一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法
阅读说明：本技术 一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法 (Preparation method of high specific activity recombinant human follicle stimulating hormone ) 是由 曹玉锋 常东英 陈子杨 张健锋 刘国瑞 贾媛 李铮 迟祥 孟多佳 唐剑光 王金敏 于 2021-01-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及促卵泡激素的技术领域,特别是涉及一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法,包括以下步骤：(1)取rhFSH/CHO-S工作库细胞株接种于装有CD Forti CHO培养基(含8mM谷氨酰胺)的摇瓶中进行复苏,振摇培养2-4天,待活细胞浓度达到2-3×106/ml,活度不低于80%时,按2-4×105/ml的密度转接下一级摇瓶,按同样方法逐级放大完成种子液制备；(2)将上述所述种子液按活细胞4-6×105/ml的密度接种生物反应器,溶氧为30-60%,转速为180-220rpm(7L生物反应器)、100-140rpm(14L生物反应器),基础通气速率为0.001-0.01vvm,分别于接种后第4、6、8、10天按2-5%比例(V/V)流加CellTurbo Feed2补料培养基。(The invention relates to the technical field of follicle stimulating hormone, in particular to a preparation method of high specific activity recombinant human follicle stimulating hormone, which comprises the following steps: (1) inoculating rhFSH/CHO-S working library cell strain into a shake flask filled with a CD Forti CHO medium (containing 8mM glutamine) for resuscitation, carrying out shake culture for 2-4 days, transferring to the next-stage shake flask according to the density of 2-4X 105/ml when the concentration of living cells reaches 2-3X 106/ml and the activity is not lower than 80%, and amplifying step by step according to the same method to complete the preparation of seed liquid; (2) inoculating the seed liquid into a bioreactor according to the density of 4-6 multiplied by 105/ml of living cells, wherein the dissolved oxygen is 30-60%, the rotating speed is 180-.)
技术领域
本发明涉及促卵泡激素的技术领域，特别是涉及一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法。
背景技术
促卵泡激素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH）是一种由脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白类促性腺激素，是调控哺乳动物生长、性成熟和繁殖的核心激素。FSH在治疗排卵障碍、促使卵泡正常生长、成熟和性腺甾体类固醇的产生、激活和保持正常精子的数目和质量、体外受精和胚胎移植助孕技术上有重要意义。
