生殖系统疾病检测试剂盒
阅读说明：本技术 生殖系统疾病检测试剂盒 (Reproductive system disease detection kit ) 是由 王阳 金鑫 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种生殖系统疾病检测试剂盒,属于诊断试剂和医疗器械领域。所述试剂盒包含特异性识别f-PSA的单克隆抗体,其拥有更高的灵敏度,用于PSA异常的前列腺疾病的早期筛查诊断、疗效检测和预后判断。(The invention relates to a reproductive system disease detection kit, and belongs to the field of diagnostic reagents and medical instruments. The kit comprises a monoclonal antibody for specifically recognizing f-PSA, has higher sensitivity, and is used for early screening diagnosis, curative effect detection and prognosis judgment of prostate diseases with PSA abnormality.)
技术领域
本发明涉及一种生殖系统疾病检测试剂盒,属于诊断试剂和医疗器械领域。
背景技术
前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺上皮细胞分泌的一种丝氨酸蛋白酶,是一种糖蛋白,分子量34000,等电点6.9,具有液化精液和提高精子活力的作用。一般存在于精液中,主要是精浆中,在血液中的含量极其微少,正常血清中含量小于4ng/ml,只有在前列腺组织发生炎症或是癌变时候,血清中的PSA才会升高。大多数的分子都随精液一起排出。由于PSA只具有组织特异性而不具有肿瘤特异性,所以一般用来作为检验前列腺发生病变的标志。
在血清中,大多数的PSA分子都是以结合态存在,只有少量的游离PSA分子。90％-95％的PSA与α-1-抗糜蛋白酶形成稳定的共价结构PSA-ACT,而且它们构成了免疫检测PSA复合物的绝大多数(≥98％),还有很少量的PSA与丝氨酸蛋白酶抑制剂结合PSA-AT,与蛋白C抑制剂结合的PSA-PCI；占据血液中5％-15％的游离前列腺特异性抗原(f-PSA),在血液中大量抗蛋白酶的作用下很不稳定,易失活。
前列腺癌已经逐渐成为男性死亡的恶性肿瘤之一,PSA是一种中老年疾病,作为肿瘤标志物,它的测定对于前列腺癌的诊断具有十分重要的意义。当前列腺发生炎症时,血清中的含量也会随之发生变化。一般来说,正常的t-PSA变化范围是0-4ng/ml,随着年龄的增长,血清中可检测到的t-PSA含量是逐渐升高的。当t-PSA含量大于10ng/ml时,患有前列腺癌的风险是很高的。当t-PSA处于4-10ng/ml这个灰色诊断区域时,由于特异性不强,对于前列腺癌,前列腺增生,前列腺炎的区别很难界定,所以一般采用f-PSA/t-PSA的比值作为临床指标来区分前列腺癌和前列腺增生。
目前PSA的检测方法目前全部采用免疫学方法，由于检测到t-PSA值后还要检测f-PSA和/或PSA-ACT的量，以计算f-PSA/t-PSA比值来综合判断是癌变还是增生，因此在低浓度范围内检测的精度对于临床非常重要，但是现有技术能够检测的范围和精度比较差，严重制约了临床应用。
发明内容
基于上述发现，本发明的首要目的在于提供一种新的f-PSA抗体，具有更高的灵敏度同时不与PSA-ACT和AFP、ACE交叉反应，以解决现有f-PSA抗体灵敏度低的问题。
本发明提供以下技术方案：
一种抗f-PSA单克隆抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区选自SEQ ID NO:1，轻链可变区选自SEQ ID NO:2。
本发明抗f-PSA单克隆抗体重轻链可变区共有6个互补决定区。所述抗f-PSA单克隆抗体的重链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5；轻链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8。
本发明所述抗f-PSA单克隆抗体的重链和轻链进一步包含恒定区，所述抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3或IgA或IgM序列。
本发明的目的在于提供一种新的抗f-PSA单克隆抗体，所述抗体均不与PSA-ACT和AFP、ACE交叉反应，用于检测样本中f-PSA蛋白存在及含量的抗体。
本发明的又一目的在于提供一种更灵敏的f-PSA定量检测试剂盒、其制备方法及应用。所述试剂盒包含上述识别f-PSA的抗体，用于PSA异常的前列腺疾病的早期筛查诊断、疗效检测和预后判断。
所述f-PSA定量检测试剂盒,包括抗f-PSA单克隆抗体包被的酶标板和抗f-PSA酶标抗体。
所述抗f-PSA酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的本发明所述的f-PSA多克隆抗体。多克隆抗体的制备方法和酶标抗体的方法均为本领域常规操作。
进一步地,所述定量检测试剂盒还包括f-PSA标准品、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液。
上述抗f-PSA单克隆抗体、以及f-PSA标准品、辣根过氧化物酶标记抗f-PSA多克隆抗体、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液分别放入各个试剂瓶中,上述各试剂瓶由海绵托架固定,并同f-PSA抗体包被的酶标板和封板膜一同置于试剂盒盒体内。
有益效果
