一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺
阅读说明：本技术 一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺 (Purification process of recombinant protein rhCG expressed in CHO (Chinese hamster ovary) cells ) 是由 夏星辉 胡晶晶 高乃波 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本申请涉及重组蛋白领域,尤其涉及一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺,包括在亲和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β-巯基乙醇,在漂洗液中加入EDTA金属螯合剂,防止蛋白氧化和防止重金属对目标蛋白的破坏,得到纯度高的产物。(The application relates to the field of recombinant protein, in particular to a recombinant protein rhCG purification process expressed in CHO cells, which comprises the steps of adding dithiothreitol and beta-mercaptoethanol into affinity eluent, and adding an EDTA metal chelating agent into rinsing liquid to prevent protein oxidation and damage of heavy metal to target protein, thereby obtaining a product with high purity.)
技术领域
本申请涉及重组蛋白领域，尤其涉及一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(hCG)由胎盘滋养细胞合成的激素，由α亚基、β亚基组成，目前广泛用于治疗女性不孕、性机能障碍、流产、侏儒症、皮肤瘙痒、皮痒、肿瘤等疾病。
hCG最早以孕妇尿液为原料，通过沉淀、离子交换层析等方法制备，含较多杂质、来源不确定、有传染疾病风险以及批间差异、易发生过敏反应等，在临床使用中存在风险。之后研究者把研发重点放在了利用重组技术制备和生产，并在临床上逐渐取代尿源HCG。
虽然有昆虫细胞、神经细胞等宿主的尝试，但目前rhCG生产中最常用的细胞仍然为CHO细胞。但CHO细胞中蛋白质的表达调控机理、蛋白质翻译后修饰调控系统、细胞生长代谢调控机制等环节仍然缺少深入认识，所以在外源基因的整合策略、高表达菌株的筛选、高效培养基配置、培养工艺调控等方面的理论指导水平都还比较低，相关研究都更多地依赖大量的优化筛选和优化实验来获得较优的操作条件。不仅研究和生产效率低、耗时长、成本高，而且受偶然性因素影响较大。虽然国外先进企业已经通过开发谷氨酰胺合成酶(GS)系统、定制无血清个性化培养基、优化高密度微载体培养工艺和补料策略、应用低成本和低剪切力生物反应器等手段，rhCG的高水平表达仍然需要较长的培养时间(＞20天)和较高的生产成本。
虽然rhCG与u-HCG具有基本相同的分子结构和药理药代特点，但rhCG在纯度、效价和安全性等方面较u-HCG具有较大的优势。rhCG存在于CHO细胞的培养液中，培养液中存在多种杂质，须通过有效的分离纯化方法去除，才能获得纯度、比活和安全性达到药典要求的重组蛋白。目前常用的纯化方法也是多种层析和膜过滤方法的组合。应用研究系统股份公司(ARS)采用C4硅胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM琼脂糖凝胶和C18反相层析，再利用超滤浓缩并去除小分子杂质，最后利用凝胶过滤层析去除及游离的α和β亚基。
虽然目前已经实现了rhCG的商品化生产，并且相关产品已经在临床得到了多年应用，但rhCG的生产技术仍存在一些亟待解决的问题。
(1)以CHO细胞为代表的哺乳动物细胞的大规模培养过程存在技术难度大、培养周期长、蛋白表达水平有限、生产成本高等不足。
CHO细胞中蛋白质的表达调控机理、蛋白质翻译后修饰调控系统、细胞生长代谢调控机制等环节仍然缺少深入认识，所以在外源基因的整合策略、高表达菌株的筛选、高效培养基配置、培养工艺调控等方面的理论指导水平都还比较低，相关研究都更多地依赖大量的优化筛选和优化实验来获得较优的操作条件。不仅研究和生产效率低、耗时长、成本高，而且受偶然性因素影响较大。虽然国外先进企业已经通过开发谷氨酰胺合成酶(GS)系统、定制无血清个性化培养基、优化高密度微载体培养工艺和补料策略、应用低成本和低剪切力生物反应器等手段，使重组蛋白的表达水平达到了较高水平，但仍然需要较长的培养时间(＞20天)和较高的生产成本。
(2)重组蛋白的分离纯化过程复杂、生产成本高等不足。
虽然重组蛋白的浓度在CHO细胞培养液中的浓度已达到了较高水平，但培养液中各种杂质的浓度仍然较高，分离纯化的难度依然较大，必须通过反复利用多种层析和膜过滤操作，才能使产物的纯度、比活和安全性达到药典要求。因此，大约50～70％的成本仍然产生于重组蛋白的分离纯化工序。