目前商品化的FSH制剂主要有尿源FSH（uFSH）和重组人促卵泡素（rhFSH），其中rhFSH多以CHO细胞为表达宿主，以外分泌形式进行表达，具有与天然FSH相似的糖基化构型，产品具有比活性高，质量可控及易于产业化的优势。FSH结构复杂含α和β两个亚基，分别含5对和6对链内二硫键，并各含2个N糖糖基化位点。糖类是FSH不可或缺的重要组分，分布于糖链末端的唾液酸可直接影响其活性、代谢及半衰期等，糖基化侧链数目及唾液酸含量对FSH的生物活性和半衰期具有重要作用，而产品本身的结构性质决定了更加严苛的细胞培养和纯化工艺。基于传统含血清培养基的贴壁细胞培养方式，具有潜在的动物源性安全性风险，批间差大，成本高，且不利于产业化等弊端。近年来发展起来的哺乳动物细胞无血清全悬浮培养工艺采用了无血清培养基尤其是化学成分限定培养基（Chemical DefinedMedia, CDM），具有成分明确，无动物源成份，安全性高，易于放大等优势。此外，如何从培养的细胞培养液中高效获得高纯度、高比活性的rhFSH也是制约本品产业化的关键性技术难题。
目前上市的FSH制剂根据其来源及制备工艺主要分为以下两类：第一类是从绝经后妇女的尿中提取出来的尿源FSH（uFSH），但此种促卵泡激素含有其它人源蛋白的污染，批间糖基结构存在差异，尿源需求量巨大，无法满足快速增长的市场需求。另一类是以CHO细胞为代表的哺乳动物细胞表达的重组人促卵泡素（rhFSH），rhFSH不仅以外分泌形式表达，且具有与天然FSH相似的翻译后糖基化修饰特性，能产生高生物活性的FSH，因此，该类FSH具有安全性高、比活性好、质量可控且易于产业化的优势。传统的含血清培养方式具有批间差异大、安全性风险高，且只能贴壁培养不易于放大等劣势。相比传统的含血清贴壁培养工艺，无血清全悬浮培养工艺具有下述优势：（1）克服了血清批次间差异，使细胞培养更加稳定；（2）去除血清、胰酶等动物源性成分，降低由其带来的病毒或支原体等动物源性污染；（3）CDM培养基不含蛋白等大分子，不含蛋白水解物等混合物，利于下游纯化设计；（4）培养基成分明确，有利于对细胞的生长、代谢、基因调控等方面进行研究。无血清悬浮悬浮培养技术因其易于在生物反应器培养，自动化程度高，便于在线或离线观察细胞数量、状态，工艺简单可控易于放大；无需传统贴壁细胞胰酶消化等步骤，操作环节少，污染率低，进而使得产品更安全、质量更稳定。此外，纯化工艺也成为工业生产的限速步骤，如何从细胞培养液中高效获得rhFSH纯品，并保证其结构正确、比活性高是另一关键性技术难题。目前rhFSH纯化工艺中多含有金属螯合或染料亲和层析步骤，但基于金属螯合亲和层析工艺对目标蛋白活性具有潜在的不良影响，而染料亲和层析则存在亲和特异性差等问题。
最初，rhFSH采用含血清的培养基进行转瓶或者微载体贴壁培养，基于传统含血清培养基的贴壁细胞培养方式，例如转瓶培养、细胞工厂培养以及基于片状载体或微载体的培养工艺，因含有血清等动物源成份，安全性风险高，血清批间差异大，成本居高不下，不利于工业化放大，很大程度上限制了动物细胞培养工艺的发展，因此，开发一种哺乳动物细胞无血清全悬浮培养工艺取代传统培养工艺尤为重要。与含有血清的细胞培养基相比，无血清培养基尤其是CDM，具有成分明确，批次间差异小，无动物源成份，安全性高，易于生物反应器培养，自动化程度高，方便细胞取样、观察及计数，工艺简单可控、易于放大，无需传统贴壁细胞胰酶消化等步骤，操作环节少，污染率低。近年来，石欣欣等报道了利用细胞生物反应器大规模培养CHO细胞表达rhFSH的工艺，该工艺采用了无血清、微载体灌流培养技术，该工艺属于基于贴壁细胞的培养技术，而非全悬浮培养，表达量约为20mg/L。专利CN105462909 B中报道了一种高效表达人促卵泡激素的CHO细胞培养方法，从种子复苏到细胞培养，全程采用商业化无血清和补料培养基培养，获得了高密度、高活度的细胞，批产量达到40mg/L。专利CN 110042137 A中报道了另外一种高密度灌注培养重组CHO细胞生产人促卵泡激素的方法，该工艺采用了无血清、无蛋白培养基，培养时间从接种反应器到整个灌注培养结束维持35-52天不等，表达量在15mg-25mg/L不等，单批次蛋白收获量在30g以上，收率虽然可观，但过长的培养时间也大幅提高了染菌风险，培养、纯化及储存等生产成本较高。
此外，纯化工艺也成为rhFSH工业生产的限速步骤，如何从细胞培养液中高效获得rhFSH纯品，并保证其结构、功能不受影响是另一关键性技术难题。专利CN102295695 A报道了超滤浓缩、阴离子交换、疏水、阴离子交换、分子排阻、阴离子交换的纯化工艺路线，工艺步骤过于繁琐、收率较低。专利 CN100554277C 中提到利用阴离子交换层析和固定金属离子层析（即金属螯合层析）及疏水层析的工艺对FSH进行了纯化，但基于金属螯合亲和层析工艺对目标蛋白活性具有潜在的不良影响。专利CN 103570820 A和CN 102448979 A分别公布了基于Blue Sepharose CL-6B层析介质和Cibacron Blue F3G-A 层析介质的染料亲和层析工艺，具有成本较低、工艺过程易于控制和放大的优势，而染料亲和层析存在亲和特异性差，亲和效率较低等问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法。
