具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架及制备方法
阅读说明：本技术 具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架及制备方法 (Graphene/calcium phosphate ceramic composite bracket with antibacterial function and preparation method thereof ) 是由 李向锋 曹全乐 吴永豪 朱向东 张兴栋 于 2021-03-04 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医用材料技术领域,公开了具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架及制备方法。本发明的制备方法,将多孔磷酸钙陶瓷置于一定浓度的石墨烯基材料溶液中,通过真空灌注将石墨烯吸附在多孔磷酸钙陶瓷表面和孔隙中,干燥处理后得到石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。本发明制备的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架不仅具有良好的骨诱导性能,还具有良好的抗菌活性,预期在临床感染性骨缺损再生修复中有广阔的应用前景。(The invention belongs to the technical field of biomedical materials, and discloses a graphene/calcium phosphate ceramic composite support with an antibacterial function and a preparation method thereof. According to the preparation method, the porous calcium phosphate ceramic is placed in a graphene-based material solution with a certain concentration, graphene is adsorbed on the surface and in pores of the porous calcium phosphate ceramic through vacuum infusion, and the graphene/calcium phosphate ceramic composite support is obtained after drying treatment. The graphene/calcium phosphate ceramic composite scaffold prepared by the invention has good bone induction performance and good antibacterial activity, and is expected to have wide application prospect in clinical infectious bone defect regeneration repair.)
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架及制备方法。
背景技术
磷酸钙生物陶瓷因具有良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性等优异生物学效应而被广泛应用于骨修复领域。临床外伤所导致的骨缺损往往伴随着创口污染或感染症状，常规的骨修复材料往往因继发感染而致骨修复失败。随着临床上细菌耐药性的问题日益显著，对骨修复材料的抑菌性能提出了更高的要求。因此，在优化磷酸钙陶瓷骨诱导能力的基础上，通过优化改性的方法使其兼具抗菌性能则具有重要的意义。
表面改性或添加抗菌剂是赋予磷酸钙陶瓷抗菌性能的常用方法，如中国专利CN201210486800.X公开了一种含银抗菌生物陶瓷的制备方法，银离子在缓慢释放中能够提高材料的抗菌作用，但由于银离子的长期释放，又无法排出体外，会在人体内逐渐累积，可能会对人体带来危害。近年来，石墨烯基材料由于具有优异的物理和化学性能，在生物医用材料获得了广泛的研究和应用。近期研究表明，石墨烯的负载可以显著提高骨修复支架的成骨能力(ACS NANO,2019,13(8):9595-9606)。另外，有研究也表明石墨烯具有一定的抗菌能力，其可以通过机械作用，尖锐的边缘与细胞直接接触，对细菌细胞膜的插入进行切割，还可以通过对细胞膜上磷脂分子的相互作用，使大量磷脂分子脱离细胞膜并吸附到石墨烯表面，从而达到杀死细菌的目的(Nature Nanotechnology,2013,8:594-601)。此外，石墨烯基材料在近红外光的辐射作用下会产生光热效应，在一定程度上能够起到抗菌的效果。如中国专利CN202010247310.9公开了一种光热与化疗协同作用的功能化石墨烯靶向杀菌材料的制备方法。然而目前石墨烯基材料在生物陶瓷的应用中，主要用于材料力学性能的增强或光热抗肿瘤中，对其复合陶瓷支架抗菌作用关注较少。
因此，在保持磷酸钙陶瓷优异骨诱导活性的同时，如何通过石墨烯有效负载，进一步赋予材料良好的抗菌性能，满足临床对感染性骨缺损再生修复材料的要求，是目前磷酸钙陶瓷亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提供一种具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架及其制备方法，解决现有技术中磷酸钙陶瓷面临的抗菌性能不足或无的缺点。
本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的一种具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，将多孔磷酸钙陶瓷置于一定浓度的石墨烯基材料溶液中，通过真空灌注将石墨烯基材料吸附在多孔磷酸钙陶瓷表面和孔隙中，干燥处理后得到石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
本发明的部分实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1.配置石墨烯基材料溶液；
步骤2.将多孔磷酸钙陶瓷浸没于石墨烯基材料溶液中，进行真空灌注；
步骤3.取出真空灌注后的多孔磷酸钙陶瓷，进行干燥处理，即得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
本发明中石墨烯基材料溶液的用量应将多孔磷酸钙陶瓷完全浸没。
本发明的部分实施方案中，所述多孔磷酸钙陶瓷为羟基磷灰石和磷酸三钙的单相或两相组成；优选地，所述多孔磷酸钙陶瓷的孔隙率≥30％。
本发明的部分实施方案中，所述石墨烯基材料包括石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、季铵化改性石墨烯中的一种或多种。
本发明的部分实施方案中，所述石墨烯基材料溶液浓度为0.1mg/mL～10mg/mL。
本发明的部分实施方案中，所述真空灌注的灌注时间为5min～30min。本发明的部分实施方案中，重复步骤2和步骤3 1～5次，通过进行不同次数的真空灌注，控制多孔磷酸钙陶吸附的石墨烯基材料的厚度。
