加巴喷丁原料药中微量杂质d的分离制备方法
阅读说明：本技术 加巴喷丁原料药中微量杂质d的分离制备方法 (Separation preparation method of trace impurity D in gabapentin bulk drug ) 是由 何匡 朱银龙 沈丽洒 夏鑫佳 彭家荣 于 2020-12-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备方法,微量杂质D的分子式为C-(18)H-(29)NO-3,采用逆流色谱法对加巴喷丁原料药中的微量杂质D进行分离制备；所述逆流色谱法以正丁醇：甲醇：0.2％甲酸水溶液为溶剂体系进行分离制备；通过紫外检测器的在线监测,根据图谱收集、合并目标流分并旋转蒸发至干,得杂质D。采用本发明的方法能便于对加巴喷丁系列产品进行质量控制。(The invention discloses a method for separating and preparing trace impurity D in gabapentin bulk drug, wherein the molecular formula of the trace impurity D is C 18 H 29 NO 3 Separating and preparing trace impurity D in the gabapentin bulk drug by adopting a counter-current chromatography; the counter current chromatography is carried out with n-butanol: methanol: separating and preparing by using 0.2% formic acid aqueous solution as a solvent system; and (4) collecting and combining target fractions according to a map by on-line monitoring of an ultraviolet detector, and performing rotary evaporation to dryness to obtain an impurity D. The method of the present invention can facilitate the quality control of gabapentin series products.)
技术领域
本发明属于药物杂质研究技术领域，具体涉及加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备方法，特别是采用高速逆流色谱法从加巴喷丁原料药中分离制备微量杂质D的方法。
背景技术
药物在生产过程中会引入一些杂质，常常是由于原料不纯或反应不完全、中间产物和反应副产物的存在、药物在贮存过程中受外界条件的影响而产生有关杂质，如在温度、湿度、微生物、时间等因素的影响和作用下，引起药物发生水解、氧化、分解、异构化、发霉等变化，使药物中产生有关的杂质。此外，与生产器皿的接触也会不同程度地引入重金属及砷盐等。因此在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面，必须保持药物的纯度，降低药物的杂质，这样才能保证药物的有效性和安全性。
加巴喷丁(Gabapentin)，是美国Warner-Lanbert公司首先开发的抗癫痫药，于1993年首次在英国上市。加巴喷丁是一种新颖的抗癫痫药，它是γ－氨基丁酸(GABA)的衍生物，其药理作用与现有的抗癫痫药不同，研究表明加巴喷丁的主要作用机理是通过改变GABA代谢进行的，其在各种动物模型中均显示预防癫痫的作用。另外，在动物痉挛、镇痛和肌萎缩性测索硬化模型中也显示出一定的作用。同时，加巴喷丁对脑组织的新颖结合点有高的亲和性，它能通过氨基酸转移体通过体内一些屏障，同其它抗惊厥药相比，加巴喷丁具有较小的行为和心血管副作用。
加巴喷丁相关杂质D是加巴喷丁生产过程中形成的一种微量杂质，其分子式为C18H29NO3，其化学结构如式I所示。由于杂质D在加巴喷丁中的含量极低(<0.5％)，很难用传统的分离方法(如重结晶、蒸馏等)将其从中分离出来，如果用制备型高效液相色谱(HPLC)来分离纯化杂质D，由于使用昂贵的色谱级试剂以及C18制备色谱柱，使用成本极高且耗时较长。
高速逆流色谱(High-Speed Countercurrent Chromatography，CCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题---样品易被吸附、损耗和变性，使用其它液相色谱法进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大等缺陷；HSCCC能保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和并且节约溶剂。
该方法目前尚未用于加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备的原因是：未发现能够有效分离微量杂质D的逆流色谱两相溶剂体系。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从加巴喷丁中分离制备微量杂质D的方法；以便于对加巴喷丁系列产品进行质量控制。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备方法，微量杂质D的分子式为C18H29NO3：
