人源抗人tigit抗体及其应用

文档序号：729389 发布日期：2021-04-20 浏览：3次 >En<

阅读说明：本技术 人源抗人tigit抗体及其应用 (Human anti-human TIGIT antibody and application thereof ) 是由杜鹏杨志新韩冬徐银凤岳俊杰余云舟陆建昇于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了人源抗人TIGIT抗体及其应用。本发明公开的抗人TIGIT抗体,含有重链可变区V-H和轻链可变区V-L,V-H和V-L均由决定簇互补区和框架区组成；V-H和V-L的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；V-H的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.10的第30-35位、第50-66位和第99-107位氨基酸所示；V-L的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.9的第23-33位、第49-55位和第88-96位氨基酸所示。本发明的抗体能够高亲和力结合TIGIT,能够有效阻断CD155与TIGIT的结合,并具有抗肿瘤活性。(The invention discloses a human anti-human TIGIT antibody and application thereof. The invention discloses an anti-human TIGIT antibody, which contains a heavy chain variable region V H And light chain variable region V L ，V H And V L Both consist of a determinant complementary region and a framework region; v H And V L Each of the determinant complementary regions of (a) consists of a CDR1, a CDR2 and a CDR 3; v H The amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 of (A) are shown as amino acids at positions 30-35, 50-66 and 99-107 of SEQ ID No. 10; v L The amino acid sequences of the CDR1, CDR2 and CDR3 are shown in the 23 rd to 33 th, 49 th to 55 th and 88 th to 96 th positions of SEQ ID No.9Amino acid at position (v). The antibody disclosed by the invention can be combined with TIGIT (tungsten inert gas) with high affinity, can effectively block the combination of CD155 and TIGIT, and has antitumor activity.)

人源抗人TIGIT抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，人源抗人TIGIT抗体及其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗(Cancer Immunotherapy)是近年来肿瘤治疗基础与临床研究的前沿热门领域。2011年，CTLA-4抑制剂伊匹单抗(Ipilimumab，也称为“Y药”)获批上市，该抗体通过激活T细胞介导的免疫应答而发挥抗肿瘤作用；由此，开启了肿瘤免疫治疗的全新时代。 2014年以来，纳武利尤单抗(Nivolumab，也称为“O药”)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab，也称为“K药”)等PD-1/PD-L1抗体相继问世，并取得了令人瞩目的疗效，深刻地改变了癌症治疗的范式。CTLA-4药物研发推动者美国科学家James Allison以及PD-1/PD-L1分子发现者日本科学家Tasuku Honjo，也因在“通过抑制负性免疫调节治疗癌症方面的贡献”，获得了2018年的诺贝尔生理学或医学奖。以CTLA-4、PD-1/PD-L1单抗为代表的第一代免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Blockade，ICB)的成功，不仅带动了药物研发投入的快速增长，也促进了肿瘤免疫机制和免疫治疗策略的深入研究。

与此同时，临床实践的深入探索也逐步揭示出第一代免疫检查点抗体面临的突出问题：受益患者有限、多数肿瘤效果不佳、药物耐受等。以PD-1/PD-L1单抗为例，对于多数肿瘤类型，实际上仅有不到20％的患者能够从治疗中获益；同时，相当一部分早期治疗有效的患者在治疗过程中或之后出现肿瘤复发的情况。根据肿瘤微环境(Tumor Microeviroment，TME) 免疫表型的差异，当前主流理论将肿瘤分为“热”肿瘤(炎性肿瘤)、“冷”肿瘤(免疫“荒漠”)、免疫抑制型肿瘤和免疫阻隔型肿瘤四类(Galon和Daniela Bruni,Nat.Rev.Drug Discov.2019,18:197-218.)。临床研究结果表明，仅肿瘤实质中存在大量免疫细胞浸润的“热”肿瘤对ICB抗体单药治疗的响应率较高，先天性耐药概率也较低。此外，免疫治疗形成的选择压力重塑肿瘤微环境，进而演化出新的免疫抑制机制，引起肿瘤免疫表型的转变(immune-altered)，可能是肿瘤免疫逃逸和耐药的重要机理之一。于此困境，学术界与工业界的研究焦点聚集到了三个主要方向：(1)新机制的发现与新靶点的开发；(2)联合用药机制研究与临床方案创新设计；(3)新的生物标志物开发；等。

T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT，也称WUCAM、Vstm3或VSIG9)是一种主要表达在NK细胞、T细胞、Treg细胞等免疫细胞表面的检查点分子。人TIGIT由胞外的一个IgV样结构域、I型跨膜结构域以及胞内的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸尾部基序(ITT)组成，是典型的抑制性受体蛋白。TIGIT与共抑制受体CD96、共刺激受体CD226(也称DNAM-1)竞争结合配体CD155(也称PVR或necl-5)和CD112(也称nectin-2)。CD155是TIGIT的高亲和力核心配体，其与TIGIT的相互作用力远高于通路中的其它配对分子。结构生物学的研究表明，CD155/TIGIT、CD155/CD226、CD155/CD96等分子对，均是以一种被称为“锁-钥”(Lock and Key)的保守模式，通过胞外IgV样结构域发生相互作用；相互作用表位覆盖了“锁-钥”之间的整个空间区域。

TIGIT作为新的免疫检查点分子，其调控机理与PD-1/PD-L1类似。正常生理条件下， CD155/TIGIT的负性免疫调控可视为对I型MHC机制的另一种补充，以保护上皮来源的正常细胞(广泛表达CD155)等免受NK细胞的杀伤。但此种机制亦被肿瘤细胞“窃取”，用以规避免疫系统的杀伤，实现免疫逃逸。早期研究揭示了TIGIT的高表达与肿瘤浸润CD8⁺ T细胞耗竭的相关性，并在小鼠荷瘤模型中观察到TIGIT阻断剂在逆转CD8⁺ T细胞耗竭、增强抗肿瘤活性方面的良好效果；TIGIT抗体与PD-1/PD-L1抗体联用更是显示出显著的抗肿瘤活性，提示CD155/TIGIT与PD-1/PD-L1通路之间的协同作用。同时，在大量针对临床患者的研究中，也观察到了肿瘤浸润的T细胞和NK细胞表面TIGIT表达水平的显著提高；肿瘤组织中CD155 的表达也显著升高，且与TNM分期、总体生存率、复发率等密切相关。

随着研究的深入，TIGIT在肿瘤免疫负性调节方面的作用机制逐步得到明确，可归纳为三个方面：(1)TIGIT高表达于肿瘤浸润或迁移相关的NK细胞与效应T细胞表面，CD155在肿瘤细胞表面高表达，肿瘤细胞通过CD155/TIGIT的结合直接作用于NK细胞和效应T细胞，抑制其活性，导致其功能耗竭；(2)肿瘤微环境中的Treg细胞通过分泌IL-10等抗炎因子，抑制炎症反应；肿瘤细胞通过CD155结合Treg表面高表达的TIGIT，促进Treg的功能，更进一步抑制肿瘤微环境的炎症反应；(3)NK细胞和效应T细胞表面TIGIT一方面对共刺激受体CD226(DNAM-1)与CD155的结合形成优势竞争，一方面抑制CD226的表达，导致其功能缺失，进一步对免疫效应细胞的活性形成抑制。前述(1)(2)，TIGIT对免疫效应细胞和Treg 细胞的调控功能截然相反(抑制与促进)，其原因尚不清楚。

此外，小鼠模型中的研究也表明，TIGIT的表达与NK细胞密切相关，T细胞耗竭与NK细胞耗竭密切相关，PD-1/PD-L1抗体与TIGIT抗体的治疗效果依赖于NK细胞存在；深入揭示了NK细胞在多重免疫抑制中的关键作用以及TIGIT作为免疫治疗靶点的巨大潜力，也为免疫检查点抗体的临床联用提供了重要理论依据。

根据TIGIT逐渐清晰的作用机理，通过靶向TIGIT的免疫治疗抗体，阻断CD155/TIGIT 通路介导的免疫抑制信号，将能够逆转肿瘤浸润的NK细胞和CD8⁺ T细胞的耗竭，释放免疫效应细胞的肿瘤杀伤活性，有望取得良好的抗肿瘤疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗TIGIT抗体。

本发明提供的抗TIGIT抗体，含有重链可变区V_H和轻链可变区V_L，所述V_H和V_L均由决定簇互补区和框架区组成；

所述V_H和所述V_L的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述V_H的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.10的第30-35位氨基酸所示；

所述V_H的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.10的第50-66位氨基酸所示；

所述V_H的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.10的第99-107位氨基酸所示；

所述V_L的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.9的第23-33位氨基酸所示；

所述V_L的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.9的第49-55位氨基酸所示；

所述V_L的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.9的第88-96位氨基酸所示。

上述抗体中，所述V_H的氨基酸序列可如序列表中SEQ ID No.10的第1-118位所示；所述 V_L的氨基酸序列可如序列表中SEQ ID No.9的第1-108位所示。

上述抗TIGIT抗体可为如下a)或b)或c)或d)：

a)由权利要求1或2中所述V_H和所述V_L连接得到的单链抗体；

b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；

c)含有权利要求1或2中所述V_H和所述V_L的Fab；

d)含有权利要求1或2中所述V_H和所述V_L的完整抗体。

上述抗体中，a)所述单链抗体的氨基酸序列可如SEQ ID No.6的第1-247位氨基酸所示；

c)所述Fab由Fab重链和轻链组成，所述Fab重链的氨基酸序列可如SEQ ID No.10的第1-221位所示，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID No.9所示；

d)所述完整抗体由重链和轻链组成，所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID No.10所示，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID No.9所示。

本发明还提供了与所述抗TIGIT抗体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B12)中的任一种：

B1)编码所述抗TIGIT抗体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

上述生物材料中，所述抗TIGIT抗体中所述V_H的CDR1的编码序列可如序列表中SEQID No.8 的第88-105位所示；

所述抗TIGIT抗体中所述V_H的CDR2的编码序列可如序列表中SEQ ID No.8的第148-198 位所示；

所述抗TIGIT抗体中所述V_H的CDR3的编码序列可如序列表中SEQ ID No.8的第295-321 位所示；

所述抗TIGIT抗体中所述V_L的CDR1的编码序列可如序列表中SEQ ID No.7的第67-99 位所示；

所述抗TIGIT抗体中所述V_L的CDR2的编码序列可如序列表中SEQ ID No.7的第145-165 位所示；

所述抗TIGIT抗体中所述V_L的CDR3的编码序列可如序列表中SEQ ID No.7的第262-288 位所示。

进一步，

所述抗TIGIT抗体中所述V_H的编码序列可如序列表中SEQ ID No.8的第1-354位所示；所述抗TIGIT抗体中所述V_L的编码序列可如序列表中SEQ ID No.7的第1-324位所示。