本发明的部分实施方案中，所述干燥包括加热干燥或冷冻干燥；优选为冷冻干燥。
本发明所述的制备方法制成的一种具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
本发明的部分实施方案中，所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架表面的石墨烯厚度为：10～1000nm；优选地，石墨烯膜厚度为50～500nm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，方法简单，操作简便，通过真空灌注和干燥处理后即得到具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。陶瓷表面石墨烯的负载，不仅可以进一步提高磷酸钙陶瓷的生物学性能，而且具有较好的光热协同抗菌性能，满足临床感染性骨缺损对骨材料的骨修复能力和抗菌功能的双重要求。
本发明通过不同石墨烯溶液的选择，可以制备得具有不同抗菌能力(石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、季铵化改性石墨烯)的石墨烯结构，满足临床的不同场景的需求。
本发明通过改变石墨烯溶液浓度和真空灌注次数，可以实现石墨烯负载量的控制，制备出具有不同厚度和不同含量的石墨烯结构，进而构建出具有不同抗菌性能和成骨活性的磷酸钙陶瓷，满足临床骨缺损修复的多样需求。
附图说明
附图1为本发明实施例1制备的具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架负载石墨烯前(A-B)后(C-D)的体现显微镜图；
附图2为本发明实施例2(A-B)、实施例5(C-D)和实施例6(E-F)中制备的具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的SEM图；
附图3为本发明试验例一中制备的季胺化改性前后的红外图谱。
附图4为本发明实施例2、实施例5和实施例6中制备的具有抗菌功能的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的光热转化性能图。
附图5为本发明实施例2、实施例4和对照组对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
本发明实施例中所述的多孔磷酸钙初始陶瓷为采用光固化3D打印法制备得到，制备方法见ACS Biomaterials Science and Engineering,2020,1787-1797。该多孔磷酸钙初始陶瓷也可采用微球占位法，泡沫浸渍法，发泡法等方法制得，同时也可选用市售商品级磷酸钙陶瓷，如四川拜阿蒙生物活性材料有限责任公司骨诱导人工骨产品。
本发明实施例中所述的石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、季铵化改性石墨烯均选用市售商品级，其中季铵化改性石墨烯也可选用试验例一方法制备。
本发明实施例中真空灌注时，其相对真空度均控制为-0.01～-0.1MPa。
实施例1
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置0.1mg/ml的石墨烯溶液，将多孔双相磷酸钙陶瓷(质量比HA：β-TCP＝3：7，孔隙率62％)浸没于石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔磷酸钙陶瓷的石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度为-0.08MPa条件下真空灌注10min，取出陶瓷，60℃烘干，烘干后继续放入石墨烯溶液中真空灌注，烘干，重复三次即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
本实施例制得的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的体式显微镜照片如附图1(C-D)所示，与附图1(A-B)所示的未负载的磷酸钙陶瓷支架相比，可以明显看出石墨烯在陶瓷表面的均与负载。通过元素定量分析，复合支架中氧化石墨烯含量为0.43wt.％。
实施例2
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置1.0mg/ml的氧化石墨烯溶液，将多孔羟基磷灰石陶瓷(孔隙率70％)浸没于氧化石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔羟基磷灰石陶瓷的氧化石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度-0.04MPa条件下真空灌注10min，取出陶瓷，进行冷冻干燥，干燥后继续放入氧化石墨烯溶液中真空灌注，冷冻干燥，即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
本实施例制得的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的微观结构如附图2(A-B)所示，可以发现陶瓷表面有一层石墨烯薄层，厚度约为100nm。
实施例3
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置10mg/ml的还原氧化石墨烯溶液，将多孔磷酸三钙陶瓷(孔隙率42％)浸没于还原氧化石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔磷酸三钙陶瓷的还原氧化石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度为-0.1MPa条件下真空灌注30min，取出陶瓷，进行冷冻干燥，干燥后继续放入还原氧化石墨烯溶液中真空灌注，冷冻干燥，即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
实施例4
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置1.0mg/ml的季胺化改性石墨烯溶液，将多孔羟基磷灰石陶瓷(孔隙率56％)浸没于季胺化改性石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔羟基磷灰石陶瓷的季胺化改性石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度为-0.04MPa条件下真空灌注10min，取出陶瓷，进行冷冻干燥，干燥后继续放入季胺化改性石墨烯溶液中真空灌注，冷冻干燥，重复三次即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
实施例5
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置1.0mg/ml的氧化石墨烯溶液，将多孔羟基磷灰石陶瓷(孔隙率70％)浸没于氧化石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔羟基磷灰石陶瓷的氧化石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度为-0.04MPa条件下真空灌注10min，取出陶瓷，进行冷冻干燥，干燥后继续放入氧化石墨烯溶液中真空灌注，冷冻干燥，重复三次即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
