序准备核酸片段44包括用于扩增(例如桥扩增(bridge amplification))和测序的合适衔接子，所以不进行PCR扩增。因此，这些片段44是准备好测序的。此外，因为文库片段44来自同一样品，片段44可能适合于链接的长阅读应用。

图4B显示了另一复合物40B，其包括固体支持物42和附接于固体支持物42的测序准备核酸片段44’。在一个实施例中，在管中建立无PCR核苷酸文库，然后将该文库在管中与固体支持物42杂交。在图4B所示的实施例中，具有结合对的一个成员的引物添加到管中的文库片段中，然后将测序准备核酸片段44’结合到固体支持物42上。在另一个实施例中，固体支持物42可具有通过结合对(例如，支持物42上的抗生物素蛋白和附接于该引物的生物素)附接于其上的引物。这些引物与文库片段杂交(且因此引物和结合对成员位于片段的一端而非另一端)。在另一个实施例中，延伸可以使用链置换酶进行。这将产生完全双链的文库(例如，无叉或Y形衔接子，如图4B所示)。测序准备核酸片段44’可通过变性在流动池上释放。因为文库片段44’在附接到固体支持物42之前产生，片段44’可能不是来自同一样品，且因此可能不适合链接的长阅读应用。

图4C示出了复合物40C的实施例，其包括水凝胶支持物70和包含在水凝胶支持物70内的测序准备核酸片段44”。

为形成该复合物40，在样品(例如遗传物质)存在的情况下，混合含有水凝胶单体和/或聚合物和交联剂的流体。该流体可被加载到矿物油或另一合适的疏水性流体中，并乳化以产生液滴。可加入自由基引发剂以聚合和/或交联水凝胶单体和/或聚合物并形成水凝胶支持物70。合适的单体、聚合物、交联剂和引发剂的实例参考图5(i)至图5(iii)进行描述。

样品变为包封在水凝胶支持物内，因为其尺寸足以使其不能通过水凝胶珠的孔隙。在一些实施例中，样品为DNA或RNA，且长度为至少约100个核苷酸(例如，1,000个或更多、10,000个或更多、500,000个或更多等)。在一些实施例中，基于对多个孔隙的测量，水凝胶支持物70的孔隙尺寸指孔隙截面的平均直径或平均有效直径。非圆形的截面的有效直径等于与该非圆形截面具有相同截面积的圆形截面的直径。在一个实施例中，孔隙尺寸范围为约10纳米至约100纳米。

然后可以在水凝胶支持物70内进行文库制备。可以通过水凝胶支持物70的孔隙进行多重试剂交换。样品和由此产生的任何文库片段被保持在水凝胶基质内。文库制备可涉及将样品片段化并添加衔接子，这将产生测序准备片段44”。

在一个实施例中，文库制备可以通过在水凝胶支持物70内进行的标签化来进行。所得的复合物40C示于图4C中。衔接子序列包括用于桥扩增和测序的合适衔接子，且因此产生的片段44”是准备好测序的。在另一个实施例中，可以使用聚合酶延伸进行文库制备，这导致双链文库。该示例文库需要在从水凝胶支持物70释放和接种前变性。

涉及复合物的方法

本文公开的方法的一些实施例利用了本文公开的流动池10的实施例和复合物40A、40B或40C中的任何一个。如上所述，复合物40A、40B或40C中的每一个包括从相同遗传物质样品获得的测序准备片段。当一个或几个复合物在相应的室内被隔离时，实现了来自相同样品的文库的空间共定位。

在第一示例性方法中，流动池10包括多个室14，但不包括捕获位点22。相反，室14本身用作引入到流动池的复合物40A、40B或40C的捕获位点。每个室14可用作捕获位点，例如，当深度为将引入其中的复合物40A、40B或40C的平均直径的至少约50％时。在一个实施例中，深度为至少约10微米(约10微米或更大)。在该实施例中，流动池10可具有附接于室14底表面的引物20，或可包括引物20包含在其中的凹陷16。在这些实施例中，变成为捕捉在任何给定室14中的复合物40A、40B或40C的数量可以是随机的，并且通过泊松分布确定。

在该第一示例性方法中，例如通过一个或多个输入端口，复合物40A、40B或40C引入流动池10中。可以将复合物40A、40B或40C引入流体中，例如Tris-HCl缓冲液或0.5x柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液。来自流体的至少一些复合物40A、40B或40C将沉降到至少一些室14中。应当理解，一些复合物40A、40B或40C可能不沉淀，并且在进行进一步处理之前，这些复合物40A、40B或40C从流动池中移除。还应理解，一些室14可接收一个或多个复合物40A、40B或40C，而其他室14可不接收复合物40A、40B或40C。在本实施例中，复合物40A、40B或40C分布是随机的，部分地因为缺少捕获位点22。

该第一示例方法然后包括从流动池洗掉非捕捉的复合物40A、40B或40C。洗涤可包括将流体引入流动池10中。该流可通过流动池的出口端口将任何未沉降的复合物40A、40B或40C推出。深的室14可防止任何沉降的复合物40A、40B或40C成为出口流的部分。

该方法实施例随后包括导致捕捉的复合物40A、40B或40C的载体(例如，固体支持物42或水凝胶支持物70)释放测序准备核酸片段44、44’或44”到每个复合物40A、40B或40C被捕捉的相应室14中。在本实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”的转运和接种受到相应室14的深度的限制，且因此外部固定剂不引入到流动池。

导致载体(即，支持物42或70)释放测序准备核酸片段44、44’或44”可根据所使用的复合物40A、40B或40C变化。在一个实施例中，载体是固体支持物42，并且所述导致包括将切割剂引入到流动池。切割剂可启动测序准备核酸片段44、44’从固体支持物42的化学、酶促或光化学释放。在这些实施例中，另一刺激，例如热或光，可以触发切割剂从固体支持物42释放文库片段44或44’。作为一个实施例，可以引入游离生物素作为切割剂，并且可以使用加热至约92℃来诱导从固体支持物42的生物素-寡聚体释放。