更进一步，

所述抗TIGIT抗体为单链抗体，所述单链抗体的编码序列可如序列表中SEQ IDNo.5的第1-741位所示；

所述抗TIGIT抗体为Fab，所述Fab由Fab重链和轻链组成，所述Fab重链的编码序列可如SEQ ID No.8的第1-663位所示，所述轻链的编码序列可如SEQ ID No.7所示；

所述抗TIGIT抗体为完整抗体，所述完整抗体由重链和轻链组成，所述重链的编码序列可如SEQ ID No.8所示，所述轻链的编码序列可如SEQ ID No.7所示。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码所述抗TIGIT抗体的核酸分子的表达盒(抗TIGIT 抗体基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达抗TIGIT抗体的DNA，该DNA不但可包括启动抗TIGIT抗体基因转录的启动子，还可包括终止抗TIGIT抗体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述抗TIGIT抗体基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为pABL、 pABG、pABG-Fab或pABK

在本发明的一个实施例中，所述抗TIGIT抗体为Fab，所述Fab的Fab重链表达载体为将抗体Fab重链表达载体pABG-Fab的Afl II与Nhe I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.8的第1-354位所示的所述V_H的编码基因得到的重组载体，所述Fab重链表达载体含有SEQ ID No.8的第1-663位所示的Fab重链编码基因，能表达所述Fab重链；

所述Fab的Fab轻链表达载体为将载体pABL的BsrG I和Hind III识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.7的第1-324位所示的所述V_L的编码基因得到的重组载体，所述Fab轻链表达载体含有SEQ ID No.7所示的轻链编码基因，能表达所述Fab的轻链。

在本发明的另一个实施例中，所述抗TIGIT抗体为完整抗体，所述完整抗体的轻链表达载体为所述Fab轻链表达载体；

所述完整抗体的重链表达载体为将载体pABG的Afl II和Nhe I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.8的第1-354位所示的所述V_H的编码基因得到的重组载体，所述重链表达载体含有SEQ ID No.8所示的重链编码基因，能表达所述重链。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述生物材料中，所述转基因动物细胞系非繁殖材料；所述转基因动物细胞系可为将B1) 所述核酸分子或B2)所述重组载体导入到动物细胞(如FreeStyle^TM293-F细胞或CHO细胞) 中得到的重组细胞。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的所述抗TIGIT抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述抗TIGIT抗体的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述抗TIGIT抗体且具有抗TIGIT抗体活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述抗TIGIT抗体所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本发明还提供了一种组合物，所述组合物为P1-P6中的任一种：

P1、由所述抗TIGIT抗体与抗PD-1抗体组成的组合物；

P2、由所述生物材料与抗PD-1抗体组成的组合物。

P3、由所述抗TIGIT抗体与免疫细胞组成的组合物；

P4、由所述生物材料与免疫细胞组成的组合物；

P5、由所述抗TIGIT抗体、免疫细胞与抗PD-1抗体组成的组合物；

P6、由所述生物材料、免疫细胞与抗PD-1抗体组成的组合物。

在本发明的一个实施例中，所述抗PD-1抗体为Nivolumab。

所述组合物可用于治疗和/或预防肿瘤，或制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂。

本发明还提供了一种治疗和/或预防肿瘤的产品，所述产品的活性成分为M1-M8中的任一种：

M1、所述抗TIGIT抗体；

M2、所述生物材料；

M3、由所述抗TIGIT抗体与抗PD-1抗体组成的组合物；

M4、由所述生物材料与抗PD-1抗体组成的组合物；

M5、由所述抗TIGIT抗体与免疫细胞组成的组合物；

M6、由所述生物材料与免疫细胞组成的组合物；

M7、由所述抗TIGIT抗体、免疫细胞与抗PD-1抗体组成的组合物；

M8、由所述生物材料、免疫细胞与抗PD-1抗体组成的组合物。

所述产品可为药物或疫苗。

本发明还提供了下述任一应用：

N1、所述抗TIGIT抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

N2、所述生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

N3、所述组合物在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

N4、所述产品在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。

本发明中，所述免疫细胞可为肿瘤免疫细胞。所述肿瘤免疫细胞可为NK细胞或效应T细胞。在本发明的一个实施例中，所述肿瘤免疫细胞为NK-92MI细胞。

所述肿瘤可为CD155高表达的肿瘤。所述肿瘤具体可为肺癌(如非小细胞肺癌)、表皮癌、胶质瘤、乳腺癌、胃癌、肠癌、肾癌或黑素瘤。

所述肿瘤细胞可为肺腺癌细胞、表皮癌细胞或胶质瘤细胞。在本发明的一个实施例中，所述肺腺癌细胞为A549，所述表皮癌细胞为A431，所述胶质瘤细胞为U251MG。

本发明通过构建稳定高表达TIGIT的CHO细胞株，并对大容量全合成人源单链抗体噬菌体展示库进行细胞筛选，经多轮次的生物淘洗(bio-panning)，筛选获得特异性人源抗人TIGIT 的单链抗体(single chain variable fragment,scFv)。进一步地，通过分子克隆技术构建轻重链全抗体表达载体，并进行真核表达与亲和纯化。所获全抗体AET2010表达水平高、特异性好、纯度高、结构稳定且药动学特征良好；能够高亲和力结合重组表达的TIGIT和细胞表面天然状态的TIGIT；能够有效阻断CD155与TIGIT的结合；能够促进和增强NK-92MI对体外培养的肿瘤细胞的杀伤活性，且与PD-1单抗联用时显示出更加优越的杀伤活性；在过继输注NK-92MI细胞的CDX小鼠模型体内显示出显著增强的抗肿瘤活性。所述内容，在研发早期层面充分验证了AET2010的分子特征和药效特征，预期了良好的可开发性。本发明的特征和优点在后文的详述和实施例中是明显而具体的，但该详述和实施例不应理解为对本发明的限制。本发明所引用的参考文献以及专利等公开文本的内容均可作为本发明内容的补充参考。

附图说明

图1所示为真核表达载体pABG(A)、pABL(B)、pABK(C)、pABG-Fab(D)、pABG4(E) 的结构图谱。其中，pABG-Fab和pABG4是在pABG基础上改造获得。

图2所示为TIGIT稳定高表达细胞株CHO-TIGIT的流式鉴定结果。

图3所示为hTIGIT-His、HSA-hTIGIT-His、hCD155-Fc与hCD155-His重组蛋白在还原条件下的SDS-PAGE电泳图；M：蛋白分子量标准，1：hTIGIT-His，2：hCD155-Fc，3： HSA-hTIGIT-His。

图4所示为重组抗体AET2010的SDS-PAGE电泳图；1：还原，2：非还原。

图5所示为重组抗体AET2010的HPLC纯度鉴定结果。

图6所示为ELISA检测AET2010与重组HSA-hTIGIT-His结合活性的结果。

图7所示为细胞ELISA检测AET2010与CHO-TIGIT细胞表面天然状态TIGIT结合活性的结果。

图8所示为流式细胞术检测AET201与CHO-TIGIT细胞表面天然状态TIGIT结合活性的结果。

图9所示为BIAcore^TM 3000测定AET2010(A)、MK7684(B)与抗原亲和力结果的代表性传感图。

图10所示为ELISA检测AET2010特异性的结果。

图11所示为AET2010-Fab与MK7684-Fab的SDS-PAGE电泳图；1：AET2010-Fab，2：MK7684-Fab。

图12所示为流式细胞术检测AET2010-Fab阻断hCD155-Fc(rhCD155-Fc)结合CHO-TIGIT 细胞表面天然状态TIGIT的结果。

图13所示为ELISA检测AET2010-Fab阻断hCD155-Fc(rhCD155-Fc)结合重组 HSA-hTIGIT-His的结果。

图14所示为AET2010/TIGIT复合物结构模型(A)及相互作用界面(B)。其中，锁-钥结构区域即为TIGIT与CD155互补结合的关键区域。

图15所示为ELISA检测AET2010在PBS(A)和FBS(B)中加速放置稳定性的结果。

图16所示为高通量蛋白质稳定性分析系统Uncle检测AET2010在25℃条件下粒度的结果。

图17所示为AET2010在裸鼠体内药动学特征的检测结果；其中A为包被HSA-hTIGIT-His 的情况，B为包被驴抗人IgG/Fc抗体的情况。

图18所示为流式细胞术检测肿瘤细胞表面CD155(A)、PD-L1(B)表达情况以及NK-92MI 细胞表面TIGIT(C)、PD-1(D)表达情况的结果。

图19所示为ELISA定量检测体外杀伤实验中NK-92MI细胞释放杀伤性细胞因子水平的结果。图中标示浓度为抗体对应浓度；采用t检验对相同浓度下待评价抗体与同型对照抗体的结果进行差异分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。

图20所示为ELISA定量检测体外杀伤实验中NK-92MI细胞释放杀伤性细胞因子水平的结果。图中标示浓度为抗体对应浓度；采用t检验对相同浓度下待评价抗体与同型对照抗体的结果进行差异分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。

图21所示为ELISA定量检测体外杀伤实验中NK-92MI细胞释放杀伤性细胞因子水平的结果。图中标示浓度为抗体对应浓度；采用t检验对相同浓度下待评价抗体与同型对照抗体的结果进行差异分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。对于待测抗体与Nivolumab联用情况，与Nivolumab单用的结果进行差异分析。

图22所示为抗体增强NK-92MI细胞对肿瘤细胞杀伤活性的检测结果。肿瘤细胞分别为 A549(A)、A431(B)、U251MG(C)；采用t检验对相同浓度下待评价抗体与同型对照抗体的结果进行差异分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。

图23所示为抗体在过继输注NK-92MI细胞的A549荷瘤小鼠模型体内的药效评价结果；图A为肿瘤生长曲线，图B为实验终点的肿瘤重量。采用t检验对实验终点待评价抗体与同型对照抗体的结果进行差异分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns表示无显著差异。