本实施例制得的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的微观结构如附图2(C-D)所示，可以发现陶瓷表面有一层石墨烯薄层，厚度约为200nm。
实施例6
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置1.0mg/ml的氧化石墨烯溶液，将多孔羟基磷灰石陶瓷(孔隙率70％)浸没于氧化石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔羟基磷灰石陶瓷的氧化石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度为-0.04MPa条件下真空灌注10min，取出陶瓷，进行冷冻干燥，干燥后继续放入氧化石墨烯溶液中真空灌注，冷冻干燥，重复五次即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
本实施例制得的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的微观结构如附图2(E-F)所示，可以发现陶瓷表面有一层石墨烯薄层，厚度约为500nm。
实施例7
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置1mg/ml的石墨烯溶液，将多孔双相磷酸钙陶瓷(质量比HA：β-TCP＝3：7，孔隙率62％)浸没于石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔磷酸钙陶瓷的石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度为-0.08MPa条件下真空灌注10min，取出陶瓷，60℃烘干，烘干后继续放入石墨烯溶液中真空灌注，烘干，重复三次即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
通过元素定量分析，本实施例制得的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架中石墨烯含量为1.05wt.％。
实施例8
本实施例公开了本发明的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的制备方法，具体为：
(1)配置5mg/ml的石墨烯溶液，将多孔双相磷酸钙陶瓷(质量比HA：β-TCP＝3：7，孔隙率62％)置于石墨烯溶液中；
(2)将包含多孔磷酸钙陶瓷的石墨烯溶液转移至抽滤瓶中，在相对真空度为-0.08MPa条件下真空灌注10min，取出陶瓷，60℃烘干，烘干后继续放入石墨烯溶液中真空灌注，烘干，重复三次即可得到所述石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
通过元素定量分析，本实施例制得的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架中石墨烯含量为2.23wt.％。
试验例一、季铵化改性石墨烯的制备和表征
1、配置浓度为1mg/mL的氧化石墨烯溶液，加入20mg N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，超声分散1h；
2、在温度为60℃水浴下，将10mL N，N-二甲基1，3-丙二胺(DMPDA)加入氧化石墨烯分散液中，反应1h。待反应结束后将10mg二环己基碳二亚胺加入溶液中，在温度为60℃条件下继续反应，并冷却回流12h，待反应后用DMF和蒸馏水洗涤，从而得到反应产物；
3、将反应产物干燥后，通过超声将其与二甲亚砜(DMSO)配置成1mg/mL分散液，超声时间为1h。然后加入2mg溴己烷，在60℃水浴条件下，反应8h。待反应结束后用乙醇和水洗涤，冻干，从而得到季铵化改性石墨烯。
本试验例制得的季铵化改性石墨烯红外光谱图如附图5所示，与氧化石墨烯(GO)相比，C-O键(1730)、羧基(1400)和C-O-C键(1226)均消失或减弱，表明GO表面含氧官能团均参与反应；烷基链的C-C伸长峰(1251)，C-H弯曲峰(1462)和甲基和亚甲基的C-H伸长峰(2956、2927、2874、2842)、亚酰胺的C-N和N-H峰(1375)，季胺基(1124)等峰的出现，表明季铵化改性石墨烯的成功合成。
试验例二、材料的光热转化性能
1、试验材料：实施例2、实施例5和实施例6制备的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
2、试验方法：
利用808mm近红外光照射多孔磷酸钙陶瓷，通过热成像仪实时检测并记录材料温度的变化，从而测定材料的光热效应。
试验结果如附图4所示，三种具有不同石墨烯厚度的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架都具有良好的光热转化效应，随着石墨烯厚度的增加，其光热效应最高温度也逐渐升高，实施例2、实施例5和实施例6制备的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架的光热效应最高温度分别为71℃、80℃和93℃。
试验例三、材料的抗菌性能
1、试验对象：选取金葡萄球菌和大肠杆菌为实验细菌，由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。
2、试验材料：实施例2制备的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架和实施例4制备的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架。
对照组：实施例2未经原位石墨烯膜包覆的初始磷酸钙陶瓷。
3、试验方法：
1)将所需材料放到超净台内，紫外光照射超净台30min；
2)在15ml离心管中导入约5ml培养基，在大肠杆菌培养皿中挑出一个菌落，用移液枪冲入培养基中，轻微摇晃均匀，在摇床中培养3-4个小时，金黄色葡萄球菌步骤相同；
3)取出培养好的细菌液，将其稀释到1×105CFU/ml，每孔中加入500μL细菌液，并采用808mm近红外光照射每个孔5min，重复三次，完成后放入孵箱中培养24h；
4)待培育完成后，取对应的细菌液各100μL，加入到96孔板中，用酶标仪测量结果，结果制图，抗菌率计算：
抗菌率(％)＝(对照组细菌数-实验组细菌数)/对照组细菌数
4、试验结果如附图5所示，对照组对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌几乎没有抑菌效果。实施例2制备的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架由于其出色的光热转化效应，表现出良好的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为81.9％和75.5％。实施例4制备的石墨烯/磷酸钙陶瓷复合支架协同了季胺化改性石墨烯和光热转化效应抗菌功能，表现出优异的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为92.6％和92.9％。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。