一种粉葛茎尖培养快速繁殖方法
阅读说明：本技术 一种粉葛茎尖培养快速繁殖方法 (Rapid propagation method for culturing stem tip of pueraria thomsonii ) 是由 王继华 梅瑜 李向荣 蔡时可 顾艳 周芳 徐世强 孙铭阳 李静宇 于 2020-11-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种粉葛茎尖培养快速繁殖方法,包括以下步骤：(1)外植体选取与消毒；(2)培养基的制备；(3)茎尖分离与不定芽诱导培养：将消毒外植体的茎尖接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养,得到粉葛不定芽；(4)继代增殖：将粉葛不定芽接入继代增殖培养基中进行继代增殖培养,得到粉葛无菌苗；(5)无菌生根：将粉葛无菌苗进行切繁,接入无菌生根培养基中进行生根培养,得到粉葛幼苗,然后炼苗、移栽；(6)脱毒种苗鉴定：取植株叶片进行RNA鉴定,选择无毒核酸相应序列的株系作为健康种苗进行扩繁。本发明粉葛茎尖培养快速繁殖方法可以快速培养出没有病原菌聚集的粉葛种苗,提高繁殖系数,且培养周期短。(The invention provides a rapid propagation method for culturing a stem tip of pueraria thomsonii, which comprises the following steps: (1) selecting and disinfecting explants; (2) preparing a culture medium; (3) separating stem tips and carrying out adventitious bud induction culture: inoculating the stem tip of the sterilized explant into an adventitious bud induction culture medium for induction culture to obtain an adventitious bud of the pueraria thomsonii; (4) subculture proliferation: inoculating adventitious buds of radix Puerariae into a subculture multiplication medium for subculture multiplication to obtain aseptic seedlings of radix Puerariae; (5) sterile rooting: cutting and propagating the sterile pueraria thomsonii seedlings, inoculating the sterile pueraria thomsonii seedlings into a sterile rooting culture medium for rooting culture to obtain pueraria thomsonii seedlings, and then hardening and transplanting the seedlings; (6) identification of detoxified seedlings: and (3) taking plant leaves for RNA identification, and selecting a strain with a corresponding sequence of non-toxic nucleic acid as a healthy seedling for propagation. The rapid propagation method for culturing the stem tip of the pueraria thomsonii can rapidly culture the seedlings of the pueraria thomsonii without gathering pathogenic bacteria, improve the propagation coefficient and have short culture period.)
技术领域
本发明属于植物快速繁殖技术领域，具体涉及一种粉葛茎尖培养快速繁殖方法。
背景技术
粉葛(PuerariathomsoniiBenth.)为豆科葛属多年生藤本植物，是辛凉解表的传统中草药，有着“南方人参”的美称。粉葛分布广泛，在我国大部地区有着悠久的种植历史，部分粉葛还获得了国家地理标志，是一种重要的“药食同源”植物。粉葛具有解肌退热、通经活络，解酒毒等功能，其中以粉葛为主要原料的有桑葛降脂丸、粉葛汤片、粉葛汤颗粒、粉葛芩连丸和粉葛芩连片等中成药。粉葛种质资源丰富，含有淀粉、黄酮和粉葛素等成分，大多具有保健功能，可加工为功能性食品，市场前景极为广阔。
粉葛的繁殖主要依靠对成年的茎进行分枝，这些老茎富含葛根素等药效成分，是制作葛根茶的优良原料，作为种苗的繁殖系数较低；同时成本也较高；加之，种茎粗细不一，生长不一致，不便于后期规范生产，而且长期的无性繁殖，病原菌在体内聚集，影响生长，导致粉葛经济价值下降，市场上缺乏生长旺盛而又生长一致的健康种苗。茎尖脱毒技术是生产上常用培育健康种苗的技术，如甘蔗、柑橘和芋等，产生了良好的经济效益。利用茎尖脱毒结合组培工厂化育苗技术培育的粉葛健康种苗具有良好的市场前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种粉葛茎尖培养快速繁殖方法，解决现有粉葛的繁殖采用药用价值高的成年茎进行繁殖成本高，种苗不整齐和种茎带病菌，繁殖系数较低的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种粉葛茎尖培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：选取粉葛幼嫩枝条作为外植体进行消毒处理，得到消毒外植体；
