基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签
阅读说明：本技术 基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签 (Metal label based on rare earth doped nano metal organic framework material ) 是由 刘志周 何良 王彤 南雪燕 白鹏利 王辉 胡玮 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签,该金属标签通过以下方法制备得到：1)制备稀土金属配位物,其结构如下式(Ⅰ)所示：2)制备多孔结构的Ln@ZIF-8纳米颗粒；3)制备Ln@ZIF-8@SiO-2；4)制备NH-2-Ln@ZIF-8@SiO-2；5)制备PEG-Ln@ZIF-8@SiO-2。本发明能将单个颗粒稀土含量提高到10～5-10～6,并进一步在其表面进行SiO-2包覆,提高了稳定性,并进一步采用PEG进行表面修饰,研制成为PEG-Ln@ZIF-8@SiO-2复合纳米颗粒,在可以被质谱流式灵敏检测到的同时还具备良好的生物相容性,合成工艺操作简单。(The invention discloses a metal tag based on a rare earth doped nano metal organic framework material, which is prepared by the following method: 1) preparing a rare earth metal complex having the structure shown in formula (I): 2) preparing Ln @ ZIF-8 nano particles with porous structures; 3) preparation of Ln @ ZIF-8@ SiO 2 (ii) a 4) Preparation of NH 2 ‑Ln@ZIF‑8@SiO 2 (ii) a 5) Preparation of PEG-Ln @ ZIF-8@ SiO 2 . The invention can increase the rare earth content of single particle to 10 5 ‑10 6 And further carrying out SiO on the surface 2 Coating, improving the stability, further adopting PEG to carry out surface modification, and developing into PEG-Ln @ ZIF-8@ SiO 2 The composite nano-particles can be sensitively detected by mass spectrum flow, and simultaneously have good biocompatibility, and the synthesis process is simple to operate.)
技术领域
本发明涉及生物成像技术领域，特别涉及一种基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签。
背景技术
质谱流式细胞术将传统的流式细胞分析方法与质谱检测方法结合在一起，是一种新兴的高通量、多维度单细胞生物检测技术。传统的流式细胞术所采用的的方法是将细胞用荧光染料标记的抗体染色，通过荧光检测器检测荧光信号实现对细胞的识别检测。而质谱流式细胞术是通过稳定的重金属元素标记抗体偶联细胞，进而通过电感耦合等离子体质谱检测金属信号，达到细胞识别的目的。这项技术克服了传统流式细胞术荧光信号重叠，检测通道少的缺点，对同一个细胞最多可同时检测40余项参数，大大提高了检测效率。
尽管有如上所述优点，现行质谱流式检测技术的应用仍有一些需要改进提升的地方，如现在质谱流式所用的检测试剂盒是基于商用的Maxpar metalchelating polymer(MCP)reagents聚合物金属螯合标签，每条聚合物链上大约可以连接20-30个稀土金属原子，在抗体标记过程中每个抗体上可以连接2-3个聚合物链，因此每个抗体上大约只能连接60-90个稀土金属。而质谱只能检测104之一个的金属信号，所以每个细胞上至少要连接上百个抗体才能达到检测效果。另一方面市场上的标签通常是国外进口，价格昂贵，一套标准的试剂盒(含稀土配位聚合物40*100微克，可进行40次标记实验)价格通常在50000人民币以上。
所以，现在需要一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签，该金属标签通过以下方法制备得到：
1)制备稀土金属配位物，其结构如下式(Ⅰ)所示：
2)利用步骤1)制得的稀土金属配位物制备多孔结构的[email protected]纳米颗粒；