本发明的一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法，包括以下步骤：
（1）取rhFSH/CHO-S工作库细胞株接种于装有CD Forti CHO培养基（含8mM谷氨酰胺）的摇瓶中进行复苏，振摇培养2-4天，待活细胞浓度达到2-3×106/ml，活度不低于80%时，按2-4×105/ml的密度转接下一级摇瓶，按同样方法逐级放大完成种子液制备，保证上生物反应器前细胞密度不低于3×106/ml，活度不低于95%；
（2）将上述所述种子液按活细胞4-6×105/ml的密度接种生物反应器，溶氧为30-60%，转速为180-220rpm(7L生物反应器)、100-140rpm(14L生物反应器)，基础通气速率为0.001-0.01vvm，分别于接种后第4、6、8、10天按2-5%比例（V/V）流加CellTurbo Feed2补料培养基，同时适量流加葡萄糖和谷氨酰胺，控制葡萄糖浓度2-4g/L，控制谷氨酰胺浓度2-4mM，定时监测细胞密度及活度，监测葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸及氨的浓度变化；接种后细胞增殖阶段控制培养温度为36-37℃，待活细胞密度达到1.5-1.7×107/ml时，降低培养温度至30-33℃，进入产物表达累积阶段，待细胞活度降至75-85%，终止培养，收罐；定量ELISA方法检测rhFSH终末表达量不低于200mg/L；
（3）上述细胞培养液进行澄清，经5KD膜包超滤浓缩5-10倍，同时置换为20mM PBS缓冲液（pH5.0-5.5），经0.45μm膜过滤后用于后续层析纯化；
（4）DEAE sepharoseFF层析：用20 mM PBS（pH5.0-5.5）平衡DEAE层析柱3-5倍柱体积（CV），按2-3个CV上样，继续用20 mM PBS（pH5.0-5.5）平衡至基线走平，收集2号流穿峰用于后续纯化；
（5）亲和层析：CaptureSelect FSH亲和柱用20 mM PBS（pH 7.2-7.4）平衡液平衡5-10个CV，取DEAE sepharoseFF流穿样品调pH值至7.2-7.4上样3-5个CV，继续平衡至基线走平，经20 mM PBS 2M MgCl2（pH 7.2-7.4）洗脱液洗脱3-5个CV，收集目的洗脱锋用于后续纯化；
（6）疏水作用层析：phenyl sepharose 6FF层析柱用2M NaCl溶液平衡层析介质3-5个CV，亲和层析洗脱样品经4M NaCl溶液按1:1等体积混合，按0.5-2个CV上样，继续平衡3-5个CV至基线走平，用生理盐水洗脱，收集目的洗脱峰，使用0.22μm滤膜除菌，即为原液，-20℃冻存备用；
（7）上述rhFSH原液经全面检定及结构确证显示，蛋白结构、理化性质、生物学活性及杂质残留等均达标，rhFSH纯品经大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)检测，比活不低于10000IU/mg。
本发明的一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法，所述步骤（3）澄清方法为分段离心法（4000rpm/8000rpm）或深层过滤法(5μm/0.2μm)。
本发明的一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法，所述步骤（1）中振摇条件为37℃，120rpm，8%CO2条件下。
本发明的一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法，所述步骤（2）中接种至生物反应器后，CO2/NaHCO3控制pH值在7.0±0.2。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明采用rhFSH/CHO-S工程细胞株为自主构建的稳定高产细胞系，将人促卵泡激素Fα及Fβ基因克隆入pCHO1.0高表达载体，转染具有自主产权的CHO-S悬浮细胞，筛选获得稳定高产细胞系；该细胞株适于无血清CD培养基悬浮培养工艺，具有表达量高、稳定性好、比活性高、易于产业化的优势，具有较高的商用价值；