图24所示为抗体在过继输注NK-92MI细胞的A549荷瘤小鼠模型体内的药效评价结果—实验终点的肿瘤形态。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的pABL与pABG均记载在“Du et al.,A fully human monoclonalantibody with novel binding epitope and excellent neutralizing activity tomultiple human IFN-a subtypes:A candidate therapy for systemic lupuserythematosus,mAbs 7:5,969--980；September/October 2015；2015 Taylor andFrancis Group,LLC”，公众可从申请人处获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pABK，其序列为序列表中SEQ ID NO.21。

实施例1、人源抗人TIGIT抗体的产生

一、材料

1.材料：大容量全合成噬菌体单链抗体库由中国人民解放军原军事医学科学院(现为军事科学院军事医学研究院)生物工程研究所构建(ZL200910091261.8)，库容量1.35×10¹⁰。噬菌体感染的宿主菌株为XL1-Blue(美国Stratagene公司)，质粒扩增菌株为Top10(北京全式金生物技术有限公司)，辅助噬菌体为M13KO7(美国Invitrogene公司)，辣根过氧化氢酶(HRP)标记的抗M13KO7抗体(11973-MM05T-H)为北京义翘神州生物技术有限公司产品。 CHO细胞，转染试剂TransIntro EL Transfection Reagent(L20313)为北京全式金生物技术有限公司。转染用Opti-MEM无血清培养基及细胞培养所用1640培养基、0.25％胰酶及胎牛血清(FBS)均为Gibco公司产品，高表达细胞株筛选所用潮霉素B为WWR LifeScience公司产品。APC标记的小鼠抗人TIGIT抗体(372705)为美国Biolegend公司产品。人TIGIT (HG10917-UT)及人血清白蛋白(HSA，HG10968-UT)cDNA克隆载体为北京义翘神州生物技术有限公司产品。人TIGIT-His重组蛋白(10917-H08H)为北京义翘神州生物技术有限公司产品。FreeStyle^TM293-F哺乳动物细胞表达系统(包括细胞FreeStyle^TM293-F、无血清培养基及转染试剂)均为Invitrogene公司产品。真核表达载体pABL、pABG结构图谱见图1，蛋白纯化系统AKTA Purifier 100及HisTrap^TM FF柱、HiTrap^TM MabSelect SuRe柱，HiTrap^TM Desalting Columns柱均为GE公司产品。

2.方法与结果：

2.1 CHO-TIGIT稳定高表达细胞株的构建

0.25％胰酶消化收集培养状态良好的CHO细胞，调整细胞密度至1×10⁵/ml，按2ml接种至6孔板，37℃、5％CO₂孵箱培养过夜。用Opti-MEM无血清培养基100μl分别稀释2μgTIGIT 表达质粒(北京义翘神州生物技术有限公司，HG10917-UT)与10μl转染试剂(TransIntro EL Transfection Reagent)，充分混匀静置15min后加入细胞中，静置培养48h后弃去细胞培养基，胰酶消化、计数后按照1：4传代至48孔板中，待细胞长满底面积50-70％时加入含 200μg/ml潮霉素B的1640培养基(含10％FBS)，每隔3d换液；显微镜下观察并标记单克隆细胞团，超净台内刮下标记细胞团后加入96孔板内，每孔加入含潮霉素200μg/ml的1640 培养基继续培养，每隔3d换液；待孔内细胞长满后，消化收集细胞，调整密度至3×10⁵/test，冰上与APC标记的小鼠抗人TIGIT抗体结合1h，并设置不添加流式抗体对照组，每组设置3 个平行对照，1640完全培养基洗涤2次后流式细胞仪(BD C6 plus)检测，根据APC平均荧光强度(MFI)判定CHO细胞表面TIGIT表达情况，获得的人TIGIT稳定高表达细胞株命名为 CHO-TIGIT。

经转染、筛选和鉴定，成功构建了稳定高表达人TIGIT的CHO细胞株(CHO-TIGIT)。经流式细胞术检测，细胞表面TIGIT阳性率在99％以上(图2)，符合筛选要求。选取其中1株(CHO-TIGIT 2-4)用于噬菌体抗体库的筛选。

2.2 hTIGIT-His和HSA-TIGIT-His融合蛋白表达载体的构建与表达、纯化

拟构建的人TIGIT胞外域融合8个组氨酸标签的重组蛋白(hTIGIT-His)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。以TIGIT的cDNA克隆载体为模板，以pABG载体信号肽(抗体重链分泌信号肽)替换TIGIT信号肽。设计3条上游引物，每条引物均具有与上一条引物相互重叠序列，通过重叠PCR方法扩增TIGIT胞外域基因，相关引物如表1所列。拟构建的人血清白蛋白、连接肽(4GS)、人TIGIT胞外域和8个组氨酸标签依次串联的重组蛋白(HSA-hTIGIT-His) 的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，分别以HSA的cDNA克隆载体和TIGIT的cDNA克隆载体为模板，上下游分别设计引物扩增HSA基因及TIGIT胞外域基因，并在连接部位引入连接肽对应核苷酸序列，随后采用重叠PCR方法，将HSA基因及TIGIT胞外域基因进行融合连接，相关引物如表1所列。琼脂糖凝胶电泳确定并回收目的条带，通过EcoR I和BamH I两个酶切位点将目的基因克隆到真核表达载体pABG中。将含有正确hTIGIT-His编码基因(其序列如SEQ IDNO.2所示)的重组载体记为pABG-hTIGIT-His，pABG-hTIGIT-His能表达SEQ ID NO.1所示的重组蛋白hTIGIT-His；将含有正确HSA-hTIGIT-His编码基因(其序列如SEQ ID NO.4所示)的重组载体记为pABG-HSA-hTIGIT-His，pABG-HSA-hTIGIT-His能表达SEQ ID NO. 3所示的重组蛋白HSA-hTIGIT-His。pABG-hTIGIT-His和pABG-HSA-hTIGIT-His也可通过人工合成含有EcoR I和BamH I识别序列及其保护碱基的hTIGIT-His编码基因、含有EcoR I 和BamH I识别序列及其保护碱基的HSA-hTIGIT-His编码基因后通过酶切替换真核表达载体 pABG的EcoR I和BamH I识别序列间的小片段获得。

将pABG-hTIGIT-His和pABG-HSA-hTIGIT-His分别转染状态良好的FreeStyle^TM293-F细胞，于37℃、120rpm、5％CO₂水平摇床摇瓶培养3～4天，高速离心收集表达上清。基于AKTA 系统，采用HisTrap^TM FF进行亲和纯化，500mM咪唑洗脱收集样品，HiTrap^TM Desalting Columns 脱盐柱将纯化的蛋白置换到PH7.4 PBS缓冲液中，分别得到融合蛋白hTIGIT-His和 HSA-hTIGIT-His。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，分光光度计定量蛋白浓度。

表1、TIGIT表达载体构建所用引物列表

分子克隆构建了hTIGIT-His和HSA-hTIGIT-His的真核表达载体，表达纯化获得重组蛋白。SDS-PAGE鉴定结果如图3所示，还原条件下，hTIGIT-His大小约为18KD，HSA-hTIGIT-His 大小约为70KD，分子量大小符合预期，且蛋白纯度较高。

2.3噬菌体抗体库的CHO-TIGIT细胞筛选与单克隆鉴定

噬菌体抗体库(子库)稀释至1ml PBS牛奶(含2％脱脂奶粉的PBS)中，4℃封闭2h,得到封闭后的噬菌体抗体库。先后消化收集CHO与CHO-TIGIT细胞(即上文的CHO-TIGIT 2-4) (2×10⁷)，分别重悬于5ml预冷的PBS牛奶中，4℃封闭1h(匀速旋转防止细胞聚集，下同)， 4℃、1000rpm×5min离心收集细胞，分别得到封闭后的CHO细胞和封闭后的CHO-TIGIT细胞；用封闭后的噬菌体抗体库重悬封闭后的CHO细胞后，4℃结合4h后离心取上清液；用所得上清液重悬封闭后的CHO-TIGIT细胞，4℃结合4h后于4℃、1000rpm×5min离心，弃上清液，收集细胞；利用1ml预冷的PBS重悬细胞后，4℃、1000rpm×5min离心弃上清液，收集细胞，重复洗涤细胞10次；用500μl含10μg/ml胰酶的PBS重悬细胞沉淀，室温作用30min，加入500μl含血清的PBS至总体积1ml并终止反应；而后加入9ml对数生长期的大肠杆菌 XL1-Blue，室温静置感染30min后于37℃、150rpm培养1h，得到菌液；取总体积1％和0.1％的菌液分别涂布于2×YT-CTG平板(即含50μg/ml氯霉素[噬粒抗性]、10μg/ml四环素[大肠杆菌抗性]和0.5％葡萄糖的2×YT培养基)上，用于计算产出，剩余菌液离心浓缩后涂布 2×YT-CTG平板上，37℃培养过夜；刮板收集菌落，呈现噬菌体抗体，PEG8000沉淀回收噬菌体抗体，取一定量投入下一轮筛选。重复上述步骤，完成2-3轮筛选后视产出情况进行单克隆呈现与鉴定；其中，细胞投入量逐轮减少，洗涤次数逐轮增加。

挑取筛选产出的单克隆菌落，于含有2×YT-CTG培养基的96孔板中37℃、220rpm培养过夜至饱和；按1:10转接饱和菌液至新的96孔板中(2×YT-CT培养基)于37℃、220rpm 培养1.5h至OD600约为0.5，按感染复数MOI＝50加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置30min 后于37℃、150rpm培养1h，加入卡那霉素至终浓度为20μg/ml、IPTG至终浓度0.15mM，于 30℃、200rpm诱导呈现12h；离心收集上清后，用包被目的抗原(TIGIT-His)、无关对照抗原(本室制备保存的IFN-α与His的融合蛋白IFN-α-His及CHO细胞破碎上清(即将CHO 细胞破碎离心收集的上清液))的ELISA法检测噬菌体抗体的结合活性，鉴定结果为特异性阳性的单克隆菌落送测序，获得候选全人源抗体的可变区基因。

如方法2.3所述，经CHO细胞扣减后的噬菌体单链抗体库与CHO-TIGIT结合，再经三个轮次递进增强的筛选后，对筛选产出的噬菌体抗体进行单克隆鉴定，富集获得特异性噬菌体单链抗体2011-4-D5，该单链抗体的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO. 6所示。

SEQ ID NO.6中，第1-108位为轻链可变区，第23-33位、第49-55位与第88-96位分别为轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，第130-247位为重链可变区，第159-164位、第179-195位与第228-236位分别为重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

