一种检测深海环境基因的电化学传感系统及检测方法
阅读说明：本技术 一种检测深海环境基因的电化学传感系统及检测方法 (Electrochemical sensing system and method for detecting deep sea environment genes ) 是由 雷建平 朱达 王思娜 李俊 付昊旻 于 2020-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测深海环境基因的电化学传感系统及检测方法,其目的在于以二茂铁标记的探针作为直接式信号,利用碱基互补配对的原则,通过目标基因诱导探针构型发生变化,改变二茂铁与电极表面的距离产生电流响应,借助三段式封装设计使其实现深海核酸的原位高通量检测。三段式封装设计包括工作站主板舱、线路连接舱和检测舱；含目标基因的细胞裂解液流经检测舱,与传感器探针发生杂交反应,实现目标基因检测；使电化学传感器件能够搭载着陆器进入深海正常、自主运行,实现深海极端环境下的核酸原位检测；二茂铁标记的探针作为直接式信号,无需外加信号来源；无试剂参与,简单易操作。(The invention relates to an electrochemical sensing system and a detection method for detecting deep sea environmental genes, aiming at using a ferrocene-labeled probe as a direct signal, utilizing the principle of base complementary pairing, inducing the probe configuration to change by a target gene, changing the distance between ferrocene and the surface of an electrode to generate current response, and realizing the in-situ high-flux detection of deep sea nucleic acid by means of a three-section packaging design. The three-section type packaging design comprises a workstation main board cabin, a line connection cabin and a detection cabin; enabling cell lysate containing target genes to flow through the detection cabin and perform hybridization reaction with the sensor probe to realize target gene detection; the electrochemical sensing device can be carried with a lander to enter deep sea to normally and automatically operate, and the in-situ detection of nucleic acid under the extreme environment of deep sea is realized; the ferrocene-labeled probe is used as a direct signal without an additional signal source; no reagent is involved, and the method is simple and easy to operate.)
技术领域
本发明是一种检测深海环境基因的电化学传感系统及检测方法，属于电化学传感技术领域。
背景技术
获取深海微生物或幼虫的功能基因信息，通过组学分析揭示原位环境下功能基因的表达信息和蛋白活性特征，可以实现从细胞基因对深海生物功能探测和对深海生命全方位、立体化的认识。目前深海功能基因的检测主要基于采样瓶采样到陆地实验室进行，周围环境的变化严重影响分析结果。因此，设计一种针对深海微生物或幼虫的功能基因片段原位检测的传感器件与方法迫在眉睫。
直接式信号无试剂电化学传感器具有廉价易得、一步检测等优点，同时芯片化的传感器可用于现场检测。此类传感器主要基于核酸与小分子、核酸、纳米材料等的相互作用设计信号开关。因直接式信号无试剂电化学传感器的便利性，其应用范围十分广泛。在日常生活中，它可以检测食品中的赭曲霉毒素A；在生物分析中，它可以检测全血中的可卡因。因此，充分利用其简便快捷的特性，结合软件控制和仪器封装设计，将其应用于深海环境下的核酸原位检测，为揭示深海原位条件下的微生物群落组学水平上的功能分析提供技术支撑。
发明内容
本发明提出的是一种检测深海环境基因的电化学传感系统及检测方法，其目的在于以二茂铁标记的探针作为直接式信号，利用碱基互补配对的原则，通过目标基因诱导探针构型发生变化，改变二茂铁与电极表面的距离产生电流响应，借助三段式封装设计使其实现深海核酸的原位高通量检测。
本发明的技术解决方案：
将以二茂铁标记的探针作为直接式信号探针，与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐震荡反应1小时，取出适量混合液滴加在电极表面组装单层探针分子；随后冲洗干净滴加适量6-巯基己-1-醇封闭未反应的位点。在目标基因存在下，目标基因与探针序列根据碱基互补配对原则形成三链结构，使得二茂铁分子与电极表面距离发生变化，导致电子传递速率改变，最终体现在电流的大小层面。通过电流的大小，可以定性判断目标基因类型，也可以结合标准工作曲线达到目标基因定量目的。
其中，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐为直接式信号探针进一步活化；整个检测过程在三电极体系中进行。