目前，在rhCG产品的研发和生产方面出现了一些新的技术，以提高产品的生物效价、生产效率和产品纯度。这些技术体现并指明了包括rhCG在内的重组糖蛋白药物研发和生产的研究趋势。
如在rhCG中引入分离因素，为高效分离纯化方法的使用创造条件，从而简化rhCG的分离纯化步骤、提高分离纯化效率、减低分离纯化成本。广州优联康医药科技有限公司申报并获得授权的专利ZL 201310617181.8中披露了一种制备hCG与人IgG Fc变体片段的融合蛋白的方法，利用融合的无免疫活性的IgG Fc变体片段进行hCG的亲和层析，只需2步层析过程即可获得纯度大于98％的重组蛋白。类似的，也可以尝试在hCG的结构中引入其他不破坏活性的分离因子，为高效分离方法的应用创造条件。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种在CHO细胞中表达的重组蛋白hCG纯化工艺，对亲和洗脱液和漂洗液进行改进，在亲和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β-巯基乙醇，在漂洗液中加入EDTA金属螯合剂，防止蛋白氧化和防止重金属对目标蛋白的破坏，得到纯度高的产物。本发明的另一个目的是提供一种对发酵混合培养基和补料培养基进行改进，同时对亲和洗脱液和漂洗液进行改进，得到纯度高的产物。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺，包括在亲和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β-巯基乙醇，在漂洗液中加入EDTA金属螯合剂。
作为优选，纯化工艺包括发酵液处理、亲和层析、超滤、病毒灭活、离子层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、病毒过滤和无菌过滤；所述的亲和层析层析柱的填料为blue填料。
作为优选，亲和洗脱液包括20mmol/L Tris、1.5mol/L氯化钠、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5mmol/Lβ-巯基乙醇和5％乙醇，PH为7.5±0.2。
作为优选，亲和层析中使用的漂洗液中包括20mmol/L Tris、300mmol/L氯化钠、5mmol/L EDTA金属螯合剂，pH为7.5±0.2。
作为优选，亲和层析的层析柱直径350mm，柱高15±2cm，线性流速100-250cm/h。
作为优选，所述的发酵液处理：细胞液下罐后，加入氯化锌溶液，室温放置一段时间后用离心机离心或深层过滤，然后用缓冲液顶洗，离心后的溶液用不同规格的聚醚砜滤芯前后串联过滤，收获后的溶液作为亲和层析上样样品。
作为优选，所述离子交换层析：层析柱直径72mm，柱高15±2cm，线性流速100-250cm/h。
作为优选，所述疏水层析：层析柱直径72mm，柱高15±2cm，线性流速50-150cm/h；所述的羟基磷灰石层析：层析柱直径40mm，柱高15-20cm，线性流速50-150cm/h。
一种使用CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG的制备工艺，包括CHO细胞表达rhCG的发酵工艺和上述的rhCG的蛋白纯化工艺。进一步的，在发酵混合培养基中加入氯化锰，在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。
本发明一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺，使在CHO细胞中表达重组人rhCG蛋白纯化，且在层析纯化过程中的漂洗液和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β-巯基乙醇以及EDTA金属螯合剂，防止蛋白氧化和防止重金属对目标蛋白的破坏，使其纯度达到95％以上。本发明中rhCG是用CHO细胞发酵获得，通过前期对发酵参数和细胞等因素的优化后，申请人尝试了对发酵混合培养基和补料培养基的改进，研究了多种特殊添加剂对CHO表达rhCG的影响，发现在培养基中加入锰离子、氢化可的松和焦磷酸钠可以有效提高rhCG表达水平。
附图说明
图1：使用CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG的制备工艺图；
图2：对照品rhCG高效液相色谱图；
图3：供试品rhCG高效液相色谱图；
图4：供试品和样品肽谱；
图5：为发酵培养第6日时hCG各亚基的相对丰度。
具体实施方式
实施例1：使用CHO细胞发酵生产rhCG。
一、发酵所用的细胞、培养基及其他试剂：
发酵所用的CHO细胞为申请人自制，使用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂将携带rhCGα、β亚基的载体转染入CHO细胞K1株中制成，该细胞随后被无血清驯化并已经在申请人rhCG的试验性生产中运用超过18个月。
传代培养基：
CD CHO AGT 24.3mg/ml、一水磷酸二氢2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L-精氨酸550mg/ml、L-天冬酰胺1300mg/ml、L-天冬氨酸400mg/ml；
发酵混合培养基：