SEQ ID NO.5中，第1-324位为轻链可变区基因，第388-741位为重链可变区基因。

2.4噬菌体单链抗体转换为全抗体

载体pABG和pABL分别用于克隆抗体重链和轻链可变区基因，人工合成V_H5可变区基因(即单链抗体2011-4-D5重链可变区基因)，分别采用引物H5F和HR(表2)扩增V_H5可变区基因；人工合成V_λ3可变区基因(即单链抗体2011-4-D5轻链可变区基因，经过部分序列的调整)， L3F和LR扩增V_λ3可变区基因。V_λ3可变区基因利用酶切位点BsrG I和Hind III克隆入载体 pABL，V_H5可变区基因利用酶切位点Afl II和Nhe I克隆入载体pABG。将所得重组载体分别转化大肠杆菌TOP10，通过对重组载体进行测序鉴定，获得构建正确的全抗体轻、重链表达载体。提取质粒后，将轻、重链表达载体按摩尔比2:1混合后共转染状态良好的FreeStyle^TM293-F细胞，于37℃、120rpm、5％CO₂水平摇床摇瓶培养3～4天，高速离心收集表达上清。基于AKTA系统，采用HiTrap^TM MabSelect SuRe预装柱进行亲和纯化，0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱收集样品，HiTrap^TM Desalting Columns脱盐柱将抗体置换到PBS 缓冲液，即得到全抗体，命名为AET2010。分光光度计定量抗体浓度，SDS-PAGE和HPLC鉴定抗体纯度。

上述方法利用PCR分别扩增2011-4-D5轻重链基因，并酶切连接克隆到pABL和pABG表达载体，构建得到IgG1形式的全抗体(将该全抗体记为AET2010)表达载体，即轻、重链表达载体，轻、重链表达载体分别含有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的轻、重链基因，分别能表达AET2010的轻、重链，AET2010的轻、重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和 SEQ IDNO.10。

SEQ ID NO.9中，第1-108位为轻链可变区，第23-33位、第49-55位与第88-96位分别为轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，第109-213位为恒定区CL。

SEQ ID NO.10中，第1-118位为重链可变区，第30-35位、第50-66位与第99-107位分别为重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，第119-216位为CH1，第217-231位为铰链区，第232-341位为CH2，第342-448位为CH3。

上述方法经真核表达、纯化获得AET2010全抗体样品。AET2010表达水平约为30mg/L； SDS-PAGE电泳结果显示，条带正确、清晰，纯度较高(图4)；进一步的HPLC检测结果显示，AET2010样品呈单峰分布，无杂峰，纯度为100％(图5)。

表2、全抗体轻重链表达载体构建相关引物列表

实施例2、AET2010的结合活性

一、材料与方法

1.材料：抗TIGIT单克隆抗体MK7684可从美国默沙东公司获得，也可合成其轻、重链基因并克隆至pABK(图1)及pABG载体按照实施例1的AET2010的制备方法制备得到(专利号： US20160355589A1)，MK7684的轻链和重链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12 所示，MK7684的轻链和重链的基因序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，MK7684 作为对照抗体。

其中，MK7684的轻链表达载体为将pABK表达载体的Xba I和Nar I间的识别序列替换为SEQ ID NO.13的第1-327位所示的轻链可变区基因得到的重组载体，该重组载体含有SEQ ID NO.13所示的轻链基因，能表达SEQ ID NO.11所示的MK7684的轻链。

MK7684的重链表达载体为将pABG表达载体的Afl II和Nhe I间的识别序列替换为SEQ ID NO.14的第1-357位所示的重链可变区基因得到的重组载体，该重组载体含有SEQID NO.14 所示的重链基因，能表达SEQ ID NO.12所示的MK7684的重链。

HRP标记的山羊抗人IgG抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。CM5芯片为GE公司产品，抗人免疫球蛋白Fc捕获传感器(AHC Biosensor)和链亲和素传感器(SABiosensor) 均为艾瑞生物技术(上海)有限公司产品，mTIGIT蛋白(即小鼠TIGIT蛋白)为Acro公司产品，hTIGIT-HIS(人TIGIT融合HIS标签)，mTIGIT-HIS(小鼠TIGIT融合HIS标签)、hCSF1R-HIS(人集落刺激因子1受体融合HIS标签)、hTFRC(人转铁蛋白受体融合HIS标签)、hLAG3(人淋巴细胞活化基因3)、hCD73(人CD73)、hCD38(人CD38)、hNectin(人Nectin) 蛋白均按照常规方法制备。其他涉及材料来源同实施例1。

2.方法与结果：

2.1 ELISA检测AET2010结合活性

PBST牛奶(含2.5％脱脂奶粉和1‰吐温20的PBS)梯度稀释AET2010：起始浓度2.5μg/ml， 3倍梯度连续稀释11个梯度，得到不同浓度的抗体稀释液。

PBS稀释实施例1的HSA-hTIGIT-His重组蛋白至1μg/ml，按100μl/孔加入96孔酶联板，4℃包被过夜。弃包被液，PBS牛奶(含2.5％脱脂奶粉的PBS)、37℃封闭1h。弃封闭液，按100μl/孔加入抗体稀释液，每孔一种稀释液，37℃结合1h；PBST洗涤5次，按100μl/ 孔加入PBST牛奶(含2.5％脱脂奶粉的PBST)稀释的HRP标记山羊抗人IgG抗体，37℃结合 45min。PBST洗涤5次，加入TMB显色液，室温静置显色10min后按100μl/孔加入2M H₂SO₄终止；酶标仪检测450nm波长的光吸收值(以595nm为对照波长)，Graphd Prism Software 5.0 绘制抗体浓度-吸光值(OD)曲线，并计算半数最大有效浓度(EC50)。

按照上述方法将AET2010替换为抗TIGIT单克隆抗体MK7684作为对照。

ELISA结果表明(图6)，AET2010在一定的浓度范围内与HSA-hTIGIT-His融合蛋白的结合呈剂量依赖关系，EC50值为3ng/ml，对照抗体MK7684的EC50值为2.2ng/ml，两者与HSA-hTIGIT-His重组蛋白的结合活性相当。

2.2细胞ELISA检测AET2010结合活性

1640培养基(含10％FBS)稀释AET2010：起始浓度2.5μg/ml，3倍梯度连续稀释11个浓度，得到不同浓度的抗体稀释液。

消化收集对数生长期的CHO-TIGIT细胞(即实施例1的CHO-TIGIT 2-4)或CHO细胞，用生长培养基调整细胞密度至1×10⁵Cells/ml，按100μl/孔接种至96孔细胞培养板，37℃、5％CO₂孵箱培养至细胞铺满孔板。按120μl/孔加入1640培养基(含10％FBS)，冰上封闭1h；96孔板弃液，加入经封闭后的抗体稀释液，冰上结合2h；弃液，冰上预冷的1640培养基(含10％FBS)洗涤3次，按100μl/孔加入1640培养基(含10％FBS)稀释的HRP标记山羊抗人 IgG抗体，冰上结合1h；弃液，预冷的1640培养基(含10％FBS)洗涤3次，PBS洗涤2次，按100μl/孔加入TMB显色液，室温静置显色10-20min后按100μl/孔加入2M H₂SO₄终止；酶标仪检测450nm波长的光吸收值(以595nm为对照波长),Graphd Prism Software 5.0 绘制抗体浓度-吸光值(OD)曲线，并计算半数最大有效浓度(EC50)。

按照上述方法将AET2010替换为抗TIGIT单克隆抗体MK7684作为对照。

2.3流式细胞检测AET2010结合活性

流式细胞仪为BD C6 plus。消化收集对数生长期的CHO-TIGIT或CHO细胞，用生长培养基调整细胞密度至5×10⁶Cells/ml，按100μl/份等分成若干份；预冷的1640培养基稀释 AET2010和MK7684：起始浓度1μg/ml，3倍梯度连续稀释10个梯度，与细胞样品等体积混合后于4℃孵育2h；每个样品中加入1ml预冷的1640培养基(含10％FBS)，轻轻上下颠倒4-6次，4℃、1000rpm、离心5min，弃上清，重复洗涤三次；预冷的1640培养基(含10％FBS) 稀释FITC标记的山羊抗人IgG抗体，并按200μl/样品液重悬细胞，于4℃孵育1h；洗涤3 次后，100μl预冷的1640培养基(含10％FBS)重悬细胞，流式细胞仪上样分析，Graphd PrismSoftware 5.0绘制抗体浓度-平均荧光强度(MFI)曲线,并计算半数最大有效浓度(EC50)。

按照上述方法将AET2010替换为抗TIGIT单克隆抗体MK7684作为对照。

细胞ELISA(图7)及流式细胞术(图8)的检测结果表明，AET2010可与CHO-TIGIT细胞表面TIGIT高效结合，呈现良好的剂量依赖性，其EC50与对照抗体MK7684相当；其中AET2010和MK7684细胞ELISA的EC50分别为3.9ng/ml和8.8ng/ml，流式细胞检测的EC50 分别为3.9ng/ml和8.8ng/ml。两者与细胞表面天然状态TIGIT的结合活性相当。

2.4 SPR测定AET2010亲和力

基于BIAcore 3000系统，采用Human Antibody Capture Kit(美国GEHealthcare, BR-1008-39)将捕获抗体偶联至CM5芯片表面，多循环动力学(Multi-cyclekinetics)方法测定抗体-抗原相互作用的动力学参数。纯化后的AET2010或MK7684用HBS-EP缓冲液(美国GE Healthcare)稀释至1μg/mL，5μl/min×1min捕获固定于芯片表面。重组蛋白 TIGIT-His(北京义翘神州生物技术有限公司，10917-H08H)抗原作为流动相，浓度范围120nM～1.875nM；HBS-EP+缓冲液按2倍梯度连续稀释待测抗体，至少5个稀释度。测试条件为25℃、 30μl/min；结合3min，解离6min。设置一个循环的重复测量进行质控，设置两个循环的空白对照以校正系统偏差。再生条件为3M MgCl₂、30μl/min×30s。采用BIAevaluation Software 进行结果分析，选择1：1Langmuir结合模式拟合数据，计算抗原抗体结合的动力学常数；关键数据进行三次重复独立测量，结果以“平均值±标准差”表示。

检测所得代表性动力学传感图如图9所示，三次独立重复测量拟合结果的平均值如表3 所列。AET2010的亲和力常数K_D为3.74±0.12nM，MK7684的亲和力常数K_D为0.11±0.02nM。 MK7684与重组TIGIT-His的亲和力远高于AET2010，约为34倍。

