一种基于led光质加速诱导苹果愈伤组织及生长的方法
阅读说明：本技术 一种基于led光质加速诱导苹果愈伤组织及生长的方法 (Method for accelerating induction of apple callus and growth based on LED light quality ) 是由 黄文静 杨光柱 刘丹丹 马钧 李帆 郑丽萍 陈瑶 于 2020-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于LED光质加速诱导苹果愈伤组织及生长的方法,包括：采用春季发出的幼嫩叶片接种于愈伤组织诱导培养基进行培养,并放置于LED红光绿光1:1配比的光照条件下进行光照；将外植体及产生的愈伤组织转入愈伤组织增殖培养基中继续培养,并放置于LED红光绿光配比的光照条件下进行光照。本发明提供的方法,可提升苹果属植物诱导、培养愈伤组织的速率,总培养时间40-50天左右,可培养出大量愈伤组织,与常规黑暗条件培养比较,缩短了愈伤组织诱导时间8-10天左右、增殖培养时间40-50天左右。(The invention provides a method for accelerating induction of apple callus and growth based on LED light quality, which comprises the following steps: inoculating young leaves emitted in spring to a callus induction culture medium for culture, and placing under the illumination condition of the proportion of 1:1 of LED red light and green light for illumination; transferring the explant and the generated callus into a callus proliferation culture medium for continuous culture, and placing the callus proliferation culture medium under the illumination condition of the LED red light and green light ratio for illumination. The method provided by the invention can improve the speed of inducing and culturing the callus of the Malus plants, the total culture time is about 40-50 days, a large amount of callus can be cultured, and compared with the conventional dark condition culture, the method shortens the callus induction time by about 8-10 days and the propagation culture time by about 40-50 days.)
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种基于LED光质加速诱导苹果愈伤组织及生长的方法。
背景技术
愈伤组织是原植物体局部受到创伤后，在伤口表面新生的组织，由薄壁细胞组成，可以是植物体任何器官内各种组织的细胞，是培养细胞悬浮系和原生质体的基础材料。植物愈伤组织具有多种用途，可用于研究植物生长发育及分化机制、遗传变异规律等，对植物遗传育种具有特殊意义。愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和育种的理想途径。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别，木本植物与草本植物愈伤组织诱导培养差异较大，主要是培养基配方、外源激素、培养条件、培养光照条件的不同。
苹果属植物叶片愈伤组织诱导一般是在诱导培养基中，24-25℃，暗培养15-20天，将诱导出的愈伤组织及外植体转移到增殖培养基上，24-25℃，暗培养，直到产生大量愈伤组织，增殖培养时间60-80天，总耗时75-100天。
LED作为新一代半导体固态冷光源，在农作物栽培光源领域，如在设施园艺产业、人工光栽培的植物组织培养、种苗繁育、植物工厂蔬菜生产，其应用规模正逐年增加。有研究表明，不同LED光质搭配可以提升组织培养植株的增殖系数、降低培养成本等方面有着优势。
常规苹果属植物愈伤组织诱导采用试管苗叶片，诱导培养基为LS+6-BA 5.0mg/ml+2,4-D 0.1mg/ml，pH 5.7-5.8，琼脂7g/L，蔗糖30g/L，放置于24-25℃黑暗条件下培养，14天左右发生愈伤组织；后转入增殖培养基LS+6-BA 5.0mg/ml+2,4-D 0.2mg/ml，pH 5.7-5.8，琼脂7g/L，蔗糖30g/L，放置于24-25℃黑暗条件下培养，30天左右产生愈伤组织，50天左右愈伤组织充分增大。全程黑暗培养，总时长65天左右可诱导培养出愈伤组织。