在其他实施例中，使用复合物40C，且因此载体是水凝胶支持物70。在这些其他实施例中，导致文库释放可涉及加热流动池10、向流动池10引入切割剂或其组合。加热以从水凝胶支持物70释放文库片段44”可包括加热至约90℃的温度。整个流动池10可被加热，并且当复合物40C加热时，水凝胶支持物70可降解以释放片段44”。在一些实施例中，切割剂可包括一种或多种可使水凝胶支持物70解聚并从其释放测序准备片段44”的成分。例如，切割剂包括二硫苏糖醇(DTT)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三-(3-羟丙基)膦(THP)。在其他实施例中，切割剂是光。在这些实施例中，用于形成水凝胶支持物70的交联剂可包括光可切割的部分，并且室14中的复合物40C暴露于适当波长的光可切割该部分并降解水凝胶支持物70。

如所述的，测序准备核酸片段44、44’或44”的转运和接种受到相应室14的深度的限制。因此，任何特定复合物40A、40B或40C的片段44、44’或44”限制于该特定复合物40A、40B或40C被限制的室14。

利用本文公开的流动池架构，流动池10表面上的引物20可以接种释放的测序准备核酸片段44、44’或44”。在一个实施例中，通过片段44、44’或44”的第一或第二序列与室14的引物20中的互补序列之间的杂交来完成接种。接种可在对于片段44、44’或44”和引物20的合适杂交温度下进行。

测序准备核酸片段44、44’或44”在相应室14中接种的位置部分地取决于引物20如何附接在室14内。在流动池10的一些实施例中，每个室14具有底表面，并且引物20附接于整个底表面上的聚合物层26，或者引物20分别附接到位于底表面上的多个空间隔离的聚合物岛。在这些实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”分别接种在室14的整个底表面上或每个岛上。在其他实施例中，每个室14具有底表面和在其中限定的多个凹陷16，并且引物20分别附接到每个凹陷16内的聚合物层26。在这些实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”接种在每个凹陷16内的聚合物层26上。

在另一示例性方法(称为第二示例性方法)中，流动池10包括多个室14、多个室14的每一个内的捕获位点22；以及附接在多个室14的每一个内的引物20。在该实施例中，流动池10可以包括或不包括凹陷16。

在该第二示例性方法中，每个室14的深度为5微米或更小。具有如此浅的深度，捕获位点22可被包括以将单复合物40A、40B或40C固定在单一室14中。虽然每个室14具有捕获位点22，但是应当理解，在该方法的任何给定运行期间，一些室14可能不接收复合物40A、40B或40C。

在该第二示例性方法中，例如通过一个或多个输入端口将复合物40A、40B或40C引入流动池10中。复合物40A、40B或40C可引入流体中，如本文公开的缓冲液。在该实施例中，相应捕获位点22和复合物40A、40B或40C是结合对的成员，使得一个复合物40A、40B或40C结合各室14内的一个捕获位点22。更具体地，捕获位点22可包括结合对的第一成员，并且每个复合物40A、40B或40C可包括结合对的第二成员。作为一个具体实施例，捕获位点22是捕获位点引物(例如，捕获寡核苷酸)，并且每个复合物40A、40B或40C包括可与捕获位点引物杂交的互补引物。作为另一具体实施例，捕获位点22可包括抗生物素蛋白，并且生物素可附接于复合物40A、40B或40C的表面。

该第二示例性方法然后包括从流动池10洗掉非固定的复合物40A、40B或40C。洗涤可包括将任何合适的缓冲液引入流动池10中。该流可通过流动池10的出口端口将任何未附接于捕获位点22的复合物40A、40B或40C推出。

该第二示例性方法然后包括将外部固定剂引入到流动池10，且具体地，引入到多个室14。在一个实施例中，外部固定剂是空气或者不与已经引入到流动池室14的流体的复合物40A、40B或40C混溶的液体介质或粘性介质。

使用空气将洗涤流体从流动池10吸出可产生围绕复合物40A、40B或40C的液滴并形成扩散屏障。液体或粘性外部固定剂至少部分地围绕附接在室14内的复合物40A、40B或40C。通过至少部分地围绕复合物40A、40B或40C，当片段44、44’或44”被释放时，外部固定剂抑制室14之外测序准备核酸片段44、44’或44”的扩散。当外部固定试剂是温度响应材料时，将温度升高至接种温度可使试剂更粘性且为可防止文库扩散的形式。

应当理解，可以使用本文公开的任何外部固定剂，但是在一个实施例中，外部固定剂是选自矿物油和硅油的液体扩散屏障、选自甘油和蔗糖的粘性介质扩散屏障及其组合。

该方法的这一实施例随后包括导致捕捉的复合物40A、40B或40C的载体(例如，固体支持物42或水凝胶支持物70)释放测序准备核酸片段44、44’或44”到相应的室14中，在其中每个固定的40A、40B或40C被捕捉。在本实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”的转运和接种受到外部固定剂的限制。

根据所使用的复合物40A、40B或40C，导致载体(即，支持物42或70)释放测序准备核酸片段44、44’或44”可发生变化。在一个实施例中，载体是固体支持物42，且所述导致包括向流动池10引入切割剂(如第一示例性方法中所述)，并使用另一刺激触发切割剂从固体支持物42释放文库片段44或44’。在其他实施例中，使用复合物40C，且因此载体是水凝胶支持物70。在这些其他实施例中，导致文库释放可包括加热流动池，向流动池引入切割剂或其组合(如第一示例性方法中所述)。

如上所述，在该第二示例性方法中，测序准备核酸片段44、44’或44”的转运和接种受到外部固定剂的限制。因此，任何特定复合物40A、40B或40C的片段44、44’或44”限制于特定复合物40A、40B或40C被限制于其中的室14，因为外部固定剂至少部分地围绕复合物40A、40B或40C。