采用逆流色谱法对加巴喷丁原料药中的微量杂质D进行分离制备；
所述逆流色谱法以正丁醇：甲醇：0.2％(体积％)甲酸水溶液为溶剂体系进行分离制备；通过紫外检测器的在线监测，根据图谱收集、合并目标流分并旋转蒸发至干，得杂质D。作为本发明的加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备方法的改进，包括以下步骤：
1)、将正丁醇：甲醇：0.2％(体积％)甲酸水溶液按照5:0.8～1.2:4.5～5.5的体积比配制后倒入分液器中，形成互不相溶的两相溶剂(当溶剂分层后将两相分开)，从而分别得上相和下相；
2)、将步骤1)所得的两相溶剂中的上相与下相按照1:1的体积比混合，得混合剂；将加巴喷丁原料药溶于所述混合剂中，得到加巴喷丁原料药溶液，所述加巴喷丁原料药与混合剂的料液比为0.4～0.8g/9～11mL；
3)、将步骤1)所得的两相溶剂中的上相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤2)所得的加巴喷丁原料药溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的下相作流动相，流动相的流速为4.0～6.0mL/min，收集保留时间为320～335min的组分，旋转蒸发至干后(温度为45±5℃，至旋干)，得到微量杂质D(为纯化的杂质D)。
备注说明：注入流动相后，杂质D便在逆流色谱仪内进行连续的分配，通过紫外检测器的在线监测，根据图谱收集、合并流出物(收集保留时间为320～335min的组分)。
作为本发明的加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备方法的进一步改进，正丁醇：甲醇：0.2％甲酸水溶液＝5:1:5的体积比。
作为本发明的加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备方法的进一步改进：
加巴喷丁原料药与混合剂的料液比为600mg/10mL。
作为本发明的加巴喷丁原料药中微量杂质D的分离制备方法的进一步改进：
所述流动相的流速为5.0mL/min。
本发明建立了由正丁醇：甲醇：0.2％甲酸水溶液组成的溶剂体系，实现了逆流色谱中加巴喷丁原料药与微量杂质D的分离。
本发明所述的加巴喷丁原料药中的微量杂质D，其分子量为307.43Da，分子式为C18H29NO3，化学结构式如上述(I)所示。
本发明采用的逆流色谱(CCC)方法是基于样品在两种互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中各组分在通过两溶剂相过程中因分配系数不同而得以分离。是一种不用固态支撑体的全液体色谱方法，它避免了固态支持体或载体造成的吸附、损耗和变性等问题，能保证较高的峰型分辨度。且逆流色谱操作简单，因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。与HPLC相比，逆流色谱进样量较大，最多可达数克，是HPLC的数百倍；与常压、低压色谱相比，CCC的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。因此逆流色谱是一种经济的从加巴喷丁原料药中分离杂质D的方法。本发明为生产加巴喷丁原料药系列产品的质量研究及杂质定量控制提供了便捷的杂质对照品制备方法，可以为申报临床用药制定杂质限量提供可靠依据。
综上所述，为了方便且廉价的获得高纯度的微量杂质D，本发明提供一种有效的逆流色谱方法对加巴喷丁原料药中的杂质D进行一步高效分离纯化，以便于快速、经济的获得高纯度的加巴喷丁杂质D对照品，对加巴喷丁系列产品进行药物质量控制。
附图说明
下面结合附图对本发明的
具体实施方式
作进一步详细说明。
图1为实施例1中加巴喷丁原料药的高效液相分析图；
图2为实施例1中分离微量杂质D的高速逆流色谱图；
图3为实施例1中分离纯化的杂质D的高效液相分析图；
图4为实施例1中分离纯化的杂质D的核磁共振氢谱图；
图5为实施例1中分离纯化的杂质D的核磁共振碳谱图；
图6为实施例1中分离纯化的杂质D的核磁共振DEPT135°谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例所用的加巴喷丁原料药，经过分析型高效液相色谱面积归一化法检测，加巴喷丁原料药的含量为99.7％，微量杂质D的含量为0.3％。
加巴喷丁原料药及微量杂质D的高效液相色谱分析均依据《欧洲药典》(EP)的高效液相色谱法进行。
实施例1、一种从加巴喷丁原料药中分离制备杂质D的方法，利用逆流色谱仪，依次进行以下步骤：
1)、将正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液，按体积比为5:1:5配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相；即，分别得上相和下相。
