一种高纯度重组促***纯化方法
阅读说明：本技术 一种高纯度重组促***纯化方法 (method for purifying high-purity recombinant follicle stimulating hormone ) 是由 彭红卫 张玉晶 张磊 王冲 叶凡 俞峻红 赵家跟 李晓鹏 俞亚波 于 2019-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高纯度重组促卵泡刺激素的纯化方法。具体地,包括步骤：(a)提供一含有重组促卵泡激素的原料液；(b)对所述原料液依次进行：(b1)硫酸铵沉淀；(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；(b3)低PH孵育灭活病毒；和(b4)反相色谱层析(RPC)；其中,步骤(b1)、(b2)、(b3)和(b4)不可以以任意次序进行。本发明的重组促卵泡刺激素相比已有的制备方法,简单易操作,并且用本发明的方法得到的重组FSH纯度可高达99.5％w/w,比活性高达16000IU/mg。(the invention provides a method for purifying high-purity recombinant follicle stimulating hormone. Specifically, the method comprises the following steps: (a) providing a raw material solution containing recombinant follicle stimulating hormone; (b) sequentially carrying out the following steps on the raw material liquid: (b1) ammonium sulfate precipitation; (b2) hydrophobic Interaction Chromatography (HIC); (b3) incubating and inactivating the virus at low pH; and (b4) Reverse Phase Chromatography (RPC); wherein steps (b1), (b2), (b3), and (b4) may not be performed in any order. Compared with the existing preparation method, the recombinant follicle stimulating hormone of the invention is simple and easy to operate, and the purity of the recombinant FSH obtained by the method of the invention can reach 99.5% w/w, and the specific activity reaches 16000 IU/mg.)
技术领域
本发明涉及重组促***的纯化方法，尤其涉及一种高纯度重组促***纯化方法。
背景技术
促***(又称***，Follicle Stimulating Hormone，FSH)是一种异源二聚体糖蛋白，分子量约为31KD，由非共价结合的α亚基和β亚基组成。其中α亚基相对分子质量约14KD；β亚基相对分子质量约17KD，是由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类***,受下丘脑促性腺释放激素控制。对于女性，FSH能促进卵泡颗粒层细胞增生分化，其浓度对卵泡发育的启动和周期，及随后使卵泡达到成熟的时间和卵泡数目均至关重要。对于男性而言，FSH能与受LH(***)控制的***结合，作用于睾丸曲细精管，从而激活并保持正常***的数目和质量。FSH在***不育的诊断和治疗中都是有着重要作用的生物活性分子，在促使卵泡正常生长、成熟和性腺甾体类固醇的产生中均扮演着不可或缺的角色。
由于FSH合成和分泌不足所致的FSH浓度过低是女性和男性不育的主要原因。在女性中，这一状态的特征表现为不***或***异常；在男性中，可能会由于没有足够量的有活力的***产生而导致不育。在***不育的诊断和治疗中，FSH是发挥着重要作用的生物活性分子，在人类辅助生殖技术中FSH扮演着重要的角色，是目前市场上常见的用于治疗男女***症的主要药物之一。
早期取自绝经期妇女尿液制备的尿促性素(亦称为绝经期尿***，绝经促性素)，含促卵泡素(FSH)与***(LH)，存在着活性低、成本高、污染大及潜在病原微生物感染等缺点。应用DNA重组技术生产的重组人***(rhFSH)具有标准化的分子量和生物学活性，避免了由尿源提取的FSH在糖基结构上的差异而造成的FSH异构体生物活性上的差异，可以提高产品的质量和产量，同时rhFSH还具有优良的安全特性。
目前，利用DNA重组技术生产的重组人***(rhFSH)已问世，最早进入商业产品的是瑞士雪兰诺公司的果纳芬GONAL-f○R和荷兰欧加农公司的普丽康Puregon○R。果纳芬和普丽康属于重组人促卵泡生成素，其中促卵泡生成素纯度超过99％，作用稳定，因此具有很大优势。目前中国市场上主要有三种重组人***和(长春金赛药业股份有限公司生产)。国内的制药公司生产重组FSH的产品，纯度均不超过99％。因FSH在治疗***不育，促使卵泡正常生长、成熟和性腺甾体类固醇的产生中所扮演的重要作用，提供高纯度和高比活的重组FSH是有希望的。高纯化的FSH制剂可以通过皮下注射，患者可以自行给药，因此增加了患者的舒适度和依从性。
然而，由于技术力量和经费的原因，重组FSH产品明显比尿源FSH产品更昂贵，一般的患者经济上难以负担。
因此，本领域迫切需要开发一种低成本、易操作、所获得FSH的纯度高、生物活性好的FSH纯化技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种低成本、易操作、所获得FSH的纯度高、生物活性好的FSH纯化技术。
在本发明中，提供了一种高纯度重组促***纯化方法，其包括步骤：
(a)提供一含有重组促卵泡激素的原料液；
(b)对所述原料液依次进行：
(b1)硫酸铵沉淀；
(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；
(b3)低PH孵育灭活病毒；和
(b4)反相色谱层析(RPC)；
其中，步骤(b1)、(b2)、(b3)和(b4)不可以以任意次序进行。