利用本文公开的流动池架构，流动池10表面上的引物20可以接种释放的测序准备核酸片段44、44’或44”。接种通过片段44、44’或44”的第一或第二序列与室14的引物20的互补序列之间的杂交完成。接种可在对于片段44、44’或44”和引物20的合适杂交温度下进行。

测序准备核酸片段44、44’或44”在相应室14中接种的位置部分地取决于引物20如何附接在室14内。在流动池的一些实施例中，每个室14具有底表面，并且引物20附接到整个底表面的聚合物层26，或者引物20分别附接到位于底表面上的多个空间隔离的聚合物岛。在这些实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”分别接种在室14的底表面或每个岛上。在其他实施例中，每个室14具有底表面和限定在其中的多个凹陷，并且其中引物分别附接于每个凹陷16内的聚合物层26。在这些实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”接种在每个凹陷16内的聚合物层26上。

在该方法的又一实施例(称为第三示例性方法)中，可以使用图1、图2A、图2B和图3A至图3C所示的流动池10的任何实施例。在该第三示例性方法中，可包括捕获位点22以将单复合物40A、40B或40C固定在单一室14中，并且每个室14的深度可足以限制测序准备核酸片段44、44’或44”转运和接种到各个相应室14内的相应凹陷16。

在该第三示例性方法中，复合物40A、40B或40C例如通过一个或多个输入端口引入流动池10中。复合物40A、40B或40C可被引入流体中，例如本文公开的缓冲液。在该实施例中，相应捕获位点22和复合物40A、40B或40C是结合对的成员，使得一个复合物40A、40B或40C结合至少一些室14内的一个捕获位点22。虽然每个室14具有捕获位点22，但是应当理解在该方法的任何给定运行期间一些室14可能不接收复合物40A、40B或40C。

该第三示例性方法然后包括从流动池10洗掉非捕捉的复合物40A、40B或40C。洗涤可包括将缓冲液引入流动池中。该流可通过流动池10的出口端口将未固定在捕获位点22处的任何复合物40A、40B或40C推出。

该方法的这一实施例随后包括导致捕捉的复合物40A、40B或40C的载体(例如，固体支持物42或水凝胶支持物70)将测序准备核酸片段44、44’或44”释放到每个复合物40A、40B或40C被捕捉在其中的相应室14中。在这一实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”的转运和接种受到相应室14的深度的限制，且因此外部固定剂不引入到流动池10。

根据所使用的复合物40A、40B或40C，导致载体(即，支持物42或70)释放测序准备核酸片段44、44’或44”可变化。在一个实施例中，载体是固体支持物42，并且所述导致包括将切割剂引入到流动池10(如第一示例性方法中所述)和将流动池10暴露于外部刺激。在其他实施例中，使用复合物40C，且因此载体是水凝胶支持物70。在这些其他实施例中，导致文库释放可能涉及加热流动池、向流动池引入切割剂或其组合(如第一示施性方法中所述)。

如所述的，测序准备核酸片段44、44’或44”的转运和接种受相应室14的深度的限制。因此，任何特定复合物40A、40B或40C的片段44、44’或44”将限制在特定复合物40A、40B或40C被限制于其中的室14。在该特定实施例中，由于流动池10包括在凹陷16中的引物20，片段44、44’或44”的接种在凹陷16内而不是在间隙区域24上发生。

在另一示例性方法(称为第四示例性方法)中，流动池10可以是本文公开的任何架构，并且包括至少捕获位点22和引物20。

类似于本文公开的其他方法，将复合物40A或40B(包括固体支持物42)引入流动池10中，例如通过一个或多个输入端口。复合物40A或40B可引入流体中，例如本文公开的缓冲液。在该实施例中，相应捕获位点22和复合物40A或40B是结合对的成员，使得一个复合物40A或40B结合一个捕获位点22。更具体地，捕获位点22可包括结合对的第一成员，并且复合物40A或40B的每一个可包括结合对的第二成员。作为一个具体实施例，捕获位点22是捕获位点引物(例如，捕获寡核苷酸)，并且复合物40A或40B的每一个包括可与捕获位点引物杂交的互补引物。作为另一具体实施例，捕获位点22可包括抗生物素蛋白，并且生物素可附接于复合物40A或40B的表面。

该第四示例性方法然后包括将外部固定剂引入流动池10。

在一个实施例中，外部固定剂是空气。空气引入流动池10中吸取大部分流体(其中已经引入复合物40A或40B)，并且还将任何非固定的复合物40A或40B推出流动池10。固定的复合物40A或40B用作液体钉扎(pinning)中心，且因此在它们各自的表面处保留来自流体的一些液体。保留的液体形成围绕各复合物40A或40B的液滴。在一些实施例中，液滴是具有类似帐篷形状的液膜(例如，其中心处的高度由接种颗粒设定，且弯液面轮廓由液体的强表面张力设定)。该液滴形成从复合物40A或40B释放的文库片段44、44’的扩散屏障。

在一些实施例中，在复合物40A或40B周围形成的液滴可以是连续的，且因此可以在整个流动池表面上形成浅液层。在其他实施例中，在复合物40A或40B周围形成的液滴可以在空间上相互隔离。在再其他实施例中，一些液滴是连续的并形成与其他连续液滴的岛空间隔离的液体岛。当流动池表面上的复合物40A或40B的密度增加时，更可能形成浅液体层。

液滴的构型可通过选择具有所需直径的固体支持物42、以特定表面密度施加复合物40A或40B、调节空气的流速和/或通过流动池10的速度和选择流体以使其具有所需物理性质(例如，粘度、表面张力等)来控制。例如，固定在流动池10内的更多复合物40A或40B(例如，更高的表面密度)导致具有更均匀厚度的浅液层。相反，当较少复合物40A或40B固定在流动池10内时，液滴倾向于彼此隔离或形成液体岛(例如，围绕相应复合物10A或10B的组的小的、分离的水洼)。