本发明提供了一种高效表达人促卵泡激素rhFSH/CHO-S的培养方法，筛选到适合该细胞系的基础培养基CD Forti CHO与补料培养基CellTurbo Feed 2组合，建立了两阶段全悬浮培养工艺，细胞增殖阶段控制温度为36-37℃，产物表达阶段控制温度30-33℃，同时控制适当的pH、溶氧、转速、通气速度，适量流加培养基，获得理想的细胞密度及表达量；该工艺全程采用无血清培养基，由于不含血清，无动物源成份，克服了血清添加导致的外源因子污染及血清批间差而导致的产品质量风险；另外，全悬浮培养技术因其易于在生物反应器培养放大，自动化程度高，克服了传统贴壁细胞操作环节繁琐，污染率高等问题，无血清悬浮培养工艺作为先进的细胞培养工艺，已逐渐成为生物制药领域细胞培养的主流趋势；
本发明建立了一种高效的rhFSH纯化工艺，该纯化工艺首先对细胞培养上清液进行澄清、超滤浓缩置换，再依次上离子交换层析柱、亲和层析柱及疏水层析柱，该工艺具有工艺简单、收率高、易于放大的优势；基于驼源VHH纳米抗体的CaptureSelect FSH亲和填料的层析工艺具有特异性强、亲和效率高、载量高的优点，该填料具有稳定性好、选择性强的特点，只选择性结合rhFSH完整分子，而不结合游离的α和β单个亚基，因此所得纯化产物比活性更高，利于产业化应用。
附图说明
图1是本发明的流程图；
图2是37℃ →33 ℃两阶段培养细胞活度及细胞数变化趋势图；
图3是37℃ →33 ℃两阶段培养rhFSH表达量变化趋势图；
图4是DEAE sepharoseFF层析图；
图5是CaptureSelect FSH亲和层析图；
图6是phenyl sepharose 6FF疏水层析图；
图7是SDS-PAGE法检测rhFSH纯度图；
图8是平板聚焦电泳法测定rhFSH等电点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
（1）从液氮罐取rhFSH/CHO-S工作种子库细胞1支，于37℃水浴快速融化后，尽快将细胞悬液重悬于含有25ml 37℃预热的CD Forti CHO培养基（含8mM谷氨酰胺）的125 ml三角摇瓶中，120rpm，37℃，8％CO2振摇培养3-4天，检测细胞密度及活度，按3.0×105/ml连续传代，按照125ml摇瓶、500ml摇瓶、1000ml摇瓶的顺序逐级放大，扩增3-4代，按照所上生物反应器规模确定摇瓶数量，完成种子液制备，保证上生物反应器前细胞密度不低于3×106/ml，活度不低于95%；
（2）将2L CD Forti CHO培养基注入预先湿热高压灭菌的7L生物反应器中，加入终浓度分别为8mM的谷氨酰胺，1.0g/L的F68和1%（V/V）的抗结团剂，将前述细胞种子液按活细胞密度4.6×105/ml的接种于培养基中，采用微泡气体分布器，调节基础通气速率为0.001vvm，转速200rpm，37℃，CO2/NaHCO3控制pH值7.0±0.2，分别于第4、6、8、10天按2-5%比例（V/V）流加CellTurbo Feed2补料培养基，同时流加葡萄糖及谷氨酰胺，控制葡萄糖浓度2-4g/L，谷氨酰胺浓度2-4mM，实时监测细胞密度及活度，监测葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸及氨等生化参数；接种后细胞增殖阶段控制培养温度为37℃，待活细胞密度达到1.7×107/ml时，降低培养温度至33℃，进入产物高表达阶段，待细胞活度降至80%，终止培养，收罐；采用DRG公司的FSH ELISA定量检测试剂盒方法检测rhFSH的最终表达量为208.3mg/L；
（3）上述细胞培养液2.2L经分段离心法进行澄清：4000 rpm离心30 min，吸取上清再经8000 rpm离心30min，上清液经5KD膜包用20mM PBS缓冲液（pH5.0）超滤浓缩置换至400ml，经0.45μm膜过滤，用于后续层析纯化；
（4）DEAE sepharoseFF层析：装200ml DEAE sepharoseFF层析柱，用20 mM PBS（pH5.0）平衡DEAE层析柱5个CV，上述400ml超滤浓缩液按150cm/h上样，继续用20 mM PBS（pH5.0）平衡，收集2号流穿峰约200ml，用于后续亲和层析纯化；
（5）亲和层析：装50ml CaptureSelect FSH亲和柱，用20 mM PBS（pH 7.2）平衡液平衡5个CV，取DEAE sepharoseFF流穿样品200ml，经1N的NaOH调pH至7.2按200cm/h上样，继续经平衡液平衡5个CV，经20 mM PBS-2M MgCl2（pH 7.2）洗脱液洗脱，收集目的洗脱锋约90ml，用于后续纯化；