在另一优选例中，所述方法不包括阳离子交换层析、阴离子交换层析。
在另一优选例中，所述的原料液为发酵产物。
在另一优选例中，所述的发酵是在真核细胞，较佳地哺乳动物细胞，更佳地CHO细胞中进行的发酵。
在另一优选例中，所述的促卵泡激素为人促卵泡激素。
在另一优选例中，所述的促卵泡激素包括野生型和突变型促卵泡激素。
在另一优选例中，所述的促卵泡激素由α亚基和β亚基构成。
在另一优选例中，所述的α亚基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，而β亚基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重组促***包括PEG-rh FSH、rh FSH-Fc融合蛋白、rh FSH-CTP融合蛋白、包含rh FSH的双功能抗体、包含rh FSH的多功能抗体、包含rh FSH的偶联药物、rhFSH糖基化改造物，或其组合。
在另一优选例中，所述的硫酸铵沉淀的条件包括：pH为7.1-8.5，较佳地7.2至8.0，最佳地7.3至7.6。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，用无机酸和/或碱进行pH调节。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，用氨水和/或硫酸进行pH调节。
在另一优选例中，所述的硫酸铵沉淀的条件包括：硫酸铵浓度40％-60％，较佳地42％-49％，更佳地43％-47％,最佳地44％-45％。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，疏水相互作用色谱法使用的选自下组的层析介质：Capto Phenyl(HS)、Capto Butyl、Butyl Sepharose 4FF、Butyl Sepharose4FF(HS)、Octyl Sepharose 4FF、Phenyl Sepharose 6FF(LS)、Phenyl Sepharose 6FF(HS)、PhenylSepharose Big Beads、Phenyl Sepharose 6FF、Phenyl Sepharose HP、Butyl SepharoseHP、Butyl Sepharose 4B、Octyl Sepharose CL-4B、Phenyl Sepharose CL-4B，或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b3)中，低PH孵育灭活病毒的条件包括：pH2.5-4.5，较佳地pH3-4。
在另一优选例中，在步骤(b3)中，用无机酸和/或有机酸进行pH调节。
在另一优选例中，在步骤(b3)中，用柠檬酸进行pH调节。
在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)使用选自下组的基质填料：硅胶、氧化铝、氧化锆等作基质材料，包覆无机基质填料的高聚物如聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚环氧乙烷、聚硅氧烷、琼脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷、气相沉积碳、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)使用的基质填料为聚苯乙烯/二乙烯苯。
在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)配体聚苯乙烯类树脂。
在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)缓冲溶液有机溶剂是乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮。
在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)缓冲溶液有机溶剂是异丙醇。
在另一优选例中，在步骤(b4)中，反相色谱层析(RPC)缓冲溶液pH在7至8，较佳的7.2至7.8，最佳地7.4-7.6。
在另一优选例中，所获得的重组人促卵泡激素的纯度大于，更优选>99.90％w/w，甚至更优选>99.99％w/w。
在另一优选例中，所述方法进一步包括(b5)反相色谱层析(RPC)。
在另一优选例中，所述方法的步骤(b)包括步骤：
(b1)硫酸铵沉淀；
(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；
(b3)低PH孵育灭活病毒；和
(b4)反相色谱层析(RPC)。
(b5)反相色谱层析(RPC)。
在另一优选例中，所述方法的步骤(b)包括步骤：
(b1)硫酸铵沉淀；
(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；
(b3)低PH孵育灭活病毒；和
(b4)反相色谱层析(RPC)。
(b5)凝胶过滤层析(GFC)。
在另一优选例中，所述方法的步骤(b)包括步骤：
(b1)硫酸铵沉淀；
(b2)疏水相互作用色谱法(HIC)；
(b3)低PH孵育灭活病毒；和
(b3a)疏水相互作用色谱法(HIC)
(b4)反相色谱层析(RPC)。
(b5)凝胶过滤层析(GFC)。
在另一优选例中，所述方法进一步包括一个或多个超滤和/或纳米过滤步骤。
在另一优选例中，所述方法不进行免疫亲和纯化。
在另一优选例中，所述方法不进行凝集素亲和纯化。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在实施例1的疏水层析步骤中蛋白洗脱的色谱图。
其中显示了280nm的紫外吸收图(UV280)。
图2显示了在实施例1的疏水层析步骤中，疏水层析各组分的电泳图(非还原型SDS-PAGE，分离胶浓度15％)。
其中，M为分子量标准品(Thermo Scientific，即Fermatas，Unstained ProteinMW Marker；分子量依次为116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4KD)；1为HIC上样样品；2为HIC流穿组分(FT)；3为HIC45％B洗脱下组分；4为HIC100％B洗脱下组分。
图3显示了在实施例2的反相层析步骤中蛋白洗脱的色谱图。
其中显示了280nm的紫外吸收图(UV280)。
图4显示了在实施例2的反相层析步骤中，反相层析各组分的电泳图(非还原型SDS-PAGE，分离胶浓度15％)。