空气可以以预定的流速引入流动池10中。在一个实施例中，流速范围为约100微升/分钟至约2000微升/分钟。如所述的，可以调节气流以改变液滴的构型。例如，空气流速可影响复合物40A或40B周围液体的尺寸和/或直径。例如，较高的空气流速可导致连续的浅液层，而较低的空气流速可导致相互隔离或形成若干液体岛的液滴。

流体的物理性质也可改变液滴的构型。例如，较高表面张力的流体具有更大的亲和力以粘附到复合物40A或40B的表面，这导致更大的润湿和更大的弯液面。在某些情况下，用于引入复合物40A或40B的流体可选择为具有约20mN·m^-1至约90mN·m^-1范围的表面张力。例如，6M氯化钠溶液的表面张力为约83mN·m-1；55％蔗糖水溶液的表面张力为约76mN·m^-1；水的表面张力为72.86mN·m^-1；添加表面活性剂的水的表面张力范围可以为20mN·m^-1至约72mN·m^-1；且乙醇的表面张力为22.39mN m^-1。然而，表面张力可以根据用于引入复合物40A或40B的流体而变化。

任何液滴(以隔离液滴、水洼岛或液体层的形式)的峰值高度小于复合物40A或40B的高度。在一个实施例中，任何液滴(以隔离液滴、水洼岛或液体层的形式)的峰值高度为约3微米或更小。液滴的浅高度迫使释放的文库片段沿流动池10的X-Y平面扩散，而不是在整个流动通道中扩散，在此处它们变成被表面引物20捕获。这可导致改善的文库片段靠近释放它们的复合物40A、40B的定位。

在另一个实施例中，外部固定剂是不与已经引入流动池10的复合物40A或40B混溶的液体介质或粘性介质。在该实施例中，在引入液体或粘性介质之前，可以将非固定的复合物10A或10B从流动池10洗掉。洗涤可包括将任何合适的缓冲液引入流动池10中。该流动可通过流动池10的出口端口将任何未附接于捕获位点22的复合物40A或40B推出。

液体或粘性外部固定剂可以形成至少部分地围绕附接于流动池10内的复合物40A或40B的浅层(例如，约3微米或更少)的量引入。通过至少部分地围绕复合物40A或40B，外部固定剂抑制测序准备核酸片段44、44’或44”向浅层之外扩散。当外部固定剂是温度响应材料时，将温度升高至接种温度可能使试剂更粘性，并且为可防止文库扩散的形式。

该方法的这一实施例然后包括使固定的复合物40A或40B的载体(例如，固体支持物42)释放测序准备核酸片段44、44’或44”。作为一个实施例，可将切割剂引入流动池10(如第一示例性方法中所述)，并且可施加另一刺激以触发切割剂从固体支持物42释放文库片段44或44’。在该实施例中，测序准备核酸片段44、44’或44”的转运和接种受到复合物40A或40B周围形成的液滴的限制。

利用本文公开的流动池架构，流动池10表面上的引物20可以接种本文所述的释放的测序准备核酸片段44、44’或44”。

在涉及复合物40A、40B或40C的方法的任何实施例中(例如，本文所述的第一、第二、第三或第四方法)，接种的测序文库可使用簇生成(cluster generation)进行扩增。

在簇生成的一个实施例中，使用高保真DNA聚合酶从杂交的引物20通过3’延伸拷贝测序准备核酸片段44、44’或44”。原始的测序准备核酸片段44、44’或44”变性，从而使拷贝固定在室14内。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，拷贝的模板成环以与邻近的互补引物20杂交，且聚合酶复制拷贝的模板以形成双链桥，其变性以形成两个单链的链。这两条链形成环并与邻近互补引物20杂交，且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增的循环在每个模板拷贝上重复该过程以产生密集的克隆簇。每个双链桥的簇变性。在一个实施例中，反向链通过特定的碱基切割移除，从而留下正向模板多核苷酸链。应当理解，簇集导致形成几个模板测序准备核酸片段，例如在每个室14中，并且在某些情况下，在每个室14中的每个凹陷16内。该簇集实施例是桥扩增，并且是可以进行的扩增的一个实例。应当理解，可以使用其他扩增技术，例如排阻扩增(ExAmp)流程(Illumina Inc.)。

在簇生成后，可以进行测序。本文公开的流动池10的任何实施例可用于多种测序方法或技术，包括通常称为合成测序(SBS)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等的技术。

例如，合成测序(SBS)反应可在如HISEQ^TM、HISEQX^TM、MISEQ^TM、MISEQDX^TM、MINISEQ^TM、NOVASEQ^TM、NEXTSEQDX^TM、ISEQ^TM、NEXTSEQ^TM或llumina(San Diego,CA)的其他测序仪系统的系统上运行。

可以引入与模板多核苷酸链上的互补序列杂交的测序引物。该测序引物使模板多核苷酸链准备好测序。在SBS中，监测测序引物沿模板测序准备核酸片段(模板多核苷酸链)的延伸以确定模板中核苷酸的序列。模板的3’端和任何流动池结合的引物20(未附接于拷贝的)可被封闭以防止干扰测序反应，且特别是防止不希望的引发。基础化学过程可以是聚合(例如，聚合酶催化的)或连接(例如，连接酶催化的)。

在特定的基于聚合酶的SBS过程中，荧光标记的核苷酸以模板依赖性的方式被添加到测序引物(从而延伸测序引物)，使得添加到测序引物的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板的序列。更具体地，一个核苷酸通过相应的聚合酶并入延伸测序引物并与模板多核苷酸链互补的新生链中。例如，为启动第一SBS循环，一种或多种标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以被输送到流动池10中/通过流动池10等，其中测序引物延伸导致标记的核苷酸被掺入。这种掺入可以通过成像事件检测。在成像事件期间，照明系统(未示出)可以向流动池10提供激发光。