本发明的有益效果主要体现在：所述抗体特异性识别f-PSA，不与PSA-ACT和其他肿瘤标志物AFP、CEA等交叉反应；由本发明抗体建立的f-PSA检测试剂盒具有更好的灵敏性和特异性,结果与参比试剂符合率高,能提供更准确可靠的检验结果,所述试剂盒操作简便易行,检测快速灵敏,所用酶标仪简单、普及,价格低廉，为PSA异常的前列腺疾病等的早期筛查诊断、疗效检测和预后判断。提供了一种有效工具。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1抗f-PSA抗体特异性：不与PSA-ACT反应。
图2肿瘤标志物交叉反应：不与AFP、CEA交叉反应。
图3f-PSA定量免疫检测试剂盒检测范围。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.抗f-PSA抗体制备及纯化
将f-PSA抗原(购自Fitzgerald公司)与等体积的弗氏完全佐剂(CFA)充分混匀形成水状油包后，通过腹腔注射对8周左右大小的BALB/C小鼠进行初次免疫，每只小鼠注射f-PSA抗原100μg。3周后进行第一次加强，将f-PSA抗原不完全弗氏佐剂(IFA)等体积混匀乳化，采用背部多点注射，每只小鼠注射f-PSA抗原100μg。以后每隔2周加强免疫一次，每次免疫后第7天取尾血，用ELISA法检测抗体效价。当抗体效价达到10-4左右时，将100μg f-PSA抗原与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积混匀乳化，采用背部多点注射加强免疫一次。于第四天取脾，进行细胞融合。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞加HAT铺板，3天之后半换液,一周之后全换液,换HAT培养基培养。12天后，取细胞上清，高通量ELISA法检测上清中与f-PSA蛋白表现出阳性反应的原代培养物。再将此孔内的杂交瘤细胞进行稀释进行亚克隆，同样以ELISA方法进行筛选，最终筛选出阳性杂交瘤细胞株18株。将上述杂交瘤细胞株扩大培养，收取此杂交瘤细胞，用PBS重悬，配置成107/ml的杂交瘤细胞悬液。用弗氏不完全佐剂作为诱导剂。预先向8周左右的Balb/c腹腔注射弗氏不完全佐剂，3天后，向预先处理过的Balb/c小鼠腹腔中注射500ul浓度为107/ml的杂交瘤细胞悬液。待小鼠腹部肿胀隆起，采集腹水纯化抗体。经过饱和硫酸铵(PH＝7.8)沉淀获得粗提的PSA单抗，再经过protein G柱层析获得纯度较高的PSA抗体。包被PSA抗原，间接ELISA法测定抗体效价，其中18株抗PSA抗体的效价在1：8W～1:20W。
实施例2.抗体特异性鉴定
由于抗原在体内以结合和游离两种形式存在,所以要准确定量t-PSA和f-PSA,就必须把针对游离的和结合的抗体分开,并且二者之间不能有交叉反应。具体的实验过程为分别包被PSA-ACT、f-PSA、t-PSA(均购自Fitzgerald),浓度为1μg/ml,将获得的所有抗体分别加入三种不同的包被抗原中,通过间接ELISA检测交叉反应程度。实验结果如图1所示，最终筛选出对f-PSA有高反应性，对PSA-ACT无反应性的抗体H703。
实施例3.肿瘤标志物交叉反应
由于前列腺特异性抗原作为一种肿瘤标志物,具有组织特异性,而不具有肿瘤特异性,为了准确检测血清中含量,就要避免与其他一些主要的肿瘤标志物发生交叉反应,这些包括蛋白类标记物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)及癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)(购自Fitzgerald公司)等。将上述的肿瘤标志物分别进行了包被之后,采用间接ELISA法进行检测,检测结果如图2所示，抗体H703与AFP、CEA蛋白均无交叉反应。
实施例4.抗f-PSA多克隆抗体制备
将f-PSA抗原(购自Fitzgerald公司)与弗氏完全佐剂(CFA)充分混匀形成水状油包后，选用2-2.5kg的健康家兔,第一次用皮内多点注射法,共注射抗原乳剂2ml(含抗原50mg/只)。三周后再次皮内多点免疫,再隔两周后于静脉注射可溶性抗原100mg,此为强化免疫。强化注射后7天耳静脉取血,分离血清,用间接ELISA法测其效价。选用一次全采血法,自颈动脉无菌放血,分离血清,加入适量防腐剂,分装小瓶,低温冰箱保存。用50％硫酸铵沉淀一次,33％硫酸铵沉淀两次,然后用DEAE层析法把兔血清进行纯化，提取IgG。用间接ELISA法测定纯化的IgG效价,得到抗f-PSA多克隆抗体,抗体效价为1:60000。
实施例5.f-PSA定量免疫检测试剂盒的制备(一)制备酶标板
采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将实施例1得到的抗f-PSA单克隆抗体H703稀释至0.5μg/ml,pH值为7.0～7.4得到包被液。采用0.01M磷酸盐缓冲溶液,其pH值为7.0～7.4，将3％的脱脂奶粉加入上述溶液中,配制成封闭液。将配制的包被液加入酶标板孔中,每孔分别加入100μL包被液；上述酶标板置于4℃环境下包被过夜；将配制的封闭液加入酶标板孔中,每孔分别加入100μL封闭液,置于37℃温箱,30分钟；从温箱取出酶标板后弃去封闭液,37℃恒温30分钟。
(二)配制酶标抗体溶液
用辣根过氧化物酶标记实施例5得到的多克隆抗体,得到酶标抗体。首先称取适量HRP酶，溶于三蒸水中，加入新配的过碘酸钠溶液，混匀后置4℃,30min；加入乙二醇溶液，室温，30min；加入适量纯化抗体，混匀，调pH值至9.0,放4℃，过夜；加入硼氢化钠，混匀，置4℃,2h；将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min；离心后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析过夜。