其中，M为分子量标准品(Thermo Scientific，即Fermatas，Unstained ProteinMW Marker；分子量依次为116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4KD)；1为硫酸铵处理后的沉淀组分(45％饱和度)；2为RPC上样前组分(HIC100％B洗脱下组分)；3为HIC NaOH洗脱下组分；4为RPC20％B洗脱下组分；5为RPC40％B洗脱下组分；6为RPC60％B洗脱下组分；7为RPC100％B洗脱下组分。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种高纯度重组促***纯化方法。具体的，本发明方法中，将培养上清液依次经超滤、硫酸铵沉淀、疏水层析、低pH灭活病毒、反相层析、分子排阻层析、纳米膜过滤纯化。实验数据表明，本发明中获得的最终产物正确，FSH的生物活性高、纯度高。在此基础上完成了本发明。
本发明的纯化方法
本发明的目的是提供纯化重组FSH或者重组FSH变体的高纯度纯化过程，以其经济性、高纯度和高比活产生重组FSH或者重组FSH变体，比如人重组FSH或者人重组FSH变体。
在一个优选的实施方式中，本发明重组FSH具有序列如SEQ ID NO:1所示的FSHα亚基和序列如SEQ ID NO:2所示的FSHβ亚基。
MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHSAPDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS(SEQ ID NO:1)
MKTLQFFFLFCCWKAICCNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE*(SEQ ID NO:2)
优选地，所述FSHα亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，FSHβ亚基基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
atggattactacagaaaatatgcagctatctttctggtcacattgtcggtgtttctgcatgttctccattccgctcctgatgtgcaggattgcccagaatgcacgctacaggaaaacccattcttctcccagccgggtgccccaatacttcagtgcatgggctgctgcttctctagagcatatcccactccactaaggtccaagaagacgatgttggtccaaaagaacgtcacctcagagtccacttgctgtgtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggggggtttcaaagtggagaaccacacggcgtgccactgcagtacttgttattatcacaaatcttaa(SEQ ID NO:3)
atgaagacactccagtttttcttccttttctgttgctggaaagcaatctgctgcaatagctgtgagctgaccaacatcaccattgcaatagagaaagaagaatgtcgtttctgcataagcatcaacaccacttggtgtgctggctactgctacaccagggatctggtgtataaggacccagccaggcccaaaatccagaaaacatgtaccttcaaggaactggtatacgaaacagtgagagtgcccggctgtgctcaccatgcagattccttgtatacatacccagtggccacccagtgtcactgtggcaagtgtgacagcgacagcactgattgtactgtgcgaggcctggggcccagctactgctcctttggtgaaatgaaagaataa(SEQ ID NO:4)
相应地，本发明涉及重组FSH或者重组FSH变体的高纯度纯化方法，包括对重组FSH或者重组FSH变体的液体进行下述步骤：
(1)硫酸铵沉淀；
(2)疏水相互作用色谱法(HIC)；
(3)低PH孵育灭活病毒；和
(4)反相色谱层析(RPC)。
步骤(1)、(2)、(3)和(4)可以以任意次序进行。
其中所述方法避免阳离子交换层析和阴离子交换层析。
优选的是，硫酸铵沉淀或疏水相互作用色谱法作为四个步骤中的第一步进行。在更优选实施方式中，硫酸铵沉淀法作为步骤中的第一步进行。
纯化过程可以任选地包含额外的步骤，例如亲和色谱法比如染料亲和色谱法或过硼酸盐亲和色谱法。和/或第二次过滤比如透析过滤，超滤或纳米过滤。
在优选实施方式中，本发明过程包凝胶过滤层析(SEC)作为第(5)步骤。
在优选实施方式中，步骤(1)、(2)、(3)和(4)以这样的次序进行
(1)硫酸铵沉淀；
(2)疏水相互作用色谱法(HIC)；
(3)低PH孵育灭活病毒；和
(4)反相色谱层析(RPC)。
优选硫酸铵沉淀作为第一步骤进行，原因是该实施方式使得可以选择将相当"粗制的"重组FSH产物直接进行沉淀上，任选地描述如下的在澄清样品获得清洁(例如过滤)、浓缩和/或缓冲剂置换步骤之后。该实施方式提供的优点是，可以彻底去除可能残留的核酸、内毒素、病毒、蛋白和其它杂质，另外，澄清后的样品可将收获液浓缩15倍以上，利于硫酸铵沉淀。总体来说，用硫酸铵沉淀作为第一步骤减少了在开始色谱纯化之前所必需的制备步骤数，并且允许使用高量的样品溶液。
在又一优选实施方式中，在低PH孵育灭活病毒(3)之后且在反相色谱层析(RPC)(4)之前进行第二次疏水相互作用色谱法(HIC)。如上文描述，除了所述步骤以及在所述步骤之间还可以进行额外的步骤。
在又一优选实施方式中，在反相色谱层析(RPC)(4)之后进行第三次疏水相互作用色谱法(HIC)。如上文描述，除了所述步骤以及在所述步骤之间还可以进行额外的步骤。
在又一优选实施方式中，在反相色谱层析(RPC)(4)之后进行凝胶过滤层析(GFC)。如上文描述，除了所述步骤以及在所述步骤之间还可以进行额外的步骤。
在又一优选实施方式中，在反相色谱层析(RPC)(4)之后进行反相色谱层析(RPC)。如上文描述，除了所述步骤以及在所述步骤之间还可以进行额外的步骤。
本发明的纯化方法提供高纯度的重组FSH和重组FSH变体，其可以然后配制为药物组合物。纯度通常高于99.50％w/w，优选>99.80％w/w，更优选>99.90％w/w，甚至更优选>99.99％w/w，按总蛋白质计。另外，本发明的纯化方法可容易地放大，甚至达到工业规模，而不需显著改变纯化条件。