在一些实施例中，荧光标记的核苷酸可进一步包括可逆终止性质，其在核苷酸被添加到模板时终止了进一步的引物延伸。例如，可将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到模板，使得后续延伸不可能发生直到去封闭剂被递送以去除该部分。因此，对于使用可逆终止的实施例，去封闭试剂可递送至流动池等(在检测发生后)。

清洗可在各个流体输送步骤之间进行。然后，可以将SBS循环重复n次以使模板延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。

虽然已详细描述了SBS，但应理解本文所述的流动池10可用于其他测序方案，用于基因分型或其他化学和/或生物学应用。

涉及流动池架构上复合物形成的方法

本文公开的方法的其他实施例不使用图4A至图4C中所示的复合物40A、40B或40C。相反，水凝胶基质在流动池的室14内原位形成。参照图5(i)至图5(iii)描述一个实施例。

在该实施例中，流动池10’可以是包括流动池10’和用于在流动池10’的室14内形成水凝胶基质74的各种试剂的测序试剂盒的部分。测序试剂盒的实施例包括流动池10’，其包括多个室14(例如，如参考图1、图2A和图2B所述形成在基底12中或基底12上的)，以及附接在多个室14的每一个内的引物20。在图5(i)至图5(iii)所示的实施例中，每个室具有底表面，并且引物20附接到整个底表面的聚合物层26。虽然未示出，但是聚合物层26(在室底表面上)可以替代地为多个空间隔离的聚合物岛的形式，并且引物20分别附接到每个岛。在流动池10’的又一实施例中，多个凹陷16(如本文中流动池10所定义的)可被限定在室的底表面中，并且引物20被附接到每个凹陷16中的聚合物层26。

如图5(i)所示，流动池10’还包括捕获位点22’的实施例，其中捕获位点22’被配置为捕获样品72。

捕获位点22’可以是本文公开的化学捕获剂的任何实例，其可以附接于引入流动池10’的样品72。对于天然DNA或RNA样品72，捕获位点22’可包括一端具有核酸结合部分的接头，例如通过电荷或疏水相互作用结合的嵌入剂，或结合对的一个成员(其中样品72包括另一个成员)，或可与样品72杂交的寡核苷酸等。对于细胞样品72，接头可包括细胞膜结合部分(例如，针对表面蛋白的抗原)或膜穿透部分(例如，在一端的磷脂)。

尽管未在图5(i)至图5(iii)中示出，流动池10’可在每个室14内包括凹陷16，并且引物20可附接在每个凹陷16内。

测序试剂盒的该实施例还包括由流体、单体或聚合物(包括自由基生成和链延长官能团)、自由基源和交联剂组成的包封(水凝胶)基质前体组合物。包封(水凝胶)基质前体组合物不包括样品72。在一个实施例中，包封(水凝胶)基质前体组合物包含约2％(w/v)至约20％(w/v)的单体或聚合物、约1重量％至约10重量％的交联剂以及约0.1％(w/v)至约10％(w/v)的自由基源。当包含在组合物中时，自由基引发剂可以以约0.1％(w/v)至约10％(w/v)的量存在。

包封(水凝胶)基质前体组合物的流体可以是水(例如，去离子水)。

当单体用于包封(水凝胶)基质前体组合物中时，单体选自丙烯酰胺、N,N’-双(丙烯酰基)胱胺、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙胺、三烯丙胺、二乙烯基砜、乙二醇二烯丙基醚、二丙烯酸乙二醇酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基二丙烯酸酯、乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯、胶原单体及其组合。当聚合物用于包封(水凝胶)基质前体组合物中时，该聚合物选自聚乙二醇-硫醇、聚乙二醇-丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇(例如，重均分子量范围为约100至约200,000)、聚氧化丙烯、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、聚(乙烯磺酸)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、海藻酸硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原聚合物及其组合。任何该单体和聚合物也可在包封(水凝胶)基质前体组合物中组合使用。

自由基来源是在分解时产生自由基的分子。在一个实施例中，自由基源选自过硫酸钾、过硫酸铵、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)、1,1’-偶氮双(环己腈)、偶氮二异丁腈、2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈)、2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈)、过氧化物、核黄素、3-(二甲氨基)丙腈及其组合。

交联剂在水凝胶基质的聚合物中形成键，例如二硫键。交联剂可以是可逆的，因为根据其所暴露的化学物质，其可以是交联的或未交联的。例如，可逆交联剂是含有二硫键的双丙烯酰胺交联剂，二硫键可用还原剂如DTT、TCEP或THP(膦)分解。在一个实施例中，交联剂选自丙烯酰胺、N,N’-双(丙烯酰基)胱胺、双丙烯酰胺、1,4-二酰基哌嗪、N-N’-二烯丙基L-酒石二酰胺和N-N’-(1,2-二羟基亚乙基)-双丙烯酰胺。

测序试剂盒还包括作为包封基质前体组合物的部分或作为单独组分的自由基引发剂。在一个实施例中，自由基引发剂可以是光引发剂。光引发剂的实例包括偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰、曙红-5-异硫氰酸酯。这种类型的自由基引发剂可包含在包封(水凝胶)基质前体组合物中，因为其不会引发交联直到其暴露于适当波长的光。在另一实施例中，当暴露于包封(水凝胶)基质前体组合物中的自由基源时，自由基引发剂可引发交联。在这些实施例中，自由基引发剂与包封(水凝胶)基质前体组合物保持分离，直至希望在流动池10’上形成水凝胶基质。这种类型的自由基引发剂的实例是四甲基乙二胺(TEMED)。

在一个实施例中，测序试剂盒可进一步包括包含水和样品72(例如，遗传物质)的样品流体。

在一个实施例中，测序试剂盒可进一步包括包含衔接子序列和转座体的文库制备溶液。

在使用测序试剂盒的方法的实施例中，样品流体(包括遗传物质的样品72)例如通过输入端口引入到流动池10’(图5(i))。通过相应室14中的捕获位点22’，至少一些遗传物质(样品72)进入多个室14中的至少一些。样品72固定于捕获位点22’。