3)对[email protected]纳米颗粒进行二氧化硅包覆，制得[email protected]@SiO2；
4)对[email protected]@SiO2进行氨基化改性，制得NH2[email protected]@SiO2；
5)对NH2[email protected]@SiO2进行PEG修饰，制得[email protected]@SiO2，即所述金属标签。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)将2-噻吩甲酰三氟丙酮溶于乙醇中，在搅拌的条件下滴加LnCl3水溶液，滴加完成后加入氨水，调节PH值至9，继续搅拌后加入水，再搅拌；其中，稀土元素Ln为Tb、Tb、Ho、Tm中的任意一种；
1-2)旋转蒸发除去部分乙醇后过滤干燥，将所得固体溶于乙醇，滴加含1,10-菲啰啉的乙醇溶液，滴加完成后加热至沸腾浓缩，冷却后所得固体用热的丙酮和乙醇的混合液重结晶，得到所述稀土金属配位物。
优选的是，丙酮和乙醇的混合液中，丙酮与乙醇的体积比为1:2。
优选的是，所述步骤2)具体包括：
2-1)配制两组溶液：
将2-甲基咪唑、稀土配合物溶于甲醇，得到A溶液；将六水合硝酸锌、溴化十六烷基三甲铵溶于甲醇，得到B溶液；
2-2)将B溶液加入到A溶液中，常温搅拌，产物用乙醇进行离心清洗；最终得到含稀土金属配位物的多孔结构的[email protected]纳米颗粒。
优选的是，所述步骤3)具体包括：
将[email protected]纳米颗粒溶于乙醇中，加入氢氧化钠水溶液搅拌均匀，再加入正硅酸四乙酯，室温下搅拌，得到的产物进行离心，并用乙醇洗涤后干燥，得到[email protected]@SiO2。
优选的是，所述步骤4)具体包括：将[email protected]@SiO2溶解于乙醇中，超声分散，再加入APTES，在室温下搅拌，产物经离心、乙醇洗涤及真空干燥后得到NH2[email protected]@SiO2。
优选的是，所述步骤5)具体包括：将NH2[email protected]@SiO2与PEG溶液混合，再加入EDC与NHS，然后室温下搅拌反应，得到的产物用乙醇和去离子水洗涤，干燥后得到[email protected]@SiO2。
本发还提供一种用于质谱流式细胞术的抗体标签，其通过如上所述的[email protected]@SiO2与单克隆抗体偶联得到。
优选的是，该抗体标签的制备方法包括以下步骤：
a、取[email protected]@SiO2加入到硼酸盐缓冲液中，再加入单克隆抗体、EDC、NHS，37℃下孵育；
b、将步骤a得到的产物用PBS缓冲液在室温条件下进行离心洗涤，得到所述抗体标签。
优选的是，所述单克隆抗体为CD-3、CD-4、CD-8或CD-45。
本发明的有益效果是：
本发明不同于现有的质谱流式聚合物金属螯合标签，巧妙的将稀土金属掺杂到稳定的ZIF-8中空多孔结构中，能将单个颗粒稀土含量提高到105-106，并进一步在其表面进行SiO2包覆，提高了稳定性，并进一步采用PEG进行表面修饰，研制成为[email protected]@SiO2复合纳米颗粒，在可以被质谱流式灵敏检测到的同时还具备良好的生物相容性，合成工艺操作简单，成本较低，能极大降低质谱流式检测试剂的使用成本。[email protected]@Sio2复合纳米颗粒与不同抗体结合后可以特异性识别不同的细胞族群，为可质谱流式在细胞生物学免疫学、血液学、药物筛选研发、临床诊断等方面的研究提供了一种可靠的检测手段。
附图说明
图1为本发明的基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签的合成路线；
图2为本发明的实施例中的[email protected]的透射电镜照片；
图3为本发明的实施例中的[email protected]@SiO2-CD4对T细胞检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签，该金属标签通过以下方法制备得到：
1)制备稀土金属配位物，其结构如下式(Ⅰ)所示：
2)利用步骤1)制得的稀土金属配位物、2-甲基咪唑、甲醇、六水合硝酸锌等原料制备多孔结构的[email protected]纳米颗粒；其中，ZIF-8即2-甲基咪唑锌盐MAF-4，为一种多孔配位聚合物，又称金属有机框架，兼备高孔容、高疏水性、高热稳定性和化学稳定性等特点；
3)以TEOS(正硅酸乙酯)与[email protected]纳米颗粒反应，对[email protected]纳米颗粒进行二氧化硅包覆，制得[email protected]@SiO2；
4)通过APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)对[email protected]@SiO2进行氨基化改性，制得NH2[email protected]@SiO2；
5)对NH2[email protected]@SiO2进行PEG修饰，制得[email protected]@SiO2，即所述金属标签。