形成根据本发明的纯化过程的原料的重组FSH和重组FSH变体可以得自天然来源的液体或者通过重组技术比如在含有重组FSH和重组FSH变体的细胞培养收获物中得到。一般地，在进行第一步骤之前，得自天然来源或细胞收获物、优选细胞收获物的原料首先进行清洁(例如过滤)，然后浓缩和/或缓冲剂置换步骤之后。
在硫酸铵沉淀步骤中，使用一般可商购的硫酸铵，优选达到国家标准的商用分析纯产品。
在色谱法步骤中，使用一般可商购的树脂填料，优选聚合物类树脂或琼胶糖类树脂。
本发明纯化过程的步骤在下文更详细地描述。
硫酸铵沉淀(1)步骤
本发明涉及硫酸铵沉淀(1)步骤。在优选实施方式中，特别是在重组FSH的情况下，将硫酸铵沉淀作第一步骤，重组FSH具有高度的亲水性，在水溶液中有较高的溶解度，分子间也不易产生聚集。要使它们沉淀下来，就需要使用优选较高浓度的硫酸铵。优选合适较高浓度的硫酸铵可以使更多的杂蛋白沉淀下来，又可以使需要的重组FSH不被沉淀。
硫酸铵沉淀一般这样进行：直接加入硫酸铵固体或者硫酸铵溶液，优选硫酸铵饱和溶液，更加优选100％的硫酸铵饱和溶液。
硫酸铵浓度40％-60％，优选硫酸铵浓度42％-49％，更加优选硫酸铵浓度43％-47％,更加优选或约于44％-45％。
优选使用时根据使用浓度换算成需要加入饱和溶液的量，缓慢加入搅拌着的样品溶液中。
硫酸铵沉淀优选通过这样的溶液进行，其溶液弱碱性pH，例如为或约为pH7.1至8.5，更优选为或约为7.2至8.0，更优选为或约为7.3至7.6，在优选实施方式中，调节pH调节剂为无机酸或碱，更加优选的是氨水或硫酸。
优选，在步骤(1)之后离心或超滤去除沉淀物。
优选，在步骤(1)之后不进行病毒灭活步骤。
疏水相互作用色谱法(HIC)(2)步骤。
本发明过程也涉及疏水相互作用色谱法(2)步骤。疏水相互作用色谱法通常通过平衡、载柱、随后洗涤和随后洗脱来进行。
疏水相互作用色谱法(HIC)是利用蛋白疏水特性的分离方法。溶液中高离子强度可以增强蛋白质与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，吸附作用通过在蛋白质非极性区域与固体支持物上的固定化疏水配体之间的疏水相互作用得以加强。在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品洗脱。疏水相互作用色谱法物质是用疏水配体比如乙基、丁基、苯基或己基基团的取代的基质。优选的物质是用丁基或苯基配体取代的基质。
疏水相互作用色谱法(HIC)树脂填料是本领域已知的，且包括树脂比如ButylSepharose(GE Healthcare)，苯基Sepharose(低和高取代)，辛基Sepharose和烷基Sepharose(全部来自GE Healthcare；其它HIC树脂来源包括Biosepra，法国；E.Merck，德国；BioRad USA)。
在优选实施方式中，疏水相互作用色谱法用树脂比如苯基Sepharose 6fast flow(高取代)(可得自GE Healthcare)进行。应理解步骤(2)可以用具有相似特征的替代树脂进行。可以使用的备择树脂如下：Capto Phenyl(HS)；Capto Butyl；Butyl Sepharose 4FF；Butyl Sepharose 4FF(HS)；Octyl Sepharose 4FF；Phenyl Sepharose 6FF(LS)；PhenylSepharose 6FF(HS)；Phenyl Sepharose Big Beads；Phenyl Sepharose 6FF；PhenylSepharose HP；Butyl Sepharose HP；Butyl Sepharose 4B；Octyl Sepharose CL-4B；Phenyl Sepharose CL-4B。全部来自GE Biosciences(800)526-3593。其它树脂是：Phenylseplife 6FF；来自seplife；Octyl Focurose 4FF来自汇研生物(参见www.biomart.cn)。
在优选实施方式中，平衡、加载、洗涤和洗脱缓冲剂选自磷酸或其盐，硫酸或其钠盐，MES，Bis-Tris，ADA，PIPES，ACES，BES，MOPS，TES，HEPES，TRICINE,BICINE,优选硫酸铵。在HIC树脂上的结合通常通过使用高电导率的平衡和加载缓冲剂来实现，所述缓冲剂例如通过加入盐比如NaCI、NH4Ac、(NH4)2SO4或Na2SO4，优选硫酸铵。优选的盐浓度是1.2至1.8M，优选约1.5M(NH4)2SO4。洗涤一般地使用加载缓冲剂。疏水相互作用色谱法的洗脱步骤优选通过降低流动相电导率(降低盐浓度)进行。所述减少能够以线性方式或分步实现。任选地，缓冲的溶液也可包含额外的无机盐。在一个实施方式中无机盐选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠和柠檬酸钾。
优选使用这样的平衡、加载、洗涤和洗脱缓冲剂，其具有为或约为6.5至为或约为8.5，更优选为或约为7.0至为或约为8.0，最优选为或约为7.4的pH。特别优选的平衡、加载和洗涤缓冲剂系统含有磷酸钠和硫酸铵，优选pH为或约为7.4。优选的洗脱缓冲剂含有pH为或约为7.4的硫酸铵。
优选，在步骤(2)之后不进行缓冲剂交换，利于随后进行步骤(b)(RPC)的情况。那么，缓冲剂交换能够通过随后RPC实现：通过将后续色谱法步骤比如AEX或HIC色谱法的优选缓冲剂用作运行缓冲剂。
低PH孵育灭活病毒(3)步骤。
本发明过程也涉及低PH孵育灭活病毒(3)步骤。
病毒粒子的囊膜结构在低pH容易被破坏，从而使病毒失去感染活性。孵育温度越高，灭活病毒能力越强；样品pH越低，灭活病毒能力越强；孵育时间越长，灭活病毒能力越强。
低PH孵育灭活病毒法pH调节剂优选酸性调节剂，比如有机酸或者无机酸，优选磷酸、盐酸、柠檬酸。更加优选柠檬酸。
低PH孵育灭活病毒法，其具有为或约为2.5至为或约为4.5，更优选为或约为3.0至为或约为4.0，最优选为或约为3.5-3.7的pH。
低PH孵育灭活病毒法，其具有为或约为15℃至为或约为30℃，更优选为或约为18℃至为或约为26℃，最优选为或约为20℃-25℃的孵育温度。
低PH孵育灭活病毒法，其时间或为具有为或约为15℃至为或约为30℃，更优选为或约为18℃至为或约为26℃，最优选为或约为20℃-25℃的孵育温度。例如，可以在3.5pH的孵育20℃。
孵育时间优选为至少30分钟，至少60分钟，至少90分钟，至少2小时，至少3小时或至少6小时。例如，可以在约3.5的pH在约室温孵育约90分钟。该病毒灭活步骤能够在纯化过程期间的任意时间进行，优选在最后色谱法步骤之前进行。
优选，在步骤(3)之后进行pH调节，利于随后进行步骤(4)(RPC)的情况。