样品流体的液体，包括任何未结合的样品72，然后可以被去除。去除可包括将洗涤缓冲液(例如，TRIS HCl)引入流动池10’中。该流可将任何未结合的样品72通过流动池10’的出口端口推出。

该方法的这一实施例包括将包封基质前体组合物76引入流动池10’中(图5(ii))。至少一些包封基质前体组合物76进入包含样品72的至少一些室14。

该方法然后包括通过引发在至少一些室14中包含的包封基质前体组合物76的交联或交联和聚合将样品72(即，遗传物质)包封在至少一些室14中的水凝胶基质74中(图5(iii))。

在包封之前，外部固定剂可引入流动池10’中。该试剂可从流动池10’中移除包封基质前体组合物76，除已进入室的组合物76外。这在水凝胶基质形成过程中形成屏障。可以使用本文公开的外部固定剂的任何实例。

当包封基质前体组合物76包含光引发剂(例如，紫外自由基引发剂)时，包封涉及将流动池10’暴露于紫外辐射。该暴露引发自由基生成，其进而引发保留在室14中的包封基质前体组合物76中的组分的交联或交联和聚合。交联或交联和聚合在室14内形成水凝胶基质74。这将样品72包封在室14内的水凝胶基质74内。

当使用在暴露于自由基源时引发交联的自由基引发剂时，自由基引发剂与包封基质前体组合物76分开引入。在这些实施例中，包封包括将流动池10’暴露于自由基引发剂。在该实施例中，自由基引发剂可与外部固定剂一起引入。外部固定剂中的自由基引发剂引发包封基质前体组合物76中的自由基生成，这随之引发保留在室14中的包封基质前体组合物76中的组分的交联或交联和聚合。在室14内交联形成或交联和聚合形成水凝胶基质74。这将样品72包封在室14内的水凝胶基质74内。

文库制备可在流动池10’表面上进行。可以去除外部固定剂，并且可以将缓冲液与文库制备溶液一起引入流动池10’。文库制备可如参照图4C所述进行。

然后，可以根据本文公开的实施例进行接种、簇集和测序。

为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，这些实施例是出于说明的目的而提供的，而不应被解释为限制本公开的范围。

非限制性工作实施例

实施例1

在绝缘体上硅基底的最外硅层上沉积疏水层(S)，并在该疏水层上沉积正型光致抗蚀剂。使用光刻术，直径50微米的微室然后在光致抗蚀剂中图案化。然后，按照光致抗蚀剂图案对疏水层和最外硅层进行蚀刻。然后剥离光致抗蚀剂。

基底中的微室进行硅烷化，并在其上沉积PAZAM。清洗掉未附接的PAZAM，然后在微室中将P5和P7引物接枝到PAZAM上。盖子附接到基底上。

制备了类似于图4A所示的复合物，其平均直径为3微米。特定珠上的片段来自相同的长DNA分子(来自PhiX基因组)。文库片段通过脱硫生物素寡聚体附接到固体支持物上，其对珠表面上的链霉亲和素的亲和力比生物素弱。文库片段包括P5和P7’序列以及索引序列，及阅读片段1和阅读片段2序列。复合物加载到微室中。

图6A是说明其中一个微室内部的复合物之一的显微照片。

通过从复合物释放文库片段启动接种，并使用桥扩增进行簇集。图6B是源自图6A复合物的接种文库的簇的荧光显微照片。

进行第一碱基测序，且图6B的微室的实时分析(RTA)示于图6C中。图6D显示了从图6C的微室内部的阅读片段获得的岛的实施例。图6D中的结果表明，所有阅读片段源自长DNA片段的相同段。

实施例2

使用具有两条道的玻璃基底制备流动池。疏水材料沉积在玻璃基底上。将正型光致抗蚀剂施加到疏水材料上。曝光并显影正型光致抗蚀剂以在两条道的每一条中限定描绘不同微室的轮廓的圆形图案。非显影抗蚀剂下方的任何疏水材料被蚀刻掉。这暴露每个微室的表面。在显影的光致抗蚀剂就位的情况下，对微室进行硅烷化，并在其上沉积PAZAM。使用剥离技术与光致抗蚀剂一起去除非附接的PAZAM。然后，P5和P7引物在微室中接枝到PAZAM。使用UV固化粘合剂将盖子粘结到基底上。

本实施例中的微室具有不同的直径和间距，并沿流动池的长度在两条不同的道中制备。表1显示了每条道的直径和间距。

表1

本实施例中使用的复合物包括固体支持物和通过抗生物素蛋白-生物素接头附接于固体支持物的测序准备核酸片段。复合物的文库片段类似于图4B中所示的那些。根据TruSeqTM平台(Illumina，Inc.)方案在试管中制备无PCR文库。文库通过与P7引物(其通过生物素附接于珠)杂交与珠结合。

通过使含有复合物的杂交缓冲液(在杂交缓冲液中200μL)流过流动池通道将复合物引入流动池。图7A是显示复合物引入后流动池道的各区段的放大部分的显微照片。道和区段标识对应于表1。如所示的，一个或多个复合物隔离在至少一些微孔中。

接种通过从复合物释放文库片段来启动。通过将流动池加热至高于P7引物的熔化温度来启动文库释放。片段杂交并进行第一链延伸。用0.2M氢氧化钠溶液除去固体支持物和非杂交的片段。然后使用桥扩增进行簇集。进行第一碱基测序，且微室的实时分析(RTA)示于图7B中。这些结果表明，接收复合物的微室和未接收复合物的微室之间不存在串扰。