(2)培养基的制备：制备改良MS培养基，然后在改良MS培养基的基础上分别制备不定芽诱导培养基、继代增殖培养基和无菌生根培养基；所述改良MS培养基配方为在MS培养基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，浓度为10-20mg/L；
(3)茎尖分离与不定芽诱导培养：将消毒外植体的芽在解剖镜下进行无菌分离，接种于不定芽诱导培养基中进行诱导培养，得到粉葛不定芽；
(4)继代增殖：将粉葛不定芽接入继代增殖培养基中进行继代增殖培养，得到粉葛无菌苗；
(5)无菌生根：将粉葛无菌苗进行切繁，接入无菌生根培养基中进行生根培养，得到粉葛幼苗，然后炼苗、移栽；
(6)脱毒种苗鉴定：取植株叶片进行RNA鉴定，选择无毒核酸相应序列的株系作为健康种苗进行扩繁。
本发明中，消毒处理为先采用酒精浸泡，再放入升汞溶液消毒。
进一步地，所述酒精浸泡是采用70％酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗；所述升汞溶液消毒是采用0.1-0.3％的升汞溶液消毒8-12min，再用无菌水洗涤。
本发明可以做以下改进，所述不定芽诱导培养基配方为在所述改良MS培养基上添加6-BA和IBA；在不定芽诱导培养基中6-BA的浓度为0.05-0.2mg/L，IBA的浓度为0.05-0.5mg/L。
优选地，在所述用于不定芽诱导的培养基中6-BA的浓度为1mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L。
本发明中，消毒外植体的芽是粉葛茎段的腋芽，大小为0.5*0.5mm。
本发明中，所述诱导培养条件是温度为28±2℃，湿度为60-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；培养时间为18-22天。
本发明可以进一步做以下改进，所述继代增殖培养培养基配方为在所述改良MS培养基上添加6-BA和IBA；在继代增殖培养基中6-BA的浓度为0.5-1mg/L，IBA的浓度为0.05-0.5mg/L。
优选地，在所述用于继代增殖的培养基中6-BA的浓度为1mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L。
本发明中，所述继代增殖培养条件是温度为28±2℃，湿度为60-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；培养时间为20-25天。
本发明还可以进一步改进，所述无菌生根培养基配方为在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，在生根培养基中IBA的浓度为0.1-1mg/L，NAA的浓度为1-2.5mg/L。
优选地，在所述用于无菌生根的培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为1mg/L。
本发明中，所述生根培养条件是温度为26±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x；培养时间为15-20天。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明粉葛茎尖培养快速繁殖方法可以快速培养出没有病原菌聚集的粉葛植株种苗，茎尖培养没有通过愈伤组织途径变异小，更能保持母本的优良性状；能有效提高繁殖系数，且培养周期短，种植效益大大提高，能够有效解决粉葛种苗不纯的问题。
(2)本发明根据粉葛种苗的繁育和生长特性，建立茎尖分离方法并在MS培养基的基础上配置出适合粉葛组织培养的用于不定芽诱导的培养基、用于继代增殖的培养基和用于无菌生根的培养基。
(3)本发明粉葛茎尖培养快速繁殖方法，生产的种苗生长整齐一致，便于后期管理，降低生产成本，同时保障种苗的一致，提高种植和销售者的收入，促进粉葛产业的发展。
说明书附图
图1为本发明粉葛茎尖分离情况；
图2为本发明粉葛不定芽的诱导培养情况；
图3为本发明粉葛的不定芽增殖培养情况；
图4为本发明粉葛生根培养情况；
图5为本发明粉葛组培苗炼苗情况；
图6为本发明粉葛健康组培苗的情况；
图7为本发明粉葛种苗移栽的情况。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。
实施例1
一种火山粉葛茎尖培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健康的粉葛幼嫩的枝条作为外植体，
②用中性洗涤剂洗涤洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，
③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡20s，再用无菌水冲洗3次，每次4min，
④立即转入0.2％的升汞溶液中消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次5min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：改良MS培养基的制备，配方为：在MS培养基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP),浓度为15mg/L。