反相色谱层析(RPC)(4)步骤。
该过程涉及反相色谱层析(4)步骤。在优选实施方式中，特别是在重组FSH的情况下，将反相色谱层析用作捕获步骤，其中重组FSH得以富集，例如自天然来源液体或细胞培养收获物。优选在自RPC柱洗脱之前施行病毒灭活。
“反相色谱层析”根据本发明尤其是指这样的色谱法步骤，其中使用非极性固定相和优选极性流动相。在反相色谱层析中，通常极性化合物首先洗脱，而非极性化合物得以保留。
反相色谱层析通常这样进行：平衡并加载柱，随后洗涤，然后洗脱，各自使用优选含有有机溶剂比如乙醇或异丙醇的缓冲剂。有机溶剂比如异丙醇能够用于在洗脱之后病毒灭活。
平衡、加载、洗涤和洗脱优选通过用这样的流动相进行，其缓冲于弱碱性pH，例如为或约为pH7至8，优选为或约为7.2至7.8，更加优选为7.4至7.6，最优选为7.5。在优选实施方式中，缓冲物质是醋酸缓冲剂，优选醋酸铵。适用于pH为或约为7.4至7.6的替代缓冲液包括BES，MOPS，乙酸铵，TES，HEPES。
在优选实施方式中，用于RPC步骤的缓冲溶液含有有机溶剂，对于不同色谱法步骤阶段(平衡、加载、洗涤和洗脱)调节其浓度。优选，有机溶剂是可与水混合的有机溶剂比如乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等，更优选异丙醇。
洗脱液为线性梯度洗脱或者阶段梯度洗脱，优选阶段梯度洗脱。在洗脱溶液中，有机溶剂优选包含乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等中至少一种。缓冲液浓度是20mmol/L至60mmol/L，优选约35mmol/L至55mmol/L或50mmol/L，比如50mmol/L醋酸铵。有机溶液浓度是至少10％(v/v)异丙醇，至少20％(v/v)异丙醇，至少30％(v/v)异丙醇，至少40％(v/v)异丙醇，至少50％(v/v)异丙醇，至少60％(v/v)异丙醇，至少70％(v/v)异丙醇，至少80％(v/v)异丙醇。例如，洗脱液是35mmol/L醋酸铵和10％异丙醇(v/v)混合物，或者50mmol/L醋酸铵和20％异丙醇(v/v)混合物，或者50mmol/L醋酸铵和50％(v/v)异丙醇混合物。
反相柱物质由疏水的无机基质填料、有机基质填料或者复合基质填料构成。优选复合基质填料，如硅胶、氧化铝、氧化锆等作基质材料，包覆无机基质填料的高聚物如聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚环氧乙烷、聚硅氧烷、琼脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷以及气相沉积碳等至少一种，更加优选聚苯乙烯/二乙烯苯。
配体一般地选自(但不限于)脂族，比如C2，C4，C6，C8，C10，C12，C14，C16，或C18或它们的衍生物例如氰基丙基(CN-丙基)，或支化脂族，或苯类芳族比如苯基，或其它极性或非极性配体等至少一种。配体可以是这些配体中两个或更多个的混合物。
适宜的聚苯乙烯类树脂包括，不受限制地，Rohm Haas供给的树脂(例如AmberliteXAD或Amberchrom CG)，Polymer Labs供给的树脂(例如PLRP-S)，GEHealthcare供给的树脂(例如来源RPC)，Applied Biosystems供给的树脂(例如Poros R)。特别优选的树脂是Source 30RPC(GE Healthcare)。
一般地，纯化样品以至少约0.1mg每ml树脂，例如至少约0.3mg，0.4mg，0.8mg，1.5mg，4mg，8，或15mg每ml树脂；或0.1-180mg，例如0.1-150mg，0.5-100mg，2-60mg，或3-40mg每mL树脂的浓度加载至柱上；优选载量为至少1mg每mL树脂。堆积树脂体积的测量一般以悬浮或相似模式完成。
额外步骤
除了三个主要色谱法步骤(1)，(2)，(3)和(4)，本发明过程可以任选地包括本领域技人员已知的额外的步骤，例如色谱法步骤或过滤步骤病毒灭活步骤。优选的额外的步骤是过滤比如透析过滤，超滤或纳米过滤。
在一种优选实施方式中，本发明过程包括次序如下所示的下述步骤：
(0)超滤；(任选地额外的透析过滤步骤；优选使用具有的截断值为或约为10kD的膜)
(1)硫酸铵沉淀；
(2)疏水相互作用色谱法(HIC)；(优选用Phenyl Sepharose 6fast flow(高取代)层析柱)
(3)低PH孵育灭活病毒；和(优选用pH3.6)
(4)反相色谱层析(RPC)。(优选用Source 30RPC柱)
对重组FSH溶液样品进行超滤步骤，尤其是病毒清除步骤；也即降低糖蛋白制剂被源自细胞培养物的病毒或病毒类颗粒污染的风险。超滤可以在纯化过程的任意阶段进行，然而，特别优选在色谱程序之前进行超滤。超滤可以进行多于一次，例如其可以进行两次。优选超滤(或渗滤)较佳用大约为10-15kD，最好是10kD的超滤膜。
在一种优选实施方式中，本发明过程包括次序如下所示的下述步骤：
(0)超滤；(任选地额外的透析过滤步骤；优选使用具有的截断值为或约为10kD的膜)
(1)硫酸铵沉淀；
(2)疏水相互作用色谱法(HIC)；(优选用Phenyl Sepharose 6fast flow(高取代)层析柱)
(3)低PH孵育灭活病毒；和(优选用pH3.6)
(4)反相色谱层析(RPC)。(优选用Source 30RPC柱)
(4a)疏水相互作用色谱法(HIC)；(优选用Phenyl Sepharose 6fast flow(高取代)层析柱)
(5)纳米膜过滤；(优选用20纳米的纳米膜滤器)
上述特定纯化过程优选不再包括任何其它色谱法步骤和/或超滤步骤和/或透析过滤步骤地进行。然而，在特别的实施方式中，上述纯化过程可以还包括额外步骤，尤其是本文描述的额外步骤中的一种或多种，例如用于除去或灭活不希望或和/或危险物质的那些。
又一种优选实施方式中，本发明过程包括次序如下所示的下述步骤：
(0)超滤；(任选地额外的透析过滤步骤；优选使用具有的截断值为或约为10kD的膜)
(1)硫酸铵沉淀；
(2)疏水相互作用色谱法(HIC)；(优选用Phenyl Sepharose 6fast flow(高取代)层析柱)
(3)低PH孵育灭活病毒；和(优选用pH3.6)
(3a)疏水相互作用色谱法(HIC)；(优选用Phenyl Sepharose 6fast flow(高取代)层析柱)
(4)反相色谱层析(RPC)。(优选用Source 30RPC柱)
(5)纳米膜过滤；(优选用20纳米的纳米膜滤器)