（6）疏水作用层析：装phenyl sepharose 6FF层析柱170ml，用2M NaCl溶液平衡层析介质5个CV，亲和层析洗脱样品经4M NaCl溶液按1:1等体积混合，按200cm/h的流速上样90ml，继续平衡3-5个CV至基线走平，用生理盐水洗脱，收集目的洗脱峰，使用0.22μm滤膜除菌，即为原液，-20℃冻存备用；
（7）上述rhFSH原液经全面检定及结构确证显示，蛋白结构、理化性质、生物学活性及杂质残留等均达标，所述rhFSH纯品经大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)检测比活不低于10000IU/mg，达到国内外先进水平。
实施例2
本实施例提供了一种高比活人促卵泡激素的制备方法，步骤如下：
（1）从液氮罐取rhFSH/CHO-S工作种子库细胞1支，于37℃水浴快速融化后，尽快将细胞悬液重悬于含有25ml 37℃预热的CD Forti CHO培养基（含8mM谷氨酰胺）的125 ml三角摇瓶中，120rpm，37℃，8％CO2振摇培养3-4天，检测细胞密度及活度，按3.0×105/ml连续传代，按照125ml摇瓶、500ml摇瓶、1000ml摇瓶的顺序逐级放大，扩增3-4代，按照所上生物反应器规模确定摇瓶数量，完成种子液制备，保证上生物反应器前细胞密度不低于3×106/ml，活度不低于95%；
（2）将8L CD Forti CHO培养基注入预先湿热高压灭菌的14L生物反应器中，加入终浓度分别为8mM的谷氨酰胺，1.0g/L的F68和0.1%（V/V）的抗结团剂，将前述细胞种子液按活细胞密度5.4×105/ml的接种于培养基中，采用大泡气体分布器，调节基础通气速率为0.01vvm，转速110rpm，37℃，CO2/NaHCO3控制pH值7.0±0.2，分别于第4、6、8、10天按2-5%比例（V/V）流加CellTurbo Feed2补料培养基，同时流加葡萄糖及谷氨酰胺，控制葡萄糖浓度2-4g/L，谷氨酰胺浓度2-4mM，实时监测细胞密度及活度，监测葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸及氨等生化参数；接种后细胞增殖阶段控制培养温度为36℃，待活细胞密度达到1.5×107/ml时，降低培养温度至31℃，进入产物高表达阶段，待细胞活度降至77%，终止培养，收罐；采用DRG公司的FSH ELISA定量检测试剂盒方法检测rhFSH的最终表达量为226.2mg/L；
（3）上述细胞培养液8.5L采用一次性深层过滤膜包(5μm/0.2μm)进行澄清，上清液经5KD膜包用20mM PBS缓冲液（pH5.2）超滤浓缩置换至1.1L，经0.45μm膜过滤，用于后续层析纯化；
（4）DEAE sepharoseFF层析：装600ml DEAE sepharoseFF层析柱，用20 mM PBS（pH5.2）平衡DEAE层析柱5个CV，取上述超滤浓缩液1L按150cm/h上样，继续用20 mM PBS（pH5.2）平衡，收集2号流穿峰约650ml，用于后续亲和层析纯化；
（5）亲和层析：装150ml CaptureSelect FSH亲和柱，用20 mM PBS（pH 7.2）平衡液平衡5个CV，取DEAE sepharoseFF流穿样品600ml，经1N的NaOH调pH至7.2按200cm/h上样，继续经平衡液平衡5个CV，经20 mM PBS-2M MgCl2（pH 7.2）洗脱液洗脱，收集目的洗脱锋约250ml，用于后续纯化；
（6）疏水作用层析：装phenyl sepharose 6FF层析柱400ml，用2M NaCl溶液平衡层析介质5个CV，亲和层析洗脱样品经4M NaCl溶液按1:1等体积混合，按200cm/h的流速上样250ml，继续平衡3-5个CV至基线走平，用生理盐水洗脱，收集目的洗脱峰，使用0.22μm滤膜除菌，即为原液，-20℃冻存备用；
（7）上述rhFSH原液经全面检定及结构确证显示，蛋白结构、理化性质、生物学活性及杂质残留等均达标，所述rhFSH纯品经大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)检测比活不低于10000IU/mg，达到国内外先进水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
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