CD CHO AGT 24.3mg/ml、CD OPTICHO AGT 9.66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、生物素0.15mg/ml、叶酸11.5mg/ml、肌醇120mg/ml、氯化钾300mg/ml、葡萄糖5500mg/ml、氯化钠2100mg/ml、大豆水解蛋白30mg/ml；
补料培养基：
BalanCD CHO Feee3 66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L-精氨酸2000mg/L、L-天门冬氨酸4500mg/L、维生素C15mg/L、维生素H 5mg/L叶酸30mg/L、肌醇400mg/L、维生素B12 5mg/L、氯化钾0.0015mg/L、F-68 950mg/L、葡萄糖18000mg/L；
HCG ELISA试剂盒：日本东曹；
MnCl2：济南凯创化工有限公司；
CD CHO AGT：gibco
CD OPTICHO AGT：gibco
BalanCD CHO Feee3：irvine scientific
焦磷酸钠：食品级，山东冠特生物工程有限公司；
氢化可的松：上海麦克林生化科技有限公司；
其他包括PCR试剂和仪器在内的试剂和仪器均为常规国产。
二、基本发酵生产过程：如图1中细胞发酵工艺所示细胞复苏：
细胞复苏：
1)取细胞冻存管，置于37℃水浴锅内直至冻存的细胞悬液融化。
2)在吸取冻存细胞转至装有6～7ml CHO传代培养基的离心管内，离心1000rpm，5分钟，去除上清。
3)用分次吸取10mlCHO传代培养基轻轻吹打离心管内底部的成团细胞。
4)接种至装有10mlCHO传代培养基的125ml摇瓶内，使最终体积约为20ml，接种细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml。将摇瓶置于二氧化碳培养箱中36.5±1℃、5±3％CO2、125±10rpm进行培养。
传代：
1)摇瓶培养：将细胞摇瓶放置于二氧化碳培养箱中36.5±1℃、5±3％CO2、125±10rpm进行培养。每天进行细胞计数，当细胞密度达到1.5*106细胞/ml以上时，进行传代，加入CHO传代培养基，调整细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml。
2)wave培养：当细胞密度达1.5*106细胞/ml以上时，在把摇瓶内的细胞液收集到无菌瓶中，通过无菌接管机接种到细胞培养袋子中，调整细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml，将细胞培养袋置于36.5±1℃、20±5rpm摇摆式仪上进行培养。当细胞密度达到1.5*106细胞/ml以上时，进行传代，加入CHO传代培养基，调整细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml。
发酵：(100L规模)：
当20L体积的细胞培养袋内细胞密度1.5*106细胞/ml以上时，接种20L到提前一夜已经预培养的50L发酵混合培养基里，接种完的当天，定为第一天，在培养第3、6、9天时分别加入10L补料培养基。培养至12天发酵结束(培养参数为：36.5±1℃、pH控制在6.8-7.2、溶氧控制在40-60％，转速控制在60±5转/分)。
发酵结束后和发酵过程中使用实施例1所述的试剂盒检测HCG水平，使用现有文献中的引物PCR检测α亚基、β亚基转录水平(α亚基：上游CTGGTCACATTGTGCTATCTTTC、下游TGAGGTGACGTTCTTTTGGAC；β亚基：上游ATGTTCCAGGGGCTGCTGCTGTT、下游CGCGGTAGTTATTGCACCACACCACCTGA)
三、发酵过程的优化
经过前期对发酵参数和细胞等因素的优化，我们的方法在12天时间内实现了180mg/L左右的重组蛋白的表达水平。为了进一步提高产量/在类似产量下降低成本，我们自行对定制培养基进行了进一步改进。参考现有技术，尝试向培养基中加入MnCl2(发酵混合培养基中加入3mg/ml)，氢化可的松，焦磷酸钠，结果如下：
表1优化细胞株和发酵混合培养基中添加锰离子对表达水平的影响(三罐样本平均值)
进一步研究转录水平结果如图5所示：我们发现优化后的细胞株中β亚基与α亚基比率明显超过了初始细胞株，这意味着在优化后的细胞株中α亚基转录表达可能是限制产量的因素，而在发酵混合培养基中加入MnCl2可以有效提高α亚基转录水平进而提高产量；
表2补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠对表达水平的影响(优化后的细胞株，三罐样本平均值)
在补料培养基中单独加入氢化可的松或焦磷酸钠并无明显增产效果，而氢化可的松和焦磷酸钠的组合则可以实现明显提高重组蛋白表达量的效果(初步分子是补料中两者配合可以抑制细胞生长，停滞细胞周期以累积产物)。
组合锰离子、氢化可的松和焦磷酸钠后，我们在12日培养时间中实现了280.22mg/L的高表达水平。
实施例2：rhCG蛋白纯化
如图1中蛋白纯化工艺流程，整个rhCG纯化过程一共包括细胞液下罐处理、亲和层析、第一步超滤、病毒灭活层析、疏水层析、第二步超滤、CHT层析、病毒过滤和无菌过滤。100kg细胞液(以实际下罐为准)纯化四步层析选用的柱子直径分别是350mm，72mm，72mm和40mm。CHT层析填料的高度为15-20cm，其他层析填料高度15±2cm。2次超滤用的膜均为10KD的聚醚砜超滤膜，具体膜面积按照实际情况选择。病毒预过滤器和病毒过滤器生产厂家均为Merck。具体膜面积按照实际情况选择。