上述特定纯化过程优选不再包括任何其它色谱法步骤和/或超滤步骤和/或透析过滤步骤地进行。然而，在特别的实施方式中，上述纯化过程可以还包括额外步骤，尤其是本文描述的额外步骤中的一种或多种，例如用于除去或灭活不希望或和/或危险物质的那些。
本发明优势在于纯化过程步骤少，纯化效果好，减少色谱步骤数至最少2个色谱步骤。尤其是，使用根据本发明的纯化过程，避免了成本昂贵且容易出问题的纯化步骤尤其比如亲和力纯化步骤，特别是免疫亲和纯化步骤、凝集素亲和纯化步骤。本发明方法提供高度的重组FSH纯度和特定生物活性，其纯度>97％，优选>99％，更优选>99.5％w/w，各自按例如通过高效液相色谱法测量的总蛋白质计。其生物学活性>59000IU/ml，优选>60000IU/ml，更优选>61000IU/ml。另外，本发明的纯化过程目的FSH的回收率也很高。
贮藏/冻干
上述纯化过程得到且含有重组FSH的液态组合物可以原样或者在纯化之后冷冻贮藏，洗脱物可以进行冻干(“冷冻-干燥”)，除去溶剂。所得液体或冻干的产品称为"重组FSH总料"。
配制剂
本发明的或根据本发明方法纯化的重组FSH可以配制用于任意类的制剂，优选用于肌内或皮下注射，优选皮下注射。重组FSH制剂可以冻干，在注射之前将其溶于注射用水。重组FSH配制剂还可以是液体配制剂，在该情况下不事先溶解直接注射。
重组FSH配制剂可以含有已知赋形剂和稳定剂，可以额外包含抗氧化剂和/或表面活性剂。本发明的重组FSH可以与已知赋形剂和稳定剂例如蔗糖和甘露醇一起配制。其还可以包含抗氧化剂比如甲硫氨酸。其还可以包含表面活性剂，比如吐温(优选吐温20)，或普流罗尼克(Pluronic)(优选普流罗尼克F68)。
重组FSH配制剂可以是单剂量或多剂量。如果是多剂量，则其应优选含有抑菌剂，例如烷基苄酯，苯甲醇，间-甲酚，麝香草酚或苯酚，优选甲基苄酯或间-甲酚。单剂量配制剂还可以包含抑菌剂。适宜的配制剂描述于例如PCT/EP2011/062986，通过援引加入本文。
在特别优选的多剂量配制剂中，通过本发明方法产生的重组FSH这样配制：将其与蔗糖、磷酸缓冲剂(pH6.6至7.4)、吐温20、甲硫氨酸和抑菌剂一起溶解在注射用水中。
适应症
本发明的重组FSH适用于重组FSH作为指征的全部治疗中。特别适用于辅助生殖技术中***诱导、控制性超***的皮下给药，辅助繁殖技术的控制性卵巢过度刺激，和治疗***减少症。其可以与其它***如LH和hCG一起组合使用。其还可以与增加对FSH应答的其它化合物一起使用，比如克罗米芬、柠檬酸氯米芬，芳香酶抑制剂比如阿那曲唑、来曲唑、法倔唑和YM-511。另外，LH和hCG还可以在生育治疗中单独使用。
重组FSH
使用术语“重组”是指通过使用重组DNA技术产生的FSH的制剂。用重组技术表达FSH方法的一个实例是，用编码FSHα亚单位和β亚单位的DNA序列转染真核细胞，通常，表达媒介携带驱动FSH表达的强启动子例如CMV或SV40，以及已掺入媒介的用于选择宿主细胞的适宜的选择标记物。转染可以是稳定的或暂时的。适宜的重组表达系统是现有技术中熟知的，从而不需要详述。优选，真核宿主细胞选自灵长类细胞，优选人类细胞和啮齿动物细胞，优选CHO细胞。如欧洲专利在EP 0 211 894和EP 0 487 512中所述，不管在一个载体还是在两个载体上均有一亚单位，每个亚单位都有一单个启动子。编码FSH的DNA可以是一个cDNA或其含有内含子。
重组技术生成FSH又一个实施例是用同源重组技术以有效连接的方式把一异源调节片段***到编码FSH的一个或两个亚单位的内源序列中，如欧洲专利号EP0505500(Applied ResearchSystems ARS Holding NV)所述。重组技术如WO99/57263(TranskaryoticTherapies)中所公开的方法，其中一个亚单位异源***细胞，而另一个亚单位经同源重组***一个异源调节片段以激活基因组序列而表达。本发明的方法可以用于纯化以上所述任何一种方法所表达的FSH。
“FSH变异体”的表达指包含一些在氨基酸序列、糖基化模式或在亚单位之间的连接与人FSH不同但呈现FSH活性的分子。例子包括CTP-FSH，即一种长效的经修饰的重组FSH，其由野生型α亚单位和杂交β亚单位构成，其中hCG的羧基末端肽在FSHβ亚单位的C末端融合，如LaPolt等人；Endocrinology；1992，131，2514-2520；或Klein等人；Development andcharacterization of a long-acting recombinant hFSH agonist；CN 101087805BHuman Reprod.2003，18，50-56]所述。还包括单链CTP-FSH，一种单链分子，由βFSH(FSHβ亚单位)，βhCGCTP(113-145)(hCG羧基末端肽)，αFSH(FSHα亚单位)组成。
这里所指的FSH变异体也包括PEG-rh FSH化，rh FSH-Fc融合蛋白，rh FSH-CTP融合蛋白,包含rh FSH的双功能抗体，包含rh FSH的偶联药物，rhFSH糖基化改造。
本文提及的FSH变型也包括来自不同的种类例如马(Equus caballus)，猪(Susscrofa)，牛(Bos taurus)，猫(Felis catus)，犬(Canis familiaris)的FSH。
在优选实施方式中，FSH在血清中或在不含血清的媒介中重组地产生。在又一优选实施方式中，根据本发明方法产生的纯化FSH适于皮下给药，这使得患者自行给药成为可能。
未加工的重组FSH
指在采取任何纯化步骤之前表达FSH的重组细胞中的细胞培养上清液。该表达包括了上清液未加工的形式(从细胞中分离)，也包括浓缩的和/或过滤的和/或超滤的上清液。
生物活性
是指一种FSH制剂引起与FSH相关的生物学功能，如在Steelman-Pohley测定中得到的卵巢重量[Assay of the follicle stimulating hormone based ontheaugmentation with human chorionic gonadotrophin；Endocrinology；1953，53，604-616]，或者女性病人的卵泡生长。女性病人的卵泡生长可以通过超声波估算，如，根据在刺激后第8天平均直径大约有16mm的卵泡数量。生物活性可经一种对于FSH可接受的标准来估算。
关于FSH的“比活性”术语指以IU表示的制剂的生物活性除以蛋白质重量，IU根