实施例3

以与实施例2中所述类似的方式形成流动池。

用Sytox绿染色并分散在TRIS HCl洗涤缓冲液(pH 8.1)中的大肠杆菌与包封基质前体混合，并引入流动池中。然后洗涤流动池。包封基质前体组合物包括丙烯酰胺单体、过硫酸钾(KPS)和双丙烯酰胺。然后引入含有自由基引发剂(TEMED)的矿物油。油迫使包封基质进入至少一些微室中，并引发交联。图8中的数字1是水凝胶形成后一些微室的显微照片。如所示的，水凝胶在大多数微室中形成。

水凝胶基质允许试剂在基质内和外自由交换，但保留细菌在其中。为了证明这一点，进行洗涤，然后通过向流动池中引入溶菌酶进行细胞裂解。将流动池加热至约37℃约30分钟以激活溶菌酶。图8中的数字2是细胞裂解后(数字1的)微室的显微照片。

在蛋白酶K(ProK)的存在下进行DNA提取，蛋白酶K消化污染的蛋白质。图8中的数字3是DNA提取后(数字2的)微室的显微照片。

使用转座体(来自Illumina，Inc.的NEXTERA^TMDNA文库制备试剂盒)与P7-ME(拼接末端)/ME’和P5-ME/ME’衔接子混合物进行文库制备。标签化后，使用SDS去除蛋白质，并使用PCR酶进行延伸反应以产生双链文库。

图8中的数字4是文库制备后(数字3的)微室的显微照片。这些结果表明，可在流动池表面上进行原位样品包封和水凝胶形成。

实施例4

使用玻璃基底并在其中蚀刻圆形纳米凹陷。使用S作为疏水聚合物(隔离材料18)，其沉积在整个玻璃基底上，包括在纳米凹陷中。将光致抗蚀剂(Shipley S-1805)施加到疏水聚合物上，并进行显影以限定疏水聚合物的圆形图案。疏水聚合物通过等离子体蚀刻从未被光致抗蚀剂覆盖的纳米凹陷去除。然后对暴露的纳米凹陷进行硅烷化，并涂覆凝胶材料。凝胶材料为PAZAM。然后使用剥离处理去除光致抗蚀剂和光致抗蚀剂上的任何凝胶材料。这展现了下层的疏水聚合物。疏水聚合物在间隙区域上沿Z方向延伸约1微米至约2微米。Z方向指三维空间的笛卡尔坐标系的Z轴。在本实施例中，疏水聚合物限定直径50微米的圆形室。进行了引物接枝以将P5和P7引物附接至纳米凹陷中的PAZAM。

制备了类似于图4A所示的复合物。特定珠上的片段来自相同的长DNA分子。文库片段通过脱硫生物素寡聚体附接到固体支持物上，其对珠表面上的链霉亲和素的亲和力比生物素弱。复合物加载到微室中。复合物与微室表面的附接是通过锚定(例如，与附接于凝胶材料的P5引物杂交的带有生物素的互补引物，或炔-PEG-生物素接头使用点击化学与凝胶材料上的游离叠氮化物共价连接)完成的。引入含十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中的游离生物素，并将流动池加热至约80℃以从相应复合物释放文库。通过流动池吸取空气以将游离的生物素溶液推出。由于疏水/亲水性表面结构，当液体通过空气推出时，液滴在微室内形成。液滴阻止文库碎片扩散至相邻的微室。

然后将释放的文库片段与微室中的表面引物杂交，并进行延伸步骤以产生互补的拷贝。通过桥扩增进行簇生成。然后在流动池上进行测序。

图9示出了测序运行的数据分析后流动池的一部分。原始颜色代表岛，或根据其在参考基因组上的接近性组合在一起的短阅读片段。由于相应颜色被隔离到特定的微室，因此得出结论，给定微室中的短阅读片段来自基因组DNA的相同段，且因此来自相同的复合物。这些结果表明微室能够将复合物和释放的文库片段限制在相应的室内。

实施例5

本实施例说明了流动池上水凝胶形成。

使用具有两条道的玻璃基底。不同尺寸的微室被蚀刻到玻璃载片中。各道中微室的直径和间距与表1所示相同。疏水材料沉积在玻璃基底上。将正型光致抗蚀剂施加到疏水材料上。曝光并显影正型光致抗蚀剂以限定微室之间间隙上的覆盖疏水材料。非显影抗蚀剂下方(且因此微室中)的任何疏水材料被蚀刻掉。这暴露了每个微室的表面。在显影的光致抗蚀剂就位的情况下，对微室进行硅烷化，并在其上沉积PAZAM。使用剥离技术与光致抗蚀剂一起去除非附接的PAZAM。然后，P5和P7引物在微室中接枝到PAZAM。使用UV固化的粘合剂将盖粘结到基底上。

将包封基质前体引入流动池中。然后洗涤流动池。包封基质前体组合物包括N,N’-双(丙烯酰基)胱胺、丙烯酰胺和2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐。然后将Evagreen油引入流动池。油迫使包封基质进入至少一些微室中。图10A是包封后两个道的不同区段(1-5)中不同尺寸的微室(直径和间距见表1)的显微照片。每个图像10A(i)-10A(x)的较亮区域描绘微室，而较暗区域描绘间隙。图10A(i)至图10A(x)描绘了间隙相对没有包封基质而无论微室的尺寸。然后将流动池暴露于紫外辐射以引发水凝胶形成。然后用TRIS HCl洗涤缓冲液(pH 8.1)洗涤流动池。图10B是水凝胶形成后两条道的不同区段(1-5)中不同尺寸的微室的显微照片。每个图像10B(i)-10B(x)的较亮区域描绘微室，而较暗区域描绘间隙。图10B(i)至图10B(x)显示了在至少一些微室中形成水凝胶，而不论微室的尺寸。

实施例6

本实施例中使用了两个单道玻璃基底流动池。PAZAM及P5和P7引物存在于基底表面上。

制备了类似于图4A所示的复合物。特定珠上的片段来自相同的长DNA分子。文库片段通过脱硫生物素寡聚物附接到固体支持物上。将复合物加载到流动池道中。复合物附接于道表面是通过锚定(例如，与附接于凝胶材料的P5引物杂交的带有生物素的互补引物，或炔-聚乙二醇-生物素接头使用点击化学共价附接于凝胶材料上的游离叠氮化合物)完成。