1、发酵液处理
细胞液下罐后，加入一定量的氯化锌溶液，室温放置一段时间后用离心机离心或深层过滤，然后用一定体积的缓冲液顶洗，离心后的溶液放入有冷却水循环的缓冲罐中，再用聚醚砜滤芯前后串联过滤，收获后的溶液为亲和层析上样样品。
2、亲和层析
试剂准备：0.1M NaOH溶液、20％乙醇-0.1M KH2PO4溶液、亲和平衡液：pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+50mmol/L氯化钠、亲和漂洗液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+300mmol/L氯化钠+5mmol/LEDTA金属螯合剂、亲和洗脱液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1.5mol/L氯化钠+0.5mmol/L二硫苏糖醇+0.5mmol/Lβ-巯基乙醇+5％乙醇。
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)0.1M NaOH溶液冲洗：冲洗20～40min；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)亲和平衡液冲洗：用亲和平衡液冲洗柱子，待UV和电导曲线平稳后UV曲线调零，一般冲洗2～4个体积；
5)样品上柱：将样品溶液上柱；
6)亲和平衡溶液冲洗：样品上完后，用亲和平衡溶液冲洗，直到UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗2～4个柱体积；
7)亲和漂洗液冲洗：用亲和漂洗溶液冲洗，直到杂峰出现后UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗2～4个柱体积；
8)亲和洗脱液冲洗(样品洗脱)：用亲和洗脱溶液冲洗，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集洗脱产品，直到UV吸收值低于100mAU时结束收集；
9)0.1M NaOH溶液冲洗：用0.1M NaOH溶液冲洗30～40min；
10)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，直至pH和电导值下降，电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
11)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～10)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
在亲和层析的漂洗液中加入EDTA金属螯合剂，用来防止重金属对目标蛋白的破坏，在细胞发酵的培养基中含锰离子，EDTA金属螯合剂可以去除层析柱中的残留锰离子。
3、第一步超滤
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、离子交换平衡液20mmol/L Tris，pH7.5±0.2；
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，循环冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水将超滤膜冲洗至中性。
离子交换平衡液冲洗：用离子交换平衡液冲洗、湿润超滤膜。
样品超滤：对亲和层析洗脱的样品进行超滤，控制进口压力在1～3bar，出口压力小于1bar，亲和洗脱液先浓缩3倍左右体积，再置换到离子交换平衡液(通常5～8倍浓缩后体积)。作为下一步离子交换层析溶液。
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水冲洗超滤膜至流出的液体为中性。
4、病毒灭活、离子交换层析
病毒灭活：超滤后的样品，搅拌下缓慢加入一定量的TritonX-100，加完后，室温下搅拌，进行病毒灭活。
离子交换层析：
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、离子交换再生液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1mol/L氯化钠，离子交换平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris、离子交换洗脱液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+0.5mol/L氯化钠；
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)0.5M NaOH溶液冲洗：冲洗20～40min；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)活化：用离子交换再生液活化填料，基本活化2～4个柱体积；
5)平衡：用离子交换平衡液来平衡柱子，平衡3～5个柱体积，直至电导率和pH基线平稳，纯化仪UV280手动归零；