需要特别说明的是，SPR实验采用的是固定抗体的模式，所测结果为抗体的单臂结合能力，即亲和力(affinity)。而前述ELISA、细胞ELISA和流式检测时，则采用的是固定抗原 (或细胞)的模式，所测结果体现的是抗体的双臂结合能力，即亲合力(avidity)。两种形式的结果可以看出，固定抗体AET2010在亲和力远低于MK7684的情况下，固定抗原下其亲合力与MK7684相当；可以推测，表位恰当的情况下，AET2010将具有较为良好的功能活性。

表3、BIAcoreTM 3000测定抗体与TIGIT相互作用亲和力结果

2.5 ELISA检测AET2010的结合特异性

PBS稀释抗原hTIGIT-HIS、mTIGIT-HIS、hCSF1R-HIS、hTFRC、hLAG3、hCD73、hCD38、hNectin蛋白至1μg/ml，按100μl/孔加入96孔酶联板，每种抗原设置3个复孔，并利用 PBS、2％BSA与0.5CASIN作为对照，4℃包被过夜；弃包被液，PBS牛奶封闭96孔板；PBST 牛奶稀释封闭AET2010至10μg/ml，按100μl/孔加入96孔酶联板，37℃结合1h；PBST洗涤5次，按100μl/孔加入HRP标记的山羊抗人IgG抗体稀释液，37℃结合45min；PBST洗涤5次，按100μl/孔加入TMB显色液，室温静置显色10min，按100μl/孔加入2M H₂SO₄终止；酶标仪检测450nm波长的光吸收值(以595nm为对照波长)，计算平均吸光值，数据用“平均值±标准差”表示。

结果如图10所示，AET2010特异性高亲和力结合人TIGIT，与鼠TIGIT或其他检测抗原不存在交叉反应。

实施例3、AET2010的阻断活性

一、材料与方法

1.材料：人CD155(HG29682-UT)cDNA克隆载体为北京义翘神州生物技术有限公司产品。蛋白纯化所需HiTrap^TM Q-Sepharose FF阴离子吸附柱为GE公司产品，FITC标记的小鼠抗人 IgG/Fc流式抗体为Biolegend公司产品，HRP标记的山羊抗人IgG/Fc抗体为北京百新意生物科技有限公司产品。同型对照抗体(C103S)为北京义翘神州生物技术有限公司产品。其他涉及材料来源同实施例1、2。

2.方法：

2.1 AET2010-Fab、MK7684-Fab以及CD155-Fc重组蛋白的制备

抗体Fab段重链表达载体为不含CH2和CH3基因序列的pABG载体，其名称为pABG-Fab (图1，其序列为序列表中SEQ ID NO.22)，拟制备的AET2010-Fab(即AET2010的Fab抗体)和MK7684-Fab(即MK7684的Fab抗体)重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO.10的第1-221位和SEQ ID NO.12的第1-222位。通过PCR扩增和酶切位点Afl II与Nhe I，将AET2010 和MK7684可变区(VH)基因克隆到抗体Fab重链表达载体pABG-Fab中，将得到的表达 AET2010-Fab重链氨基酸的重组载体记为pABG-Fab-AET2010，将得到的表达MK7684-Fab重链氨基酸的重组载体记为pABG-Fab-MK7684。pABG-Fab-AET2010含有SEQ ID NO.8的第1-663 位所示的AET2010-Fab重链氨基酸的编码基因，pABG-Fab-MK7684含有SEQ ID NO.14的第 1-666位所示的MK7684-Fab重链氨基酸的编码基因。

pABG-Fab-AET2010为将pABG-Fab的Afl II与Nhe I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID NO.8的第1-354位所示的DNA片段得到的重组载体。pABG-Fab-MK7684为将pABG-Fab的Afl II与Nhe I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID NO.14的第1-666位所示的DNA片段得到的重组载体。

将pABG-Fab-AET2010与实施例1的AET2010的轻链表达载体按摩尔比1:1混合后共转染状态良好的FreeStyle^TM293-F细胞，于37℃、120rpm、5％CO₂水平摇床摇瓶培养3～4天，高速离心收集表达上清，超滤浓缩到一定体积后经HiTrap^TM Desalting Columns脱盐柱将缓冲体系置换为PH5.8 PBS；经HiTrap^TM Q-Sepharose FF阴离子吸附柱对其进行纯化，收集含有 Fab的流穿液，并用脱盐柱置换到PH7.4 PBS缓冲液中，得到AET2010-Fab。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，分光光度计定量蛋白浓度。

按照上述方法利用pABG-Fab-MK7684与实施例2的MK7684的轻链表达载体制备MK7684-Fab。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，分光光度计定量蛋白浓度。

拟制备的人CD155胞外域与人IgG1 Fc片段融合蛋白(hCD155-Fc)的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。以CD155的cDNA克隆载体和pABG分别为模板，以表4所列引物PCR扩增CD155 胞外域基因和Fc段基因，拼接PCR融合CD155和Fc基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收正确的目的条带，通过EcoR I和BamH I两个酶切位点将目的基因克隆到表达载体pABG中，将得到的序列正确的重组载体记为pABG-hCD155-Fc，pABG-hCD155-Fc含有SEQ ID NO.16所示的 hCD155-Fc编码基因，能表达SEQ ID NO.15所示的hCD155-Fc。

将pABG-hCD155-Fc转染状态良好的FreeStyle^TM293-F细胞，于37℃、120rpm、5％CO₂水平摇床摇瓶培养3～4天，高速离心收集表达上清。基于AKTA系统，采用HiTrap^TMMabSelect SuRe预装柱进行亲和纯化，0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱收集样品，HiTrap^TM Desalting Columns脱盐柱将纯化的蛋白置换到PH7.4 PBS缓冲液中，得到hCD155-Fc。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，分光光度计定量蛋白浓度。

表4、CD155-Fc表达载体构建所用引物列表

Fab抗体的SDS-PAGE鉴定结果如图11所示，在还原条件下，AET2010-Fab、MK7684-Fab 大小约为25KD，分子量大小符合预期，且条带清晰、纯度较高。hCD155-Fc的SDS-PAGE鉴定结果如图3所示，在还原条件下，分子量大小约为75KD，符合预期，且条带清晰、纯度较高。

2.2流式细胞术检测抗体对CD155结合TIGIT的阻断活性

消化收集对数生长期的CHO-TIGIT细胞(即实施例1的CHO-TIGIT 2-4)，生长培养基调整细胞密度至5×10⁶Cells/ml，按100μl/份等分成若干份。1640培养基(含10％FBS)稀释AET2010-Fab：起始浓度3.2μM，2倍梯度连续稀释6个梯度，得到抗体稀释液；每个浓度的抗体稀释液取等体积(均为50μl)加入等体积的hCD155-Fc，得到蛋白混合液，所得蛋白混合液中hCD155-Fc的浓度均为400nM。将蛋白混合液与对应细胞样品混合，4℃孵育2h；每个样品中加入1ml 1640培养基(含10％FBS)，轻轻上下颠倒4-6次，4℃、1000rpm、离心5min，弃上清，重复洗涤三次；每个样品加入200μl 1640培养基(含10％FBS)稀释的 FITC标记的山羊抗人IgG/Fc抗体液重悬细胞，4℃孵育1h；洗涤3次，100μl 1640培养基 (含10％FBS)重悬细胞，流式细胞仪上样检测各组MFI。

按照上述方法将hCD155-Fc替换为同型对照抗体作为阴性对照。设置不添加AET2010-Fab 的CD155-Fc为阳性对照。

计算阻断率，阻断率＝(MFI_实验组-MFI_{阴性对照组})/(MFI_{阳性对照组}-MFI_{阴性对照组})×100％。绘制抗体Fab浓度-阻断率曲线，确定抗体Fab对TIGIT/CD155-Fc相互作用的阻断活性。

按照上述方法将AET2010-Fab替换为MK7684-Fab，检测MK7684-Fab的阻断活性。

结果如图12所示，AET2010-Fab与MK7684-Fab均可在一定浓度范围内有效阻断hCD155-Fc与细胞表面天然状态TIGIT的结合，阻断率呈剂量依赖关系；且AET2010-Fab与MK7684-Fab的阻断率相当。

2.3 ELISA检测抗体对CD155结合TIGIT的阻断活性

PBS稀释HSA-hTIGIT-His重组蛋白至1μg/ml，按100μl/孔加入96孔酶联板，4℃包被过夜。弃包被液，PBS牛奶、37℃封闭1h。PBST牛奶梯度稀释AET2010-Fab：起始浓度3.0 μM，2倍梯度连续稀释11个梯度；于每个浓度中加入等体积(均为50μl)的重组hCD155-Fc，得到蛋白混合液，所得蛋白混合液中hCD155-Fc的浓度均为400nM，封闭后将蛋白混合液加入96孔板中，37℃结合1h；PBST洗涤5次，按100μl/孔加入PBST牛奶(含2.5％脱脂奶粉的PBST)稀释的HRP标记山羊抗人IgG抗体。后续洗涤、显色、光吸收值检测步骤同实施例 2中2.1。Graphd Prism Software 5.0绘制Fab蛋白浓度-光吸收值(OD)曲线，并计算半数最大抑制浓度(IC50)。

按照上述方法将AET2010-Fab替换为MK7684-Fab，检测MK7684-Fab的半数最大抑制浓度。

结果如图13所示，AET2010-Fab与MK7684-Fab均可在一定浓度范围内有效阻断CD155-Fc 与重组HSA-hTIGIT-His的结合，且呈剂量依赖关系；AET2010-Fab与MK7684-Fab的IC50值分别为26.22和48.18nM，二者相当。

实施例4、AET2010的抗原表位

一、材料与方法

1.材料：分子模拟软件采用Discover Studio 3.0(简称DS 3.0)。forteBIO^TM Octet QK^e系统，配套Snesor为北京托普生物科技有限公司产品。Dpn I酶为NEB公司产品；其余材料同前述实施例。

2.方法：

2.1 AET2010与TIGIT复合物结构模型的预测与分析

2.1.1同源模建构建AET2010可变区结构模型

在PDB数据库Blast搜索AET2010的同源序列，选择轻重链同源性均较高的序列和结构作为同源模板，采用DS 3.0Homology Modeling模块中的Build Homology Models功能进行同源模建，并采用Loop Refinement(MODELER)对抗体的轻重链CDR3进行优化；通过经验检视，并结合“残基的环境匹配得分(Profile-3D)”及“拉氏图(Rarmchandran Plot)”评价优化模型的结构合理性。