该金属标签的合成路线如图1所示。
本发明还提供一种用于质谱流式细胞术的抗体标签，其通过上述的[email protected]@SiO2与单克隆抗体偶联得到。
以下在提供更为具体的实施例，以对本发明做进一步说明。
实施例1
一种基于稀土掺杂纳米金属有机骨架材料的金属标签，该金属标签通过以下方法制备得到：
1、制备稀土金属配位物
本实施例中，镧系稀土元素Ln具体选择为Tb，具体步骤：
1-1、将440mg 2-噻吩甲酰三氟丙酮溶于15mL乙醇中，快速搅拌；
1-2、滴加0.05M的TbCl3水溶液15mL，滴加完成后加入几滴氨水，调节PH值至9；
1-3、搅拌1小时后加入25mL水，再搅拌1小时；
1-4、旋转蒸发除去大部分乙醇后过滤干燥，得固体0.44g；
1-5、将所得固体溶于15ml乙醇，滴加6mL含105mg 1,10-菲啰啉的乙醇溶液，滴加完成后加热至沸腾浓缩，冷却后所得固体用热丙酮/乙醇混合液(体积比1:2)重结晶，得到稀土金属配位物：Tb配合物。
2、制备多孔结构的[email protected]纳米颗粒
2-1、配制两组溶液：
将820mg 2-甲基咪唑、28mg Tb配合物溶于40mL甲醇，得到A溶液；将714mg六水合硝酸锌、72.9mg溴化十六烷基三甲铵溶于40mL甲醇，得到B溶液；
2-2、将B溶液迅速加入到A溶液中，常温搅拌24小时；
2-3、在8000rpm转速下离心15min除去上清液
2-4、所得固体在用乙醇进行离心清洗，以8000rpm离心，持续15min，重复三遍，干燥后得到[email protected]纳米颗粒。
参照图2，为[email protected]的透射电镜照片，[email protected]颗粒尺寸为50纳米左右，尺寸分布均匀。
3、制备[email protected]@SiO2
3-1、将[email protected]纳米颗粒分散于100mL乙醇中，剧烈搅拌；
3-2、用0.1M NaOH溶液调节上述步骤得到的溶液的PH值至8；
3-3、分三次加入20％TEOS(正硅酸四乙酯)的乙醇溶液，每次加入1.2mL，每次间隔半小时；
3-4、室温搅拌18小时，在8000rpm转速下离心15min除去上清液；
3-5、所得固体用乙醇进行离心清洗，以8000rpm离心，持续15min，重复三遍，得到[email protected]@SiO2。
4、制备NH2[email protected]@SiO2
4-1、将[email protected]@SiO2分散于100mL乙醇中，剧烈搅拌；
4-2、加入50μL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，室温搅拌6小时；
4-3、在8000rpm转速下离心15min除去上清液；
4-4、所得固体在用乙醇进行离心清洗，以8000rpm离心，持续15min，重复三遍，真空干燥后得到[email protected]@SiO2。
5、制备[email protected]@SiO2
5-1、将50mgNH2[email protected]@SiO2分散于100mL乙醇中，剧烈搅拌；
5-2、加入100mg PEG(聚乙二醇)溶液(两端带羧基，wt,6000)，搅拌；
5-3、加入EDC与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温搅拌12小时；
5-4、在8000rpm转速下离心15min除去上清液，所得固体最后分别用乙醇和去离子水洗涤，干燥得到[email protected]@SiO2。
其中，通过NH2[email protected]@SiO2可与不同分子量的PEG溶液按不同比例(如1:2，1:3等)混合，从而得到参数不同的NH2[email protected]@SiO2。
实施例2
本实施例提供一种用于质谱流式细胞术的抗体标签，该抗体标签的制备方法包括以下步骤：
取100ug实施例1制得的[email protected]@SiO2加入到50mM、pH为8.2的硼酸盐缓冲液中，再加入单克隆抗体(本实施例中具体选择为CD-45)和作为交联剂的EDC及NHS(浓度均为150gL-1)，37℃下孵育一段时间后，将得到的产物用0.01M PBS(pH 7.4)在室温条件下进行离心洗涤，分散至PBS(0.01M,pH 7.4,0.5％BSA)中，4℃保存备用，即得到该抗体标签([email protected]@SiO2-CD4)。取1uL抗体标签对人外周血单核细胞(106个)进行染色，并用质谱流式细胞仪上机检测。
参照图3，为[email protected]@SiO2-CD4对T细胞检测结果，可以看出[email protected]@SiO2-CD4抗体标签对T细胞可以实现有效分群(左右两个细胞群)，其中标记有CD4抗体的细胞占细胞总数的58.36％。图3中可以理解为：纵坐标给所有细胞做了一个统一标记，然后横坐标用来分群，有159TbCD4的在右边，没有的在左边。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。