6)上柱：将灭活好的样品溶液加载到柱子中，全部上完后用离子交换平衡液冲洗，直到UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗5～7个柱体积；
7)洗脱：用离子交换洗脱液洗脱样品，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集洗脱产品，直到UV吸收值100mAU时结束收集；
8)再生：用离子交换再生液来洗脱柱子，一般2～4个柱体积；
9)0.5M NaOH溶液冲洗：0.5M NaOH溶液冲洗柱子，冲洗30～40min；
10)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，直至pH和电导值下降，电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
11)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～10)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
5、疏水层析
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、疏水平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1.5mol/L硫酸铵、疏水漂洗液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1mol/L硫酸铵、疏水洗脱液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+0.5mol/L硫酸铵，疏水缓冲液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+2mol/L硫酸铵。
样品处理：离子交换洗脱后的样品，用疏水缓冲液调节样品电导与疏水平衡液一致(相差2ms/cm之内)，测试调节后样品的pH值，与疏水平衡液pH差值在±0.2之内，如不在范围内，用0.1M盐酸或者0.1M氢氧化钠调节到范围内。
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)0.5M NaOH溶液冲洗：冲洗20～40min；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)平衡：用疏水平衡液来平衡柱子，平衡2～4个柱体积，直至UV、电导率基线平稳，纯化仪UV280手动归零；
5)样品上柱：将调节电导后的离子交换洗脱液加载到柱子中，用疏水平衡液溶液冲洗，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积；
6)漂洗：用疏水漂洗溶液冲洗，直到杂峰出现后UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗2～4个柱体积；
6)样品洗脱：用疏水洗脱液洗脱样品，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集洗脱产品，直到UV吸收值100mAU时结束收集；
7)再生：用注射用水冲洗柱子，一般冲洗2～4个体积；
8)0.5M NaOH溶液冲洗：0.5M NaOH溶液冲洗柱子，冲洗30～40min；
9)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，一般冲洗2～4个体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
10)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～9)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
6、第二步超滤
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、0.1M NaOH水溶液、CHT平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L的PB。
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，循环冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水将超滤膜冲洗至中性。
CHT平衡液冲洗：用CHT平衡液冲洗、湿润超滤膜。
样品超滤：对疏水层析洗脱的样品进行超滤，进控制进口压力在1～3bar，出口压力小于1bar，控制样品重量不变，用CHT平衡液为超滤样品量的5-8倍。
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水冲洗超滤膜至流出的液体为中性。
7、羟基磷灰石层析(CHT层析)
试剂准备：1M NaOH水溶液、0.1M NaOH水溶液、CHT再生液pH7.5±0.2，1mol/L的PB、CHT平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L的PB