据公认的FSH的生物测定法如Steeelman Pohley生物测定法测出，蛋白质重量根据一种总蛋白含量的测定法来测定，如Lowry测定法[O.H.Lowry，N.J.Rosebrough，A.L.Farr and R.J.Randall(1951)J.Biol.Chem.193：265；Hartree E.E.(1972).Anal.Biochem.48：422；J.R.Dulley and P.A.Grieve(1975)Anal.Biochem.64：136]，Bradford测定法[Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72，248]，或者在280nm的吸收值测定。
本发明的FSH的比活性较佳为大于或大约10000IU/mg，更佳为大于或大约12000IU/mg，再佳为大于或大约14000IU/mg，最佳为大于或大约16000IU/mg，其中生物活性用Steelman-Pohley测定法测定，而蛋白质纯度用SEC-HPLC测定。
本发明的主要优点包括：
1)本发明提供的方法可以替代现有人FSH的纯化方法。
2)本发明方法提供高度的重组FSH纯度和特定生物活性，其纯度>97％，优选>99％，更优选>99.5％w/w，更优选＞99.9％，各自按例如通过高效液相色谱法测量的总蛋白质计。
3)本发明的重组促***比活性高达16000IU/mg。其生物学活性>59000IU/ml，优选>60000IU/ml，更优选>61000IU/ml。另外，本发明的纯化过程目的FSH的回收率也很高。
4)本发明的重组促***相比已有的制备方法，简单易操作，其优势在于纯化过程步骤少，纯化效果好，减少色谱步骤数至最少2个色谱步骤。尤其是，使用根据本发明的纯化过程，避免了成本昂贵且容易出问题的纯化步骤尤其比如亲和力纯化步骤，特别是免疫亲和纯化步骤、凝集素亲和纯化步骤。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：用方法1纯化FSH
步骤(0)：超滤
形成粗制FSH的原料源自含有重组FSH的细胞培养物上清液。
在超滤步骤之前，在室温经1μm膜过滤清洁上清液。然后用截留分子量为10KD的超滤膜超滤。将超滤物浓缩为约8％。
步骤(1)：硫酸铵沉淀
缓冲液：100％饱和度的(NH4)2SO4溶液，pH 7.4
对来自步骤(0)的超滤物在室温下进行硫酸铵沉淀，将100％饱和度的(NH4)2SO4溶液按45％比例缓慢加入来自步骤(0)的超滤物，边加边搅拌。
离心力3500×g，20min，去沉淀，收集上清液。
上清液经0.65μm膜过滤。
步骤(2)：疏水相互作用色谱法(HIC)；(优选用Phenyl Sepharose 6 fast flow(高取代)层析柱)
A液：“50mmol/LNH4Ac+50％饱和度(NH4)2SO4,pH7.4”
B液：“50mmol/LNH4Ac,pH7.4”
1)平衡：HIC平衡液(50mmol/LNH4Ac+50％饱和度(NH4)2SO4，pH7.4)平衡柱子，平衡体积不低于2CV。
2)上样：接收上一工序样品进行上样，调节上样流速，保证保留时间不低于5min。
3)平洗：HIC平衡液洗柱，直到A280降至基线。
4)HIC冲洗液(50mmol/LNH4Ac+27.5％饱和度(NH4)2SO4，pH7.4)冲洗杂蛋白，直到A280降至基线。
5)HIC洗脱液(50mmol/LNH4Ac，pH7.4±0.2)洗脱目的蛋白，收集A280主峰。
洗出液直接进入下一步骤。本步骤在室温下进行
步骤(3)：低PH孵育灭活病毒(优选用pH3.6)
缓冲液：0.5mol/L柠檬酸
缓冲液：1.0mol/L Tris
用0.5mol/L柠檬酸调节步骤(2)的物质pH至3.6。样品于20℃静置孵育2.5小时。1mol/L Tris调节样品pH至7.4。1400×g离心20min。0.2μm膜过滤。
过滤液直接进入下一步骤。本步骤在室温下进行。
步骤(4)：反相色谱层析(RPC)。(优选用Source 30RPC柱)
RPC平衡液：50mmol/L NH4AC pH7.4
RPC冲洗液A：50mmol/LNH4Ac+10％异丙醇，pH7.4
RPC洗脱液:50mmol/LNH4Ac+20％异丙醇，pH7.4
RPC冲洗液B:50mmol/LNH4Ac+50％异丙醇，pH7.4
RPC清洗液：0.5mol/L NaOH
RPC保存液：0.01mol/LNaOH
来自步骤(3)的洗出液直接上样。RPC平衡液冲洗层析柱，RPC冲洗液A冲洗，RPC洗脱液洗脱，收集洗脱峰。RPC冲洗液B冲洗。用RPC保存液冲洗并保存层析柱。
步骤(5)：纳米膜过滤；(优选用20纳米的纳米膜滤器)
采用Millipore公司的20nm的Virosolve Pro纳米膜滤器。
上一工序样品依次使用0.1μm的预过滤器、20nm的纳米膜滤器过滤，纳米膜滤器过滤量不超过13ml/cm2。记录纳米膜滤器使用数量与每个滤器过滤体积。
实施例2：用方法2纯化FSH
步骤(0)：超滤
形成粗制FSH的原料源自含有重组FSH的细胞培养物上清液。
在超滤步骤之前，在室温经1μm膜过滤清洁上清液。然后用截留分子量为10KD的超滤膜超滤。将超滤物浓缩为约8％。
步骤(1)：硫酸铵沉淀
缓冲液：100％饱和度的(NH4)2SO4溶液，pH 7.4
对来自步骤(0)的超滤物在室温下进行硫酸铵沉淀，将100％饱和度的(NH4)2SO4溶液按45％比例缓慢加入来自步骤(0)的超滤物，边加边搅拌。
离心力3500×g，20min，去沉淀，收集上清液。
上清液经0.65μm膜过滤。
步骤(2)：疏水相互作用色谱法(HIC)；(优选用Phenyl Sepharose 6 fast flow(高取代)层析柱)
A液：“50mmol/LNH4Ac+50％饱和度(NH4)2SO4,pH7.4”
B液：“50mmol/LNH4Ac,pH7.4”
1)平衡：HIC平衡液(50mmol/LNH4Ac+50％饱和度(NH4)2SO4，pH7.4)平衡柱子，平衡体积不低于2CV。
2)上样：接收上一工序样品进行上样，调节上样流速，保证保留时间不低于5min。
3)平洗：HIC平衡液洗柱，直到A280降至基线。
4)HIC冲洗液(50mmol/LNH4Ac+27.5％饱和度(NH4)2SO4，pH7.4)冲洗杂蛋白，直到A280降至基线。
5)HIC洗脱液(50mmol/LNH4Ac，pH7.4±0.2)洗脱目的蛋白，收集A280主峰。
洗出液直接进入下一步骤。本步骤在室温下进行
步骤(3)：低PH孵育灭活病毒(优选用pH3.6)
缓冲液：0.5mol/L柠檬酸
缓冲液：1.0mol/L Tris
用0.5mol/L柠檬酸调节步骤(2)的物质pH至3.6。样品于20℃静置孵育2.5小时。1mol/L Tris调节样品pH至7.4。1400×g离心20min。0.2μm膜过滤。
过滤液直接进入下一步骤。本步骤在室温下进行。