2)、将加巴喷丁原料药600mg溶于5ml上相和5ml下相中形成样品溶液(加巴喷丁原料药溶液)；逆流色谱柱内径2.6mm，柱体积为310ml。以上相作为固定相，下相为流动相，待逆流色谱仪分离柱内注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为1200转，以5.0ml/min的流速注入流动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长215nm，收集、合并流出物(收集保留时间为320～335min的组分)，旋转蒸发(温度为45℃，至旋干)，得到1.63mg微量杂质D，经高效液相色谱分析其纯度为98.7％，回收率为89.4％。
回收率的计算公式为：(MD×PD)/(MP×CD)×100％，其中MD为纯化获得的杂质D的质量，PD为纯化获得的杂质D的纯度，MP为一次进样加巴喷丁原料药的质量，CD为加巴喷丁原料药中杂质D的含量。
分离杂质D的高速逆流色谱图，如图2所述；分离得到的杂质D的高效液相分析图，如图3所述。
样品(实施例1分离制备而得的杂质D)的1H-NMR谱图(图4)显示出4组质子峰，对应分子中28个氢原子。各质子的谱峰归属如下：1.18-1.52(20,m)的质子依据化学位移值，归属为C-3、C-4、C-5、C-6、C-7、C-14、C-15、C-16、C-17和C-18位的亚甲基质子；1.470(4,s)的质子依据化学位移值，归属为C-2和C-12位的亚甲基质子；3.17(2,s)依据化学位移值，归属为C-9位上的亚甲基质子；3.27(2,s)依据化学位移值，归属为C-10位上的亚甲基质子；样品的13C-NMR谱图(图5)上显示共有14组碳信号，对应样品分子结构中的18个碳原子，表明样品分子有对称结构；结合DEPT135°谱(图6)可知，14组碳信号包括10组亚甲基和4组季碳碳信号，C-1至C-18的化学位移归属如表1所示，与杂质D的化学结构一致。
表1杂质D的NMR图谱数据解析列表
实施例2-1、一种从加巴喷丁原料药中分离制备杂质D的方法：
将实施例1步骤2)中流动相的注入流速由5.0ml/min改成6.0ml/min，其余等同于实施例1。最终所得的杂质D，其纯度为96.2％，回收率为87.4％。
实施例2-2、一种从加巴喷丁原料药中分离制备杂质D的方法：
将实施例1步骤2)中流动相的注入流速由5.0ml/min改成4.0ml/min，其余等同于实施例1。最终所得的杂质D，其纯度为96.5％，回收率为85.9％。
实施例3、一种从加巴喷丁中分离制备杂质D的方法：
将实施例1步骤2)中加巴喷丁原料药的用量由600mg改成700mg，且，将流动相的注入流速由5.0ml/min改成6.0ml/min，其余等同于实施例1。最终所得的杂质D，其纯度为91.5％，回收率为83.6％。
对比例1-1、将实施例1中的正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)组成的两相溶剂体系改成正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为9:1:10)，其余同实施例1。
对比例1-2、将实施例1中的正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)组成的两相溶剂体系改成正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:2:5)，其余同实施例1。
对比例2、将实施例1中的正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)组成的两相溶剂体系改成正己烷、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)，其余同实施例1。
对比例3、将实施例1中的正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)组成的两相溶剂体系改成正丁醇、乙酸乙酯和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)，其余同实施例1。
对比例4、将实施例1中的正丁醇、甲醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)组成的两相溶剂体系改成正丁醇、乙醇和0.2％甲酸水溶液(体积比为5:1:5)，其余同实施例1。
对比例5-1、将“0.2％甲酸水溶液”改成“0.5％甲酸水溶液”，其余同实施例1。
对比例5-2、将“0.2％甲酸水溶液”改成“水”，其余同实施例1。
对比例6-1、一种从加巴喷丁原料药中分离制备杂质D的方法：
将实施例1步骤2)中流动相的注入流速由5.0ml/min改成7.0ml/min，其余等同于实施例1。
对比例6-2、一种从加巴喷丁原料药中分离制备杂质D的方法：
将实施例1步骤2)中流动相的注入流速由5.0ml/min改成3.0ml/min，其余等同于实施例1。
上述所有对比例所分离制备的杂质D的纯度和回收率如表2所述。
表2
杂质D纯度
回收率
对比例1-1
77.3％
69.9％
对比例1-2
82.6％
79.5％
对比例2
64.2％
53.1％
对比例3
70.5％
60.1％
对比例4
89.4％
87.7％
对比例5-1
90.5％
82.3％
对比例5-2
72.6％
67.9％
对比例6-1
69.4％
55.2％
对比例6-2
58.1％
40.3％
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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