然而，诱导木本植物愈伤组织所需的培养条件有差异，在诱导时间来看，耗时较长，以苹果属植物来说，从外植体诱导开始，24-25℃，黑暗培养14天左右出现愈伤组织，转入增殖培养基后，同样条件一般需要60-80天才能诱导出适量的愈伤组织，可见，耗时较长，且激素使用浓度较高。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种基于LED灯在苹果属植物诱导愈伤组织过程中缩短诱导、培养时间，提升培养愈伤组织的速率的方法。一种基于LED光质加速诱导苹果愈伤组织及生长的方法，包括以下步骤：
愈伤组织诱导：采用春季发出的幼嫩叶片接种于愈伤组织诱导培养基进行培养,并放置于LED红光绿光1:1配比的光照条件下进行光照；
所述愈伤组织诱导培养基为：LS+6-BA 2.0mg/ml+2,4-D 1.0mg/ml+IAA0.5mg/ml，pH 5.7-5.8，琼脂7g/L，蔗糖30g/L；
愈伤组织增殖培养：将外植体及产生的愈伤组织转入愈伤组织增殖培养基中继续培养，并放置于LED红光绿光1:1配比的光照条件下进行光照；；
所述愈伤组织增殖培养基为：LS+6-BA 1.0mg/ml+2,4-D 0.5mg/ml+ZT 0.1mg/ml，pH 5.7-5.8，琼脂7g/L，蔗糖30g/L。
进一步地，如上所述的方法，在所述愈伤组织诱导阶段，培养条件为：将叶片切成1-1.5厘米大小方块状，叶片背面接触培养基，灯带功率为12w/m，培养温度24-25℃，12h/d光照，培养7-10天。
进一步地，如上所述的方法，在所述愈伤组织诱导阶段，所述春季发出的幼嫩叶片在进行培养前，先经过灭菌处理。
进一步地，如上所述的方法，所述灭菌处理的方式为：将春季发出的幼嫩叶片洗洁精清洗干净后，于超净工作台中，酒精清洗30秒，灭菌水清洗2次，0.1％升汞摇动灭菌10-12分钟，无菌水清洗3-4次。
有益效果：
本发明提供的方法，减少了激素的使用量，在红光绿光1:1条件下培养，可提升苹果属植物诱导、培养愈伤组织的速率，总培养时间40-50天左右，可培养出大量愈伤组织，与常规黑暗条件培养比较，缩短了愈伤组织诱导时间8-10天左右、增殖培养时间40-50天左右。
附图说明
图1为LED红光绿光1:1诱导培养苹果属愈伤组织图片；
图2为苹果叶片愈伤组织增殖培养第20天图片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
本发明提供的方法是利用新型光源LED，红色、绿色光质配比1:1条件下，快速诱导苹果属植物愈伤组织的方法，以苹果砧木JM7春季叶片愈伤组织诱导培养为例，具体过程如下：
愈伤组织诱导阶段：采用春季JM7发出的幼嫩叶片，洗洁精清洗干净后，于超净工作台中，酒精清洗30秒，灭菌水清洗2次，0.1％升汞摇动灭菌10-12分钟，无菌水清洗3-4次，叶片切成1-1.5厘米大小方块状，叶片背面接触培养基，每瓶中放置5-8片，接种于愈伤组织诱导培养基LS+6-BA 2.0mg/ml+2,4-D 1.0mg/ml+IAA 0.5mg/ml，pH 5.7-5.8，琼脂7g/L，蔗糖30g/L，放置于专利号为ZL 2019 21299069.3的组培架，LED红光、绿光配比1:1，灯带功率为12w/m，培养温度24-25℃，12h/d光照，培养7-10天，可见愈伤组织形成，以黑暗培养为对照。将外植体及产生的愈伤组织转入愈伤组织增殖培养基中继续培养；
愈伤组织增殖培养阶段：将外植体及产生的愈伤组织转入愈伤组织增殖培养基中继续培养，LS+6-BA 1.0mg/ml+2,4-D 0.5mg/ml+ZT 0.1mg/ml，pH 5.7-5.8，琼脂7g/L，蔗糖30g/L，放置于LED红光绿光配比为1:1的光照条件下，12h/d，24-25℃，培养30-40天，可获得大量愈伤组织，以黑暗培养为对照。
以黑暗培养诱导苹果JM7愈伤组织为对照，每组处理100片大小1.5×1.5厘米2叶片，从第7天开始，每隔10天，记录愈伤组织生长情况及数量。从表1可知，LED处理组第7天开始，叶片伤口边缘出现愈伤组织，第17天85％叶片伤口边缘均出现愈伤组织，转入增殖培养基，继续培养；黑暗处理组，第7天，无愈伤组织出现。第17天，有愈伤组织出现。第27天，30％的叶片边缘出现愈伤组织。第37天，80％叶片出现愈伤组织。
表1 LED处理组与黑暗处理组诱导JM7愈伤组织时间表
愈伤组织增殖培养阶段，LED处理组从培养第18天开始计算时间，黑暗处理组从培养第48天开始计算时间，每隔10天调查愈伤组织体积大小及数量。从表2可知，LED处理组，培养第28天，100％叶片形成致密乳白色颗粒状愈伤组织。第38天，愈伤组织膨大生长，致密，乳白色,体积1×1cm2。第48天，愈伤组织继续膨大生长，致密，乳白色，体积1.5×1.5cm2左右，可用于分化、原生质体培养等用途。黑暗处理组，培养第48天，90％叶片边缘形成颗粒状愈伤组织。第58天，100％叶片边缘形成颗粒状愈伤组织。培养到第98天，愈伤组织膨大生长，致密，乳白色，体积1.5×1.5cm2左右，可用。
表2 LED处理组与黑暗处理组愈伤组织增殖培养时间表
图1为LED红光绿光1:1诱导培养苹果属愈伤组织图片；图2为苹果叶片愈伤组织增殖培养第20天图片，通过图1、图2可以看出，采用本发明提供的方法可以缩短愈伤组织诱导时间。
综上，本发明采用LED红色、绿色配比1:1为培养光照条件，诱导、培养苹果砧木JM7，总培养时间为48天，可培养出大量愈伤组织，用于分化或原生质体培养等.常规黑暗总培养时间为98天。LED处理组缩短了愈伤组织诱导时间8-10天左右、增殖培养时间40-50天左右。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
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