通过在电极表面构建直接式信号的无试剂DNA电化学传感器，利用目标基因诱导探针构型发生变化产生电流响应，从而实现深海极端环境下核酸的原位检测，具体步骤如下：
1）将二茂铁标记的探针干粉高速离心，加入缓冲溶液获得一定浓度的探针溶液；
2）将步骤1）得到的探针溶液与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐震荡反应活化备用，震荡时间为1小时；
3）打磨金电极表面至镜面光滑；
4）在步骤3）打磨后的电极表面滴加步骤2）制备的活化探针溶液，使探针固定在电极表面；
5）反复冲洗电极表面2-3次，滴加适量6-巯基己-1-醇封闭未反应的电极位点，得到修饰探针的电极；将修饰探针电极安装在直接式信号的电化学传感器检测舱中；
6）将含有一定浓度的目标基因反应液滴加在修饰探针的电极表面，目标基因与探针杂交反应形成三链结构，改变探针上二茂铁分子到电极表面的距离，使得电流信号发生变化；
7）在三电极体系中，获得电流信号响应曲线，处理后读出峰电流；做出目标基因标准溶液的工作曲线，并通过工作曲线求出深海极端环境采样处的目标基因浓度。
所述直接式信号的电化学传感器应用于深海环境时具体封装设计如下：
S1：工作站主板舱采用干舱进行封装，干舱的舱体为圆柱形；舱盖内部装有“L型”平台，固定安装微型电化学工作站；在舱体两端留有孔道，通过水密插件将微型电化学工作站分别与传感界面和上位机相连，舱体与舱盖之间通过水密垫片进行密封；
S2：中间的线路连接舱采用湿舱封装，并在舱体开设油孔，用来添加液压油、连接补偿油囊，以及排除舱内气体；
S3：检测舱包括电极传感界面部分和待检测液体流动部分；零件与零件之间通过密封垫片密封，电极与零件间通过密封圈进行密封。
本器件的检测方法原理：
本电化学传感器件构建了基于目标基因诱导构型变化的特异性识别的软界面。通过共价键作用将标记二茂铁分子的探针固定到电极表面，此时，二茂铁分子远离电极表面，电子传递速率慢，电流值小。当目标基因存在时，通过Watson−Crick和Hoogsteen碱基配对的双重识别作用形成三链结构，将二茂铁分子拉近电极表面，电子传递速率快，电流值增大，并且随着目标基因浓度的逐步增加，电流信号呈现规律性变化。另一方面，将电化学工作站、传感界面集成密封在舱体，达到深海环境目标基因原位检测目的。
本发明的有益效果：
1）二茂铁标记的探针作为直接式信号，无需外加信号来源；无试剂参与，简单易操作；
2）系统采用三段式封装方法，使电化学传感器件能够搭载着陆器进入深海正常、自主运行，实现深海极端环境下的核酸原位检测；
3）工作站主板为圆柱形干舱，能够分散在水下的压力，湿舱中液体的压力使主板晶振无法振动，丧失信号传输的功能导致主板无法工作。
附图说明
附图1是基于直接式电化学传感器件用于深海环境基因原位检测原理图。
附图2是检测深海环境基因的电化学传感系统的三段式封装示意图。
附图中1是工作电极、2是参比电极、3是辅助电极。
具体实施方式
下面结合附图对本发明技术方案做进一步解释说明。
对照附图2，检测深海环境基因的电化学传感系统的封装设计分为三段（图2），最左侧为微型电化学工作站主板用干舱封装，左侧舱盖用水密穿舱件引出电源、工作导线等，与上位机连接执行命令、信号或数据传输、文件保存等功能。中间为湿舱封装的工作站主板与生物传感界面的线路连接，并在舱体表面加工有“油孔”。最右侧为含目标基因的细胞裂解液流经的液体舱，也是无试剂电化学生物传感器的反应舱，目标基因与传感器探针发生杂交反应，实现目标基因检测。
在完成上述装置的搭建后，在电极铜棒端加了一个后盖固定件。一方面是可以固定工作电极，避免打磨时电极向后移动，方便打磨；另一方面是保证工作电极所在平面高于参比及辅助电极所在的平面，有利于用水虎鱼酸溶液处理工作电极，可以免拆卸实现电极良好的重复使用。
对照图1，本发明工作原理是将作为直接式信号的探针与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐震荡反应1小时，取出适量滴加在电极表面组装单层探针分子，随后冲洗干净滴加适量6-巯基己-1-醇封闭未反应的位点。通过共价键作用将标记二茂铁分子的探针固定到电极表面，此时，二茂铁分子远离电极表面，电子传递速率慢，电流值小。当目标基因存在时，通过Watson−Crick和Hoogsteen碱基配对的双重识别作用形成三链结构，将二茂铁分子拉近电极表面，电子传递速率快，电流值增大，并且随着目标基因浓度的逐步增加，电流信号呈现规律性变化。通过电流的大小，可以定性判断目标基因类型，也可以结合标准工作曲线达到目标基因定量目的。
具体检测步骤：
1）保证工作电极所在平面高于参比和辅助电极所在平面，在麂皮表面滴加湿润的氧化铝粉末，麂皮覆于电极平面略施加力，转圈进行打磨，打磨完毕后用清水冲洗干净，超声2-3分钟。将上述处理好的电极放在1 M的H2SO4中进行活化备用。
2）取10 μL 10 μM的二茂铁标记探针和50 μL 10 mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐和40 μL 25 mM Tris-HCl 200 mM Na+混合均匀后，震荡反应1小时后备用。
3）将活化好的探针滴加5-8 μL在干燥的封装好的工作电极—金电极表面，常温反应2小时。之后用清水冲洗、吹干，滴加5 μL 1 mM的6-巯基己-1-醇反应1小时左右，随后冲洗掉多余的6-巯基己-1-醇备用。
4）配制不同浓度的标准溶液，测试传感器件对标样的响应，并绘制相应的标准工作曲线。构建好的基因传感装置搭载在海水过滤装置下游，在含有目标基因的细胞裂解液中进行检测，获得。
5）将活化好的探针滴加5-8 μL在干燥的封装好的工作电极—金电极表面，常温反应2小时。之后用清水冲洗、吹干，滴加5 μL 1 mM的6-巯基己-1-醇反应1小时左右，随后冲洗掉多余的6-巯基己-1-醇备用。
6）配制不同浓度的标准溶液，测试传感器件对标样的响应，并绘制相应的标准工作曲线。构建好的基因传感装置搭载在海水过滤装置下游，在含有目标基因的细胞裂解液中进行检测，获得电流信号响应曲线，从工作曲线求出样品中目标基因的浓度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。