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)1M NaOH溶液冲洗：冲洗2～4个柱体积；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)用CHT再生液活化柱子，基本活化2～4个柱体积；
5)用CHT平衡液平衡柱子，平衡2～4个柱体积，直至UV、电导率和pH基线平稳，纯化仪UV280手动归零；
6)样品上柱(收集样品)：将样品全部上柱，样品上完后，用CHT平衡液溶液冲洗，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集流穿产品，直到UV吸收值低于100mAU时结束收集；
7)再生：用CHT再生液洗脱柱子，基本冲洗2～4个柱体积；
8)NaOH溶液冲洗：用1M NaOH溶液冲洗柱子，冲洗2～4个柱体积；
9)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，直至pH和电导值下降，电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
10)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～9)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
8、病毒过滤
用注射用水冲洗预过滤器和病毒过滤器，冲洗好后，进行病毒过滤，当样品溶液全部过滤完后，用20mM的磷酸盐缓冲液顶洗预过滤器和病毒过滤器，收集滤出的液体，用分光光度计测试蛋白浓度，当病毒过滤器出口样品基本无蛋白浓度后，停止收集。
对病毒过滤器进行完整性测试，确定是否合格，如不合格，应重新进行病毒过滤。
根据样品量选择合适的病毒预滤器和病毒过滤器。
9、无菌过滤
根据样品量来选择无菌过滤器。
将无菌过滤器和无菌储液袋相连，将病毒过滤后的样品溶液过滤到无菌储液袋中，样品全部过滤完后，用20mM的磷酸盐缓冲液顶洗过滤器，用分光光度计测试蛋白浓度，基本无蛋白浓度后，停止过滤。
10、分装
根据样品量，分装至无菌储液袋中，-20℃以下保存。
实施例3：高效液相色谱法鉴别
简述：高效液相色谱法是一种专属性高的鉴别方法，根据供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间是否一致进行鉴别，由于本品的含量测定采用高效液相色谱法，因此本法可用于重组绒促性素的鉴别。
仪器与设备：高效液相色谱仪(配紫外检测器)、pH计、电子分析天平。
测定方法：对照溶液：用水制成每1ml中含250μg对照品的溶液(0.25mg/ml)，记录色谱图。
样品溶液：根据OD280测得的浓度，用水制成每1ml中含250μg样品的溶液(0.25mg/ml)，进样，记录色谱图。
结果判定：如图2和3所示，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
三批中试结果：
结论：经测定，3批中试样品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间均一致。
实施例4：生物检定法
简述：生物检定法是一种专属性高的鉴别方法，由于本品的效价测定采用生物检定法，因此本法可用于重组绒促性素的鉴别。
动物及实验器具：
动物：取健康合格、出生15～23日、体重9～13g、同一来源雌性幼小鼠，一次实验所用幼小鼠的出生日数相差不得超过3日，体重相差不得超过3g；按体重随机分成6组，每组不少于10只。
器具：电子天平、手术剪、眼科剪、镊子、1ml针筒、扁形称量瓶、培养皿、磨口试剂瓶、50ml滴定管、1000ml或500ml烧杯等。
试剂：牛血清蛋白、氯化钠、纯化水、氢氧化钠。
试验操作：
溶剂配制：取牛血清蛋白2.00g，氯化钠18.00g，加水2000ml溶解，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至7.2±0.2。
标准品配制：实验当日，取标准品，按标示效价加含0.1％牛血清白蛋白的0.9％氯化钠溶液溶解并定量稀释配成1ml含10单位的溶液，充分溶解后加0.1％牛血清白蛋白的0.9％氯化钠溶液配成高、中、低浓度的稀释液，相邻两剂量之比为1：0.6，置于2-10℃冰箱内保存，供3日内使用。
供试品配制：按标示效价或估计效价，照标准品溶液的配制法配制，相邻浓度之比值(r)应与标准品相等，标准品与供试品各剂量所致的反应均值应相近。
测定法：取上述动物，按体重均匀分成若干组，每组为10只，每日于大致相同的时间分别给每组动物大腿两侧及后背部皮下注射一种浓度的标准品或供试品溶液0.2ml，每日一次，连续3天。
于最后一次注射后约24小时后，将动物处死，分别称鼠重，然后用手术剪刀将小鼠下腹部剪开暴露二侧子宫，用眼科剪从卵巢与肾脏促剪断，捡起二侧子宫，再从阴道根部剪断取出子宫，剥离附着的组织，压干子宫内液，称重，记录。
结果判定：测定结果应能使未成年雌性小鼠子宫增重。
三批中试结果：
结论：
经测定，3批中试样品均能使未成年雌性小鼠子宫增重。
实施例5：肽谱检测方法
简述：肽谱是一种高特异的鉴定方法，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成图谱，记录样品和标准品的各峰的保留时间，计算其相似性，达到特性鉴别目的。
结果判定：
如图4所示，供试品溶液的峰形与对照品溶液的峰形相似度应一致(相似度≥0.90)。