将具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中的游离生物素引入每个流动池中。在对比流动池中，缓冲液填充流动通道。在示例流动池中，流速为100微升/分钟的空气引入流动通道中以吸取缓冲液并在复合物周围形成浅液层。流动池被加热至约72℃至约77℃范围的温度以从相应的复合物释放文库。

在文库释放和接种后，获取云轮廓的图像。尽管未在此复制，但这些图像表明，当文库释放和接种发生在大体积液体中时(对比实施例)，文库的部分脱离释放它们的固体支持物，并在流动通道中向上移动。这些文库片段或者在大体积中丢失，或者被接种到与释放它们的表面相反的通道表面，且因此减少每个团簇云的文库片段计数以及接种的总体数量(总计数＝1229)。相反，在浅液层中，所有脱离固体表面的文库片段受到浅液层限制，这导致更多的2D定位的接种和更高数量的被接种文库片段(总计数＝2017)。

示例流动池还显示了从流动池的一个表面到流动池的相对表面的文库片段跨表面污染显著减少。

为了测试复合物的表面密度对液滴/水洼岛/浅液层形成的影响，将3μm直径的链霉亲和素涂布的磁珠引入涂覆有生物素的单道玻璃基底流动池。将具有两种不同珠浓度的流体(具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液)引入流动池中。一种流体具有较高的珠浓度，约30,000珠/微升，而另一种流体具有较低的珠浓度，约6,000珠/微升。

流速为100微升/分钟的空气引入每个流动通道中以吸取缓冲液并在磁珠周围形成液滴。对每个流动池获取明场图像，并在图11A和图11B中示出。图11A示出了吸取后具有较高珠浓度的流体的流动池表面，和图11B示出了吸取后具有较低珠浓度的流体的流动池表面。

图11A示出了更密集的固定珠群体，以及由连续液滴形成的几个水洼岛。图11B示出了较不密集的固定珠群体，以及较少的水洼岛和一些隔离的液滴。当比较图11A和图11B时，很明显流动池表面上更多数量的珠(或复合物)使得液滴能够在流动池表面上合并并形成更均匀的液体层。

对具有不同珠浓度的五种流体进行了类似的实验。五种流体由相同的初始流体(即含有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液，其珠浓度为10mg/mL(约700,000珠/微升))制备。初始流体被不同地稀释以产生五种流体中的每一种，例如，流体1＝250倍稀释，流体2＝500倍稀释，流体3＝2,000倍稀释，流体4＝8,000倍稀释，和流体5＝32,000倍稀释。流速为100微升/分钟的空气引入每个流动通道中以吸取缓冲液并在磁珠周围形成液滴。对每个流动池获取明场图像，并显示在图12A(流体1＝250倍稀释)、图12B(流体2＝500倍稀释)、图12C(流体3＝2,000倍稀释)、图12D(流体4＝8,000倍稀释)和图12E(流体5＝32,000倍稀释)中。如所示的，增加的珠表面密度与流体中增加珠的浓度相关。如图13所示，随着珠表面密度降低，单个珠周围的流体域的平均直径逐渐增大。

为了测试空气流速对液滴/水洼岛/浅液层形成的影响，将3μm直径的链霉亲和素涂布的磁珠引入涂覆有生物素的单道玻璃基底流动池。将具有不同珠浓度的流体(含十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液)引入流动池中。一种流体的珠浓度较低，约为7,200珠/微升，而另一种液体的珠浓度较高，约为14,100珠/微升。

使用了两种不同的空气流速，即2000微升/分钟的流速和200微升/分钟的流速。为每个流动池获取明场图像，并在图14A和14B中示出。图14A示出了以较高空气流速吸取流体后的流动池表面，和图14B示出了以较低空气流速吸取流体后的流动池表面。当流速高(2000μL/min)时，液体层更加连续，如图14A所示；然而，当流速低(200μL/min)时，形成的水洼岛彼此之间更加隔离。

用具有相同珠浓度和不同盐浓度的四种流体进行另一项实验。每种流体为具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液，其中珠浓度为10毫克/毫升(约700,000珠/微升)。各溶液中的钠浓度不同，例如，流体6＝750mM Na⁺，流体7＝375mM Na⁺，流体8＝127.5mM Na⁺，和流体9＝93.8mM Na⁺。将流速为100微升/分钟的空气引入每个流动通道中以吸取缓冲液并在磁珠周围形成液滴。为每个流动池获取明场图像，并显示在图15A(流体6＝750mM Na⁺)、图15B(流体7＝375mM Na⁺)、图15C(流体8＝127.5mM Na⁺)和图15D(流体9＝93.8mM Na⁺)中。如所描绘的，增加的盐浓度似乎对形成的液滴没有影响。如图16所示，在不同的盐浓度下单个珠周围的流体域的平均直径保持基本一致(例如，在10μM内)。

附加注解

此外，应当理解，本文提供的范围包括所述范围和所述范围内的任何值或子范围，如同它们被明确列举。例如，由约2毫米至约300毫米表示的范围应被解释为不仅包括明确列举的约2毫米至约300毫米的限值，还包括单个值，例如约15毫米、22.5毫米、245毫米等，及子范围，例如约20毫米至约225毫米等。

应当理解，前述概念和下文更详细讨论的另外概念(条件是这些概念不相互矛盾)的所有组合设想是本文公开的发明主题的部分。特别地，出现在本公开末尾的所要求保护主题的所有组合被认为是本文公开的发明主题的部分。还应当理解，在此明确使用的术语(其也可能出现在通过引用并入的任何公开中)应被赋予与在此公开的特定概念最一致的含义。

虽然已经详细描述了几个实施例，但是应当理解，所公开的实施例可以被修改。因此，前述描述应被视为非限制性的。