2.1.2分子对接构建抗原-抗体复合物结构模型

AET2010可变区结构为2.1.1所述同源模建结果，TIGIT结构来源于PDB:3UCR；根据阻断实验结果和抗体特征，对相互作用表位范围进行限定；采用DS 3.0 Dock Proteins模块中 Dock Proteins(ZDOCK)对接TIGIT与AET2010，构建复合物结构模型，并对结果进行聚类分析和ZDock、ZRank评分；采用DS 3.0 Dock Proteins模块中Refine Dock Proteins(RDOCK) 对优选聚类进行优化，并根据ZDock Score和ZRank Score打分值，结合经验检视，确定最终的AET2010/TIGIT复合物结构模型，并基于对复合物结构模型的分析确定相互作用界面残基(抗体可变区序列位点编号采用Kabat规则，参见Kabat等,J Immunol 1991,147:1709-19)。

2.2 HSA-hTIGIT-His及AET2010丙氨酸扫描及突变体表达载体的构建、表达及纯化

根据预测结果，将直接参与AET2010/TIGIT相互作用的界面残基突变为丙氨酸。以实施例1的HSA-hTIGIT-His表达载体(pABG-HSA-hTIGIT-His)和AET2010的重链、轻链表达载体作为模板，设计定点突变引物如表5所列，采用定点突变PCR方法构建突变体的表达载体。测序正确的突变质粒转染FreeStyle^TM 293-F细胞进行突变抗体以及突变抗原的表达。SDS-PAGE鉴定纯化后突变体的纯度，分光光度计定量突变体浓度。

表5、HSA-hTIGIT-His与AET2010丙氨酸扫描突变体构建引物列表

注：表5的“突变体名称列”中，数字表示原蛋白的突变位置，数字前一个字母为突变前氨基酸，数字后一个字母表示突变后氨基酸。

2.3 forteBIO^TM系统检测突变体结合活性的变化

首先检测HSA-hTIGIT-His突变体与AET2010结合活性的变化情况。利用HBS-EP+缓冲液分别稀释AET2010、HSA-hTIGIT-His亲本及其突变体至100nM，按程序设计加入检测用96孔板的相应位置，200μL/孔。执行Baseline >Loading>Baseline>Asscociation>Disassociation流程，采用AHC(Anti-Human IgG Conjugated)Biosensor捕获固定AET2010，设置Asscociation时间为3min，Disassociation 时间为6min。结果采用DataAnalysis分析软件进行处理与拟合，得到AET2010与 HSA-hTIGIT-His突变体的亲和力常数K_D，并与亲本HSA-hTIGIT-His进行比较。

随后检测AET2010突变体与HSA-hTIGIT-His结合活性的变化情况。利用HBS-EP+缓冲液分别稀释HSA-hTIGIT-His、AET2010亲本及突变体至100nM，按程序设计加入检测用96孔板的相应位置，200μL/孔。采用AHC(Anti-Human IgG Conjugated)Biosensor，执行Baseline>Loading>Baseline程序，逐个捕获待测抗体至目标响应值(RU)。执行Baseline >Asscociation>Disassociation流程，实时检测待测抗体与HSA-hTIGIT-His相互作用的动力学特征，Asscociation时间为3min，Disassociation时间为6min。结果采用DataAnalysis 分析软件进行处理与拟合，得到AET2010及其突变体与HSA-hTIGIT-His的亲和力常数K_D，并进行比较。

其中，AET2010突变体为将表5中的AET2010轻链的三个突变体分别与AET2010重链组合、或将AET2010的轻链与AET2010重链的两个突变体进行组合得到的突变抗体。

二、结果

1.AET2010/TIGIT复合物结构模型与相互作用的预测结果

Blast搜索确定AET2010可变区的同源模板为PDB:6A3W(分辨率为)的A链和B链，其与AET2010序列一致性为83.6％，序列相似性为89.8％，同源模建初步构建了5个AET2010 可变区结构模型，对排序最优模型的CDR区进行优化，获得5个优化模型，经验检视并结合 Profile-3D评分及结构拉氏图(Rarmchandran Plot)情况，得到结构合理、质量可靠的AET2010 可变区结构模型。

AET2010可变区结构模型与TIGIT(来源于PDB:3UCR，分辨率为)的分子对接产生了2000个复合物构象(Pose)，并对其进行了聚类分析和ZDock、ZRank评分。对容量(Cluster Size)最大的十个聚类的中心构象(Cluster Center)相互作用特征进行经验检视，发现，容量最大的聚类(即Cluster 1)中两个对接分子的构象也较为合理。进一步地，采用Refine Dock Proteins(RDOCK)对Cluster1的全部构象进行结构优化。依据各构象的ZDock Score 和ZRank Score评分值进行三维作图(3D Point Plot)；对ZDock Score≥42且ZRank Score≤-50构象的结构进行经验检视，并参考E_RDOCK值，最终确定优化后的Pose152为 AET2010/TIGIT复合物对接模型，结果如图14中A所示；直接参与相互作用的氨基酸残基分布情况如图14中B和表6所示。

表6、AET2010/TIGIT复合物结构模型相互作用界面残基与氢键

注：分析时，氢键相互作用的原子间距离标准为

2.丙氨酸扫描验证复合物结构模型

对前述预测的相互作用界面残基进行丙氨酸替换获得的突变体。forteBIO^TM系统测定亲和力变化的统计结果如表7所列，AET2010轻链的Y32、E50和K91以及TIGIT的Q56位点替换成丙氨酸后对结合活性影响较大，提示这些位点在相互作用中具有重要作用，也一定程度上验证了模型的可靠性。

表7、TIGIT和AET2010突变体的亲和力变化评估结果

注：“-”表示亲和力下降2-10倍，“--”表示亲和力下降10-100倍，“---”表示亲和力完全丧失，“+/-”表示亲和力变化在2倍以内。

根据复合物结构模型(图14)，可以看出，AET2010对TIGIT的结合表位覆盖了TIGIT分子表面的“锁-钥”(Lock-Key)区域，即CD155的互补结合区；解释了AET2010具有良好阻断活性的分子机制。

实施例5、AET2010的稳定性与药动学特征

一、材料与方法

1.材料：BALB/c裸小鼠(雄性，18-22d)为维通利华公司产品，驴抗人IgG/Fc单抗为Sigma公司产品，胎牛血清为Gibco产品。其它涉及材料来源同前述实施例。

2.方法：

2.1放置加速实验评价AET2010的体外稳定性

无菌条件下，0.22μm滤膜过滤AET2010除菌，无菌PBS或胎牛血清(FBS)稀释AET2010 至15μg/ml；密封后于37℃温箱放置，分别在第0天、1天，3天、7天、10天及14天取出样品，冻存于-20℃以备检测。按照前述实施例的ELISA方法检测各时间点抗体的结合活性：包被HSA-hTIGIT-His，各时间点AET2010待测样品以0.05μg/ml为起始浓度，2倍梯度连续稀释8个梯度。

2.2 AET2010结构稳定性评价

采用Unchained Labs公司的高通量蛋白质稳定性分析系统Uncle检测抗体的热稳定性。纯化后的AET2010样品1.85mg/ml上机检测：采用Tm&Tagg with optional DLS程序，温度区间设定为25-95℃，样品设置一个复孔。通过分析结果参数Tm(蛋白熔解温度)、Tagg266 (蛋白聚集温度)、Tagg473、Z-Ave.Dia(蛋白平均直径)、PDI(粒度分散系数)、Pk1.Mode Dia(溶液中主要蛋白成分水化动力学直径)、Pk1 Mass％(PK1比例)、Pk2.ModeDia(溶液中其他蛋白成分水化动力学直径)、Pk2 Mass％(PK2比例)9个参数，多角度分析蛋白粒度、粒度分布和热稳定性。

2.3 AET2010药动学特征的初步评价

BALB/c裸小鼠(雄性，18-22d)，单次尾静脉注射AET2010，150μg/只，每组3只。注射后第1、3、6、12、24、48、72、96、144、192尾静脉采血并收集血清，-20℃储存以备检测。利用ELISA定量检测各时间点血清中抗体含量：分别包被HSA-hTIGIT-His和驴抗人IgG/Fc 单抗，各时间点血清样本按2倍梯度连续稀释6个梯度(1、3、6、12小时样品的起始稀释度为1:10000，24、48、72、96小时样品的起始稀释度为1:5000，144、192小时样品的起始稀释度为1:2000)，以预留的浓度为500μg/ml的样品为标准品绘制标准曲线。检测并计算各时间点AET2010血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线，初步评价AET2010的药动学特征。

二、结果

1.AET2010的稳定性

放置加速实验结果如图15所示，在PBS(图15中A)和FBS(图15中B)中于37℃放置的AET2010到第14天仍具有几乎不降低的结合活性，显示了良好的放置稳定性。

25℃条件下Uncle粒度检测结果如图16，AET2010样品的平均粒度为79.12nm，粒度分散系数PDI在0.1到0.2之间，表明有轻微聚集；主要蛋白成分水化动力学直径(Pk1 ModeDia.)为10.41nm，属于单抗常规粒径范围；且质量分布为单峰，主要粒径成分质量占比(Pk1Mass(％))为100％，提示聚集峰质量占比可忽略。

Uncle稳定性检测结果如表8所列，AET2010具有较高的溶解温度和热聚集温度，提示其具有良好的结构稳定性。

表8、Uncle检测AET2010稳定性结果

2.AET2010的初步药动学特征

AET2010在裸鼠体内的药动学特征检测结果如图17所示，未见明显异常特征，也进一步证实了AET2010的稳定性。

实施例6、AET2010的体外功能评价

一、材料

NK-92MI细胞为武汉普诺赛生命科技有限公司产品，人肺腺癌细胞A549、人表皮癌A431 细胞及人胶质瘤细胞U251MG。α-MEM培养基、胎牛血清为为Gibco公司产品，RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、马血清为中生奥邦公司产品。穿孔素、干扰素γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA检测试剂盒均为Elabscience公司产品，CCK8试剂为日本同仁化学株式会社产品，PE标记的小鼠抗人CD155(337609)、APC标记的小鼠抗人PD-1(329907) 及PD-L1(329707)流式抗体均为Biolegend公司产品，同型无关对照抗体(抗IFN-α的人 IgG1抗体)为申请人制备保存，制备方法参见专利ZL 201510685200.X中所述GGE突变体的制备方法。其他涉及材料来源同前述实施例。