步骤(4)：反相色谱层析(RPC)。(优选用Source 30RPC柱)
RPC平衡液：50mmol/L NH4AC，pH7.4
RPC冲洗液A：50mmol/LNH4Ac+10％异丙醇，pH7.4
RPC洗脱液:50mmol/LNH4Ac+20％异丙醇，pH7.4
RPC冲洗液B:50mmol/LNH4Ac+50％异丙醇，pH7.4
RPC清洗液：0.5mol/L NaOH
RPC保存液：0.01mol/LNaOH
来自步骤(3)的洗出液直接上样。RPC平衡液冲洗层析柱，RPC冲洗液A冲洗，RPC洗脱液洗脱，收集洗脱峰。RPC冲洗液B冲洗。用RPC保存液冲洗并保存层析柱。
步骤(5)：凝胶过滤层析(GFC)(优选用hiload 26/600superdex 75prep grade)
GFC平衡液：10mmol/L PB，pH7.0
GFC清洗液：0.5mol/L NaOH
GFC保存液：0.01mol/L NaOH
GFC平衡液平衡层析柱，RPC层析后收集的样品分次上样，GFC平衡液进行冲洗，出峰后收集第一个峰的样品，GFC清洗液洗柱，GFC保存液冲洗并保存层析柱。
步骤(6)：纳米膜过滤(优选用20纳米的纳米膜滤器)
采用Millipore公司的20nm的Virosolve Pro纳米膜滤器。
上一工序样品依次使用0.1μm的预过滤器、20nm的纳米膜滤器过滤，纳米膜滤器过滤量不超过13ml/cm2。记录纳米膜滤器使用数量与每个滤器过滤体积。
实施例3：样品纯度的测定
这些纯化步骤后的rhFSH总料纯度测定如下：
表1 各步骤后的rhFSH总料纯度测定
实施例4：样品生物活性的测定
用Steelman-Pohley卵巢重量增加方法测量纯化的rhFSH生物活性。可以用生物活性除以用SE-HPLC法测定的FSH含量来计算比活性。如表2所示。最后总料比活性通常在14000到17000IU/mg之间。
根据实施例1和2的方法得到的两个实施例的最后总料FSH的值如表1所示。
表2 本发明纯化的rhFSH总料比活性
根据实施例1和2的方法得到的两个实施例的最后总料FSH的纯度值如表3所示。
表3 本发明纯化的rhFSH总料纯度
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏璟泽生物医药有限公司
上海景泽生物技术有限公司
成都泽研生物技术有限公司
<120> 重组人促卵泡激素及其制备方法
<130> P2019-0847
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro
20 25 30
Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro
50 55 60
Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu
65 70 75 80
Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly
85 90 95
Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr
100 105 110
Tyr His Lys Ser
115
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile
1 5 10 15
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys
20 25 30
Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly
35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys
50 55 60
Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg
65 70 75 80
Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val
85 90 95
Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys
100 105 110
Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys
115 120 125
Glu
<210> 3
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat 60
gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120
ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180
tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240
tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg 300
gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a 351
<210> 4
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
atgaagacac tccagttttt cttccttttc tgttgctgga aagcaatctg ctgcaatagc 60
tgtgagctga ccaacatcac cattgcaata gagaaagaag aatgtcgttt ctgcataagc 120
atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc tacaccaggg atctggtgta taaggaccca 180
gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc ttcaaggaac tggtatacga aacagtgaga 240
gtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc ttgtatacat acccagtggc cacccagtgt 300
cactgtggca agtgtgacag cgacagcact gattgtactg tgcgaggcct ggggcccagc 360
tactgctcct ttggtgaaat gaaagaataa 390