(3)茎尖剥离与不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽茎段，然后在体视显微镜下取约0.5mm大小的茎尖生长点，接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养20天，得到粉葛不定芽；诱导培养条件如下：温度为28±2℃，湿度为60-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为10001x；培养约1个月，形成蕾状凸起，部分开始出现子叶展开的不定芽；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和IBA；其中6-BA的浓度为1mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的粉葛不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养23天，得到粉葛无菌苗；继代增殖培养条件如下：温度为28±2℃，湿度为60-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为10001x；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和IBA；其中6-BA的浓度为1mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L；
(5)无菌生根：
将步骤(4)获得的粉葛无菌苗进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入用于无菌生根的培养基中进行生根培养18天，得到粉葛幼苗；生根培养条件如下：培养温度为26±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为10001x；所述用于无菌生根的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为1mg/L；
步骤(5)中粉葛幼苗生长至根长0.5cm、苗高3cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5天，然后洗净根部培养基，浸泡0.1％多菌灵溶液10分钟，将组培种植装有泥炭土的营养杯中，保持叶面湿度，成活率95％以上。
(6)脱毒种苗鉴定：
取植株叶片进行总RNA的提取及质检、文库构建、高通量测序和质控等，选取cleanreads中长度为18-36nt的sRNA进行序列拼接，获得重叠群(contigs)。将拼接所得的contigs与核酸数据库(NCBI)进行比对得到高度同源的序列，再与毒核酸数据库和病毒蛋白数据库进行比对，鉴定是否含有小RNA，从而判断是否为健康种苗，选择无相应序列的株系作为健康种苗进行扩繁。
实施例2
一种南沙粉葛茎尖培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取与消毒：
①选取生长健康的粉葛幼嫩的枝条作为外植体，
②用中性洗涤剂洗涤洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，
③在超净工作台上，先用70％酒精浸泡25s，再用无菌水冲洗3次，每次3min，
④立即转入0.25％的升汞溶液中消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次5min，得到消毒外植体；
(2)改良MS培养基的制备：
改良MS培养基的配方为：改良MS培养基的制备，配方为：在MS培养基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP),浓度为15mg/L。
(3)茎尖剥离与不定芽诱导：
将步骤(1)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽茎段，然后在体视显微镜下取约0.5mm大小的茎尖生长点，接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养22天，得到粉葛不定芽；诱导培养条件如下：温度为28±2℃，湿度为60-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为9001x；培养约1个月，形成蕾状凸起，部分开始出现子叶展开的不定芽；所述用于不定芽诱导的培养基的配方为：在所述改良MS培养基上添加6-BA和IBA；其中6-BA的浓度为1mg/L，IBA的浓度为0.2mg/L；
(4)继代增殖：
将步骤(3)得到的粉葛不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养24天，得到粉葛无菌苗；继代增殖培养条件如下：温度为28±2℃，湿度为60-80％，光照时间为14小时/天，光照强度为9001x；所述用于继代增殖的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA和IBA；其中6-BA的浓度为1mg/L，IBA的浓度为0.5mg/L；
(5)无菌生根：
将步骤(4)获得的粉葛无菌苗进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入用于无菌生根的培养基中进行生根培养19天，得到粉葛幼苗；生根培养条件如下：培养温度为26±3℃，湿度为50-65％，光照时间为14小时/天，光照强度为9001x；所述用于无菌生根的培养基的配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为1mg/L；
步骤(5)中粉葛幼苗生长至根长0.5cm、苗高3cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5天，然后洗净根部培养基，浸泡0.1％多菌灵溶液10分钟，将组培种植装有泥炭土的营养杯中，保持叶面湿度，成活率95％以上。
(6)脱毒种苗鉴定：
取植株叶片进行总RNA的提取及质检、文库构建、高通量测序和质控等，选取cleanreads中长度为18-36nt的sRNA进行序列拼接，获得重叠群(contigs)。将拼接所得的contigs与核酸数据库(NCBI)进行比对得到高度同源的序列，再与毒核酸数据库和病毒蛋白数据库进行比对，鉴定是否含有同源小RNA，从而判断是否为健康种苗，选择无相应序列的株系作为健康种苗进行扩繁。
以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此，所属技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
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