2.方法：

2.1抗PD-1抗体Nivolumab的制备

Nivolumab(专利号WO2006121168A1)抗体由王双博士惠赠，由轻链和重链组成。其轻重链载体的构建方法与实施例2中MK7684轻重链载体的构建相同，轻链载体为pABK，重链载体为pABG4(图1，其序列为序列表中SEQ ID NO.23)。表达纯化方法与AET2010或MK7684亦一致。其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示(第1位氨基酸为载体分泌信号肽的一部分，获得的抗体产物不含此氨基酸)，基因编码序列如SEQ ID NO.18所示；其重链氨基酸序列如 SEQ ID NO.19所示(第1-4位氨基酸为载体分泌信号肽的一部分，获得的抗体产物不含此4 个氨基酸)，基因编码序列如SEQ ID NO.20所示。

其中，Nivolumab的轻链表达载体为将pABK表达载体的Xba I和Nar I间的识别序列替换为SEQ ID NO.18的第1-332位所示的轻链可变区基因得到的重组载体，该重组载体含有 SEQ ID NO.18所示的轻链基因，能表达SEQ ID NO.17的第2-215位所示的Nivolumab的轻链。

Nivolumab的重链表达载体为将pABG4表达载体的Afl II和Nhe I间的识别序列替换为 SEQ ID NO.20的第1-351位所示的重链可变区基因得到的重组载体，该重组载体含有SEQ ID NO.20所示的重链基因，能表达SEQ ID NO.19的第5-444位所示的Nivolumab的重链。

2.2肿瘤细胞表面CD155与PD-L1表达情况检测

消化收集对数生长期的A549、A431和U251MG细胞，调整细胞密度至3×10⁵cells/test，冰上与PE标记的小鼠抗人CD155(5μl/test)或APC标记的小鼠抗人PD-L1(5μl/test)结合1h，每组设置3个复孔，并设置不加抗体作为空白对照组，结合完成后利用DMEM培养基(含10％FBS)洗涤2次，流式细胞仪检测，根据平均荧光强度确定细胞表面CD155或PD-L1 表达水平。

2.3NK-92MI细胞表面TIGIT与PD-1表达情况检测

收集对数生长期的NK-92MI细胞并调整细胞密度至3×10⁵/test，冰上与APC标记的小鼠抗人TIGIT抗体(5μl/test)或PD-1抗体(5μl/test)结合1h，每组设置3个复孔，并设置不加抗体作为空白对照组，利用DMEM培养基(含10％FBS)洗涤2次，流式细胞仪检测，根据平均荧光强度确定NK-92MI细胞表面TIGIT与PD-1表达情况。

2.4细胞杀伤实验与抗体功能评价

以A549、A431和U251MG三种肿瘤细胞作为靶细胞，NK-92MI作为效应细胞，开展体外杀伤实验，并以此评价抗体的功能活性。

状态良好的靶细胞按5×10³Cells/ml×100μl/孔接种于96孔板，培养24～48h至其长满。利用DMEM培养基(含10％胎牛血清)稀释AET2010：起始浓度为200μg/ml，2倍梯度连续稀释6个梯度，按50μl/孔加入96孔板相应位置；生长培养基调整状态良好的效应细胞至特定密度，按50μl/孔加入96孔板相应位置；采用的效靶(E:T)比例分别为1:1(NK-92MI：A549)，2：1(NK-92MI：A431)和0.25:1(NK-92MI：U251MG)；每个实验条件设置3个复孔，并设置单独的靶细胞对照孔和效应细胞对照孔(同样经历后续的吸取上清和洗涤步骤，相当于空白培养基对照)；以无关人IgG1抗体作为同型对照(阴性)，MK7684作为阳性对照，并按同等条件稀释。细胞培养箱静置5-12h(A549、A431为12h，U251MG为5h)，吸取上清转移至96孔深孔板，1500rpm离心15min，取上清用于穿孔素、TNF-α、IFN-γ等杀伤性细胞因子水平的定量检测。检测方法利用相应的ELISA检测试剂盒。

前述吸取上清后的96孔细胞培养板用PBS洗涤两次，利用DMEM培养基(含10％胎牛血清)稀释CCK8试剂至其终浓度为10％并按100μl/孔加入，37℃细胞培养箱静置2.5h，酶标仪测定450nm波长吸光值(595nm为参考波长)，并计算细胞杀伤率：细胞杀伤率＝[1-(实验组吸光值-效应细胞对照组吸光值)/(靶细胞对照组吸光值-空白培养基吸光值)]×100％；绘制浓度-杀伤率曲线，计算EC50值。

对于TIGIT和PD-1双阳性的靶细胞U251MG，在前述基础上再设置抗PD-1抗体Nivolumab 单用组以及与AET2010、MK7684分别等比联用组，AET2010的浓度与上文相同，MK7684的浓度同AET2010。

二、结果

1.细胞表面分子的流式检测结果

如图18中A所示，靶细胞A549、A431及U251MG细胞表面CD155阳性率均在99％以上；如图18中B所示，U251MG细胞表面PD-L1阳性率在90％以上，而A549和A431细胞表面PD-L1阳性率较低。如图18中C和D所示，效应细胞NK-92MI表面TIGIT与PD-1两种抑制性受体的阳性率分别为21.1％和19.7％；由此推测，前述靶细胞对NK-92MI的杀伤会有一定程度的抑制效果，通过阻断抗体的添加，能够促进和强化NK-92MI的杀伤活性，进而评价相关抗体的功能活性。

2.AET2010对NK-92MI细胞体外杀伤肿瘤细胞活性的影响

杀伤性细胞因子的检测结果如图19-21所示，与无关人IgG1抗体对照(同型对照抗体) 相比，AET2010和MK7684能在一定浓度范围内提高NK-92MI细胞释放穿孔素、TNF-α的IFN-γ的水平，差异具有统计学意义。

杀伤实验的结果如图22所示，与同型无关对照抗体相比，AET2010和MK7684可在一定浓度范围内提升NK-92MI细胞对肿瘤细胞的杀伤率，且呈现剂量依赖关系。对于A549细胞(A)， AET2010和MK7684对应的EC50值分别为30.70μg/ml和27.43μg/ml；对于A431细胞(B)，AET2010和MK7684对应的EC50值分别为24.93μg/ml和24.25μg/ml；对于U251MG细胞(C)，AET2010和MK7684对应的EC50值分别为23.70μg/ml和29.94μg/ml，两者对NK-92MI细胞体外杀伤肿瘤细胞活性的促进作用相当。

同时，对于CD155和PD-L1双阳性的U251MG细胞，AET2010、MK7684与Nivolumab的联用对NK-92MI杀伤活性的促进作用也明显强于单用的情况(图C)；相应杀伤性细胞因子的释放水平也得到显著提升(图21)。

在抗体浓度为100μg/ml时，AET2010与Nivolumab的联用对U251MG的杀伤率为72.52 ±0.05％，MK7684与Nivolumab的联用对U251MG的杀伤率为70.12±2.60％；在抗体浓度为 200μg/ml时，AET2010与Nivolumab的联用对U251MG的杀伤率为71.56±0.10％，MK7684与 Nivolumab的联用对U251MG的杀伤率为70.02±0.58％。

实施例7、AET2010的体内药效评价

一、材料与方法

1.材料：BALB/c裸小鼠(雄性，4周龄)为维通利华公司产品，其他实验材料同前述实施例。

2.方法：4周龄Balb/c裸小鼠(N＝20)背部皮下接种A549肿瘤细胞(5×10⁶cells/100μl/ 只)，定期观察肿瘤生长情况，并测量瘤体积(V＝长径×短径²/2)。待肿瘤生长至300±100mm³时，随机分组成四组，每组5只，3个实验组和1个对照组。各组按照如下方式给药：AET2010 实验组经尾静脉过继注射NK-92MI细胞(1×10⁷cells/200μl/只)以及AET2010(300μg/ 只)，MK7684实验组经尾静脉过继注射NK-92MI细胞(1×10⁷cells/200μl/只)以及MK7684 (300μg/只)，无关抗体实验组经尾静脉过继注射NK-92MI细胞(1×10⁷cells/200μl/只) 以及同型无关对照抗体(抗IFN-α的人IgG1抗体)(300μg/只)；对照组经尾静脉注射PBS 缓冲液(200μl/只)。治疗给药频次为5天一次。实验期间，每周定期观察并记录小鼠存活状态，测量并记录肿瘤体积，绘制肿瘤生长(肿瘤体积-时间)曲线。治疗开始后第30天或小鼠肿瘤体积超过2000m³时对小鼠施以安乐死，取瘤块，称重并拍照。

二、结果

以皮下接种A549细胞的CDX小鼠模型为研究对象，通过过继输注NK-92MI细胞并施以抗体药物治疗，评价抗体在体内促进NK-92MI活性进而杀伤肿瘤的效果，以此模型初步明确抗体的体内药效。实验过程中，PBS对照组小鼠在第20天肿瘤体积超过2000mm³时予以处死；实验组于实验终点(治疗开始后第30天)处死小鼠并取瘤称重。结果如图23-24所示，相较于同型对照抗体，AET2010与MK7684对肿瘤生长具有显著的抑制作用(P＜0.0001)，且二者的抗肿瘤效果相当。

AET2010在过继输注NK-92MI细胞的CDX小鼠模型体内显示出增强的抗肿瘤活性，预期了其潜在的药效特征。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 人源抗人TIGIT抗体及其应用

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser

20 25 30

Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr

35 40 45

Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu

50 55 60

Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys

65 70 75 80

Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu

85 90 95

Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro

100 105 110

Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser

115 120 125

Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe His His His His His His

130 135 140

<210> 2

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

atggatttcg gcctgagcct ggtgttcctg gtgctgatcc ttaagggcgt gcagtgcatg 60

atgacaggca caatagaaac aacggggaac atttctgcag agaaaggtgg ctctatcatc 120

ttacaatgtc acctctcctc caccacggca caagtgaccc aggtcaactg ggagcagcag 180

gaccagcttc tggccatttg taatgctgac ttggggtggc acatctcccc atccttcaag 240

gatcgagtgg ccccaggtcc cggcctgggc ctcaccctcc agtcgctgac cgtgaacgat 300

acaggggagt acttctgcat ctatcacacc taccctgatg ggacgtacac tgggagaatc 360

ttcctggagg tcctagaaag ctcagtggct gagcacggtg ccaggttcca ccatcaccac 420

catcat 426

<210> 3

<211> 739

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Leu Gly Gly Gly Gly Ser Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly

610 615 620

Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu

625 630 635 640

Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp

645 650 655

Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro

660 665 670

Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu

675 680 685

Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His

690 695 700

Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu

705 710 715 720

Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe His His His His His

725 730 735

His His His

<210> 4

<211> 2217

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttaggt ggaggcggta gcatgatgac aggcacaata 1860

gaaacaacgg ggaacatttc tgcagagaaa ggtggctcta tcatcttaca atgtcacctc 1920

tcctccacca cggcacaagt gacccaggtc aactgggagc agcaggacca gcttctggcc 1980

atttgtaatg ctgacttggg gtggcacatc tccccatcct tcaaggatcg agtggcccca 2040

ggtcccggcc tgggcctcac cctccagtcg ctgaccgtga acgatacagg ggagtacttc 2100

tgcatctatc acacctaccc tgatgggacg tacactggga gaatcttcct ggaggtccta 2160

gaaagctcag tggctgagca cggtgccagg ttccaccatc accaccatca tcaccat 2217

<210> 5

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc 60

acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt 120

caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc 180

tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag 240

gatgaggcgg actattactg ctcggcgaag gatgccagct ttaattctgt gtttggcggt 300

ggcaccaaac tgaccgtgct gggcagcggc ggctcgacca taacttcgta taatgtatac 360

tatacgaagt tatcgagctc gggcagcgaa gttcaactgg ttcaaagtgg tgcggaagtg 420

aagaaaccgg gcgaaagtct gaaaattagt tgcaaaggct ctggttattc ttttacgtct 480

tattggatcg gctgggttcg tcagatgccg ggtaaaggtc tggaatggat gggtattatt 540

tatccgggtg atagtgatac gcgttattct ccgagttttc agggtcaggt tactattagt 600

gcagataaaa gcatcagcac cgcgtatctg cagtggagtt ctctgaaagc gagtgatacc 660

gcgatgtatt attgcgcacg tgctgcgtgg tggcaggggt ttgatcactg gggtcagggc 720

actctggtga ccgtgtcgag c 741

<210> 6

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Lys Asp Ala Ser Phe Asn Ser

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Gly Gly Ser

100 105 110

Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu Ser Ser Ser Gly

115 120 125

Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

165 170 175

Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser

180 185 190

Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Ala Ala Trp Trp Gln Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 7

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc 60

acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt 120

caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc 180

tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag 240

gatgaggcgg actattactg ctcggcgaag gatgccagct ttaattctgt gtttggcggt 300

ggcaccaagc ttaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg 360

ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 420

tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480

gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540

ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600

agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttca 639

<210> 8

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

gaagttcaac tggttcaaag tggtgcggaa gtgaagaaac cgggcgaaag tctgaaaatt 60

agttgcaaag gctctggtta ttcttttacg tcttattgga tcggctgggt tcgtcagatg 120

ccgggtaaag gtctggaatg gatgggtatt atttatccgg gtgatagtga tacgcgttat 180

tctccgagtt ttcagggtca ggttactatt agtgcagata aaagcatcag caccgcgtat 240

ctgcagtgga gttctctgaa agcgagtgat accgcgatgt attattgcgc acgtgctgcg 300

tggtggcagg ggtttgatca ctggggtcag ggcactctgg tgaccgtgtc gagcgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtccccggg taaa 1344

<210> 9

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Lys Asp Ala Ser Phe Asn Ser

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala

115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala

130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr

180 185 190

Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 10

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Ala Trp Trp Gln Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu His Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Phe Gly Ser Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Pro Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 13

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

gacattcaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgca gagccagcga gcacatctac tcctacctgt cctggtacca gcagaaaccc 120

ggcaaagccc caaaactgct gatctacaac gccaagaccc tggccgaagg cgtgcccagc 180

agattctcag gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ctatcagcag cctgcagccc 240

gaagatttcg ccacctacta ctgccagcac cacttcggca gccccctgac cttcggacag 300

ggcaccagac tggagatcaa gagaaccgtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggtaccgct agcgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 14

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

gaggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc caggagccag cgtgaaggtg 60

agctgtaagg ctagtggata cacattcagc agctacgtga tgcactgggt gagacaggcc 120

cctggacagg gactggagtg gattggatat atcgacccct acaatgacgg cgccaagtac 180

gcccagaaat tccagggcag agtgaccctg accagcgaca agagcaccag caccgtgtat 240

atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggagga 300

ccctacggct ggtatttcga tgtgtggggc cagggaacca ccgtgacagt gagtagcgct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1347

<210> 15

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln

1 5 10 15

Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln

20 25 30

Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg

35 40 45

His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro

50 55 60

Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly

65 70 75 80

Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu

85 90 95

Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser

100 105 110

Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr

115 120 125

Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala

130 135 140

Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His

145 150 155 160

Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu

165 170 175

Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser

180 185 190

Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe

195 200 205

Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro

210 215 220

Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn

225 230 235 240

Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly

245 250 255

Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala

260 265 270

Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr

275 280 285

Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu

290 295 300

Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Met

305 310 315 320

Ser Arg Asn Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

325 330 335

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

340 345 350

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

355 360 365

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

370 375 380

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

385 390 395 400

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

405 410 415

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

420 425 430

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

435 440 445

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

450 455 460

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

465 470 475 480

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

485 490 495

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

500 505 510

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

515 520 525

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

530 535 540

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550 555

<210> 16

<211> 1671

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 60

ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 120

gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 180

acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggagt tcgtggcagc cagactgggc 240

gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 300

tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 360

gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 420

gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 480

tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 540

actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 600

tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 660

tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 720

gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 780

acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 840

cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 900

cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 960

tcccgtaacg ctagcgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 1020

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 1080

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1140

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1200

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1260

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1320

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1380

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1440

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1500

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 1560

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1620

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ccccgggtaa a 1671

<210> 17

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro

1 5 10 15

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 18

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

1 5 10 15

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr

20 25 30

Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

35 40 45

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

65 70 75 80

Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 19

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

ggcgagatcg tgctgaccca gtctcctgcc acactgtccc tgtctcctgg agagagagcc 60

acactgtcct gcagagcctc tcagtccgtg tcctcctacc tggcctggta ccagcagaag 120

cctggacagg ctcctcggct gctgatctac gacgcctcca acagagccac aggcatccct 180

gctcggttct ctggctctgg ctctggcaca gacttcaccc tgaccatctc ctctctggag 240

cctgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtcctcca actggcctag gaccttcgga 300

cagggcacca aggtggagat caagcggacc gtggcggcgc catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggtacc gctagcgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 20

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 20

ggcgtgcagt gccaggtgca gctggtggag tctggaggtg gagtggtgca gcctggacgg 60

tctctgagac tggactgcaa ggcctctggc atcaccttct ccaactctgg catgcactgg 120

gtgagacagg ctcctggcaa gggactggag tgggtggctg tgatctggta cgacggctcc 180

aagcggtact acgccgactc cgtgaaggga cggttcacca tctctcggga caactccaag 240

aacaccctgt tcctgcagat gaactccctg agagccgagg acaccgctgt gtactactgc 300

gccaccaacg acgactactg gggacagggc acactggtga ccgtgtcctc cgctagcacc 360

aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600

aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660

cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320

tctctgggta aa 1332

<210> 21

<211> 4735

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 60

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 120

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 180

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 240

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 300

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 360

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 420

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 480

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 540

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 600

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 660

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 720

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt 780

ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 840

ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cgtacattta tattggctca tgtccaatat 900

gcccgggatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat 960

tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 1020

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa 1080

cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact 1140

tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta 1200

aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt 1260

acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg 1320

ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg 1380

ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc 1440

cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt 1500

tagtgaaccg tcagatcctc actctcttcc gcatcgctgt ctgcgagggc cagctgttgg 1560

gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt 1620

cggcctccga acggtactcc gccaccgagg gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg 1680

gaaaacctct cgagaaaggc gtctaaccag tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg 1740

gcgggcggca gcgggtggcg gtcggggttg tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa 1800

ttaaagtagg cggtcttgag acggcggatg gtcgaggtga ggtgtggcag gcttgagatc 1860

cagctgttgg ggtgagtact ccctctcaaa agcgggcatt acttctgcgc taagattgtc 1920

agtttccaaa aacgaggagg atttgatatt cacctggccc gatctggcca tacacttgag 1980

tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaagttta 2040

aacggatctc tagcgaattc gccgccacca tggacttcca ggtgcagatc ttcagcttcc 2100

tgctgatgag cgccagcgtg atcatgtcta gaggccacgt ggcggcgcca tctgtcttca 2160

tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggtaccgc tagcgttgtg tgcctgctga 2220

ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg 2280

gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca 2340

gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca 2400

cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttagggat 2460

cccccgacct cgacctctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 2520

aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt ggtcgagatc 2580

cccgggatct ctagctagag gatcgatccc cgccccggac gaactaaacc tgactacgac 2640

atctctgccc cttcttcgcg gggcagtgca tgtaatccct tcagttggtt ggtacaactt 2700

gccaactgaa ccctaaacgg gtagcatatg cttcccgggt agtagtatat actatccaga 2760

ctaaccctaa ttcaatagca tatgttaccc aacgggaagc atatgctatc gaattagggt 2820

tagtaaaagg gtcctaagga acagcgatgt aggtgggcgg gccaagatag gggcgcgatt 2880

gctgcgatct ggaggacaaa ttacacacac ttgcgcctga gcgccaagca cagggttgtt 2940

ggtcctcata ttcacgaggt cgctgagagc acggtgggct aatgttgcca tgggtagcat 3000

atactaccca aatatctgga tagcatatgc tatcctaatc tatatctggg tagcataggc 3060

tatcctaatc tatatctggg tagcatatgc tatcctaatc tatatctggg tagtatatgc 3120

tatcctaatt tatatctggg tagcataggc tatcctaatc tatatctggg tagcatatgc 3180

tatcctaatc tatatctggg tagtatatgc tatcctaatc tgtatccggg tagcatatgc 3240

tatcctaata gagattaggg tagtatatgc tatcctaatt tatatctggg tagcatatac 3300

tacccaaata tctggatagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc 3360

ctaatctata tctgggtagc ataggctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc 3420

ctaatctata tctgggtagt atatgctatc ctaatttata tctgggtagc ataggctatc 3480

ctaatctata tctgggtagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagt atatgctatc 3540

ctaatctgta tccgggtagc atatgctatc ctcatgcata agctgtcaaa catgagaatt 3600

aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 3660

ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 3720

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 3780

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caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaa 4735

<210> 22

<211> 4708

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22