三批中试结果：
结论：
经测定，3批中试样品溶液的峰形与对照品溶液的峰形一致。
实施例6：细菌内毒素
细菌内毒素检测方法
简述：参照细菌内毒素检查法(通则1143)第一法(凝胶法)建立本分析方法。
仪器与用具：试管恒温仪、旋涡混匀器、电热鼓风干燥箱、无热原试管。
试剂：0.25EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素检查用水、细菌内毒素标准品。
操作方法：本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
供试品溶液：根据本品的蛋白含量将供试品浓溶液按照下式计算其最大有效稀释倍数，用细菌内毒素检查用水将供试品浓溶液逐步稀释至最大有效稀释倍数浓度，得到供试品溶液，稀释过程中每一步的稀释倍数不超过10倍。
式中MVD表示最大有效稀释倍数；L表示内毒素的限值，单位EU/U；C表示供试品浓溶液的浓度，单位U/ml；λ是鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。
采用凝胶限量法检测：将一定量的鲎试剂和等量的溶液(通常是0.1ml)分别按下表混合，根据鲎试剂供应商的建议将反应混合物恒温孵育一段时间(通常是37±1℃，60±2分钟)，避免振动。
各溶液制备如下：
结果判定：
孵育结束后将每支试管或安瓿轮流从恒温箱中直接取出并轻轻翻转180°观察结果，如果内容物形成结实凝胶并在试管翻转后不从管壁滑脱，则记为阳性；如果未形成完整的凝胶，则记为阴性。
当阳性对照溶液B和C中所有重复管均为阳性结果以及阴性对照溶液D所有重复管均为阴性结果时，试验方为有效。如果溶液A的两支重复管均为阳性时，供试品不符合规定。如果溶液A中一管为阳性结果另一管为阴性结果，则需重复此试验，重复试验中，如果溶液A的两管均为阴性结果，则该供试品符合规定。
每1mg重组绒促性素中含内毒素的量应小于60EU。
三批中试结果：
结论：
经测定，3批中试样品溶液的细菌内毒素均符合标准要求。
实施例7：纯度(SEC-HPLC)
简述：采用HPLC法测定本品的纯度，计算方法采用面积归一化法。SEC-HPLC称为体积排阻色谱，又称凝胶色谱和分子筛色谱，其是以多孔凝胶为固定相，依据样品分子量大小达到分离的目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。根据样品性质可分为凝胶过滤和凝胶渗透，凝胶过滤主要用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、核苷酸、多糖等。凝胶渗透主要用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。纯度分析方法验证内容见含量项下，因纯度和含量检测方法相同。
测定法：用水制成每1ml中含约250μg样品的溶液(0.25mg/ml)，精密量取40μl注入液相色谱仪，记录色谱图。空白对照为水溶液，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图。
结果判定：
按面积归一化法计算，除系统峰外，主峰纯度大于95％。
三批中试结果：
结论：
经测定，3批中试样品溶液的纯度均符合标准要求。
实施例8:DNA残留
DNA残留检测方法
简述：本品是采用CHO细胞培养表达制得，需对CHO细胞产生的DNA残留进行检测。采用DNA提取试剂盒提取CHO DNA，然后用CHO DNA检测试剂盒对DNA进行测定，检测方法为荧光定量法，其特异性较好，且具有一定程度耐盐，检测灵敏度高。
计算结果：通过测出的SD值与DNA浓度的量得出线性公式，在将样品的SD值通过计算得出结果，回收率要在80％～120％之间，PCR扩增效率在90％～110％之间，线性R2≥0.98。
可接受标准：DNA残留不得过400pg/mg。
三批中试结果：
结论：
经测定，3批中试样品溶液的DNA残留均符合标准要求。
实施例9:HCP残留
HCP残留检测方法
简述：本品是采用CHO细胞培养制得，尽管采用多种纯化方式进行纯化，但可能在药物中还会有微量的宿主蛋白残留(HCP)，从而会对药品的安全性及药性产生影响，因此进行HCP检测。
仪器与用具：酶标仪
操作方法：
将试剂及试剂盒取出平衡至室温。在预包被了抗体的酶标板上每孔加入100μlanti-CHO:HRP。将标准品(100ng/ml、40ng/ml、12ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0ng/ml)，质控品(由标准品稀释而来)和供试品各50μl加入到孔中。
产品稀释方法：估计供试品中HCP残留，用PBST20，(0.05％，v/v)稀释到合适浓度，标准品加样顺序从低浓度到高浓度，质控品加样顺序从高浓度到低浓度。
酶标板于室温(24±4℃)条件下180rpm孵育2h。每孔加入250μl稀释好的洗涤液洗涤4次。每孔加100μl TMB底物显色液，室温显色30min，注意不得震荡。每孔加入100μl终止液终止显色。置酶标仪上读OD450/650nm，进行编辑和数据处理分析。
可接受标准：
线性R2≥0.99，质控回收率在80％～120％之间。结果不高100ppm。三批中试结果：
结论：
经测定，3批中试样品溶液的HCP残留均符合标准要求。
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