(三)配制PSA标准品
f-PSA抗原：市售，自Fitzgerald公司。
(四)配制浓缩洗液(20×0.01M PBS)
将氯化钠96份,氯化钾2.4份,十二水合磷酸氢二钠42.96份,磷酸二氢钾2.88份,吐温-200.05份,超纯水1000份,混匀即得。
(五)样本稀释液
人工血清:市售(购于湖州英创生物科技有限公司)
(六)底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine),购于北京天根公司。
(七)配制终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1∶8稀释,配制成终止液。
实施例6.f-PSA定量免疫检测试剂盒检测范围确定
将f-PSA抗原用人工血清进行梯度稀释,稀释后浓度分别是20ng/ml，5ng/ml，1.25ng/ml，312pg/ml，78ng/ml，20ng/ml，5pg/ml。用实施例5试剂盒检测。以浓度为横坐标,OD450值为纵坐标绘制曲线,并进行直线拟合,确定检测范围。最终得到的数据为图3所示，最低检测线10pg/ml,线性范围为20pg/ml-5ng/ml，线性关系为0.985。而根据现有技术例如CN104849459B中双夹心标准曲线结果，其检测到的最低浓度为0.1ng/ml。因此利用本发明所述的f-PSA抗体制备的双夹心ELISA检测试剂盒，其灵敏度明显高于现有技术CN104849459B中的试剂盒。
实施例7.单克隆抗体序列确定
细胞制备：将H703对应的杂交瘤细胞株复苏后，培养至总数量107个细胞，1000rpm离心5min收集细胞，提取RNA。向细胞沉淀中加入TRNzol-A+裂解，室温静止15min。每mlTRNzol-A+加入200μl氯仿，漩涡振荡15秒，放置3分钟。13000rpm 4℃离心10分钟，Trizol-A+细胞溶液分为三层：上层无色水相、中层和下层黄色有机相，将溶有RNA的水相转移至离心管中，向水相中加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25分钟。13000rpm 4℃离心10分钟，弃去废液得到沉于底部的RNA沉淀。用75％乙醇洗涤RNA沉淀两次后，用PEDC水溶解RNA，-80℃保存。用反转录试剂盒SMARTerRACE合成第一链cDNA，以第一链cDNA为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区DNA序列。设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。将扩增产物测序后，得到抗PSA抗体H703的重链可变区序列SEQ ID NO：1和轻链可变区序列SEQ ID NO：2；该抗体的重链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5；轻链可变区3个CDR序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8。
序列表
<110> 北京瀚梅生物科技有限公司
<120> 生殖系统疾病检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Cys
20 25 30
Ala Asn Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Asn Lys Gly Thr Leu Ser Ile Arg Asn Ile Tyr Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65 70 75 80
Leu Lys Val Asn Asn Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Cys Gly Asn Ala Thr Ile Glu Tyr Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Asn Ile Cys Ile Lys Gly Thr
20 25 30
Asn Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ile Thr Lys Asn Met Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Ile Cys Asn Ser Arg Lys
85 90 95
Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Cys Ala Asn Thr
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ile Asn Lys Gly Thr Leu Ser Ile Arg Asn Ile Tyr Thr Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Ala Cys Gly Asn Ala Thr Ile Glu Tyr Asp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Ala Asn Ile Cys Ile Lys Gly Thr Asn Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Ile Thr Lys Asn Met Ala
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Gly Ile Cys Asn Ser Arg Lys Gln
1 5
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