基于磁性纳米材料测定t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法
阅读说明：本技术 基于磁性纳米材料测定t4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法 (Electrochemical analysis method for determining activity of T4 polynucleotide kinase based on magnetic nano material ) 是由 张艳丽 陶锦彭 庞鹏飞 王红斌 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法,包括如下步骤：采用水热法制备Fe-3O-4@TiO-2磁性核壳纳米粒子,ATP和T4 PNK存在时,核酸链S1的5′端磷酸化,末端磷酸化的S1通过与TiO-2特异性反应,修饰到Fe-3O-4@TiO2磁性纳米粒子表面；加入金纳米粒子-核酸链S-2复合物(AuNPs-S2),由于核酸链S1和S2之间的杂交反应,形成Fe-3O-4@TiO-2-S1/S2-AuNPs复合物；以六氨基合钌[Ru(NH-3)-6～(3+)]为电活性指示剂,通过GME表面的磁性富集和电化学信号增强,实现对T4PNK活性的高灵敏、快速和定量测定。(The invention discloses an electrochemical analysis method for determining T4 polynucleotide kinase activity based on a magnetic nano material, which comprises the following steps: preparation of Fe by hydrothermal method 3 O 4 @TiO 2 Magnetic core-shell nanoparticles, ATP and T4PNK, the 5' end of the nucleic acid chain S1 is phosphorylated, and the phosphorylated S1 at the end is reacted with TiO 2 Specific reaction, modification to Fe 3 O 4 @ TiO2 magnetic nanoparticle surface; addition of gold nanoparticle-nucleic acid strand S 2 Complex (AuNPs-S2) due to hybridization between nucleic acid strands S1 and S2React to form Fe 3 O 4 @TiO 2 -S1/S2-AuNPs complex; with hexa-amino ruthenium [ Ru (NH) 3 ) 6 3+ ]The GME is an electroactive indicator, and the high-sensitivity, rapid and quantitative determination of the T4PNK activity is realized through the magnetic enrichment and electrochemical signal enhancement of the GME surface.)
技术领域
本发明涉及生化分析或生化技术领域，具体涉及一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法。
背景技术
T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是一种由噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，具有5'激酶活性，可催化核酸5'羟基末端进行磷酸化，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外，T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具，T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。
磁性纳米粒子同时具有纳米材料性质和磁学特性。四氧化三铁 (Fe3O4)磁性纳米粒子具有超顺磁性、比表面积大、优异的吸附性能、低毒性及表面原子配位不足等特点，常作为一些复合材料的载体或磁核用于富集分离过程。纳米二氧化钛(TiO2)是一种新型无机半导体材料，具有比表面积大、生物相容性好、吸附能力强、导电性好、化学惰性强和制造成本低等特性，在磷酸化蛋白选择性富集和光催化活性方面表现出广阔应用前景。采用磁性Fe3O4为核，负载TiO2纳米壳层材料，制备得到的Fe3O4@TiO2核壳纳米复合材料，不仅可以保持TiO2纳米材料的高催化活性，并且可以维持磁性核材料的强磁性，实现对磷酸化蛋白/多肽的高选择性和特异性富集和分析。
测定T4 PNK活性的方法主要是放射性同位素32P、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影法等。这些方法普遍存在不连续、耗时耗力且操作复杂、需要高素质人员、易产生放射性污染等缺点。近年来，发展了一些新的T4 PNK活性的检测方法，例如电化学方法、石英晶体微天平技术、化学发光法、荧光法、单分子荧光成像技术等。虽然此类方法灵敏度较高，但是操作过程繁琐，成本较高，其应用受到一定程度的限制。针对目前测定方法存在的缺点或不足，需要发展新型、简单方便的T4 PNK活性检测方法。
目前，缺乏一种实现对T4 PNK活性的高灵敏、快速和定量测定的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种实现对T4 PNK活性的高灵敏、快速和定量测定的基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，包括如下步骤：(1)设计寡核苷酸序列；
(2)Fe3O4磁性纳米粒子；
(3)Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子：采用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子，在ATP和T4PNK存在下，核酸链S1的5′端磷酸化后与TiO2特异性反应，连接到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面；
(4)AuNPs-S2纳米粒子的制备；
(5)构建电化学生物传感器
将ATP和T4 PNK分别加入核酸链S1缓冲溶液，37℃培育4小时，加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液培育4小时；之后加入 AuNPs-S2纳米粒子溶液，37℃培育2-3小时；然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极GME表面，PBS缓冲液洗涤电极后，滴加 [Ru(NH3)6]3+电活性物质，测量电极的电化学响应信号；
(6)测定T4多核苷酸激酶活性，使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线。
进一步地，在步骤(1)中，所述的核酸链S1具有SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列；所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
在步骤(2)中，首先采用水热法制备Fe3O4磁性纳米粒子，将 FeCl3溶解于乙二醇，加入NaAc和聚乙二醇，搅拌溶解后转移至聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应8小时，冷却至室温，用乙醇洗涤数次，磁力分离，室温下干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
在步骤(3)中，取冰醋酸和钛酸丁酯溶于乙醇，加入Fe3O4纳米粒子，超声分散后加入聚乙二醇和尿素，搅拌溶解后将混合物转移到反应容器中，180℃反应8小时，过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次， 80℃干燥12小时，得到Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子；
在步骤(4)中，AuNPs-S2纳米粒子的制备
将核酸链S2溶解于PBS缓冲液，加入AuNPs溶液，37℃培育4 小时，加入胶体溶液并静置4小时，用PBS缓冲液洗涤，离心分离，制得AuNPs-S2纳米粒子；
在步骤(5)中，
加入金纳米粒子-核酸链S2复合物(AuNPs-S2)，核酸链S1和S2 之间通过特异性杂交反应，AuNPs被修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面，形成Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物；
在步骤(6)中，采用工作电极以六氨基合钌[Ru(NH3)6 3+]为电活性指示剂，通过GME表面的磁性富集和电化学信号增强，实现对T4 PNK活性的定量测定。
进一步地，在步骤(6)中，T4多核苷酸激酶活性的测定
将ATP和T4 PNK加入核酸链S1缓冲溶液，37℃培育4小时，加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；之后加入AuNPs-S2纳米粒子溶液，37℃培育2小时；然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极(GME)表面，PBS缓冲液洗涤电极后，滴加[Ru(NH3)6]3+电活性物质，电极表面通过磁性富集实现电化学响应信号放大；使用电化学工作站测量电化学响应信号，根据电化学信号大小对T4 PNK的活性进行定量测定。
更进一步地，在步骤(1)中，所述的核酸链S1的长度为20个碱基，所述的核酸链S2的长度为19个碱基，核酸链S1的用量和浓度分别为10μL和10OD/mL；在步骤(3)中，Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子的直径为400nm。
进一步地，在步骤(5)中，ATP的浓度为10mM，T4 PNK的浓度为0.0001-10U/mL；AuNP-S2的用量和浓度分别为10μL和15 μM；S1磷酸化反应的时间为4h；S1修饰到Fe3O4@TiO2表面的时间为2h；S1和S2杂交的时间为2h；体系中的反应温度和杂交温度为37℃。
进一步地，在步骤(6)中，工作电极为直径为3mm的磁性金电极；电化学测量体系中[Ru(NH3)6]3+的用量和浓度分别为100μL和 50μM；Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物和[Ru(NH3)6]3+电活性指示剂通过磁性富集在电极表面；T4 PNK活性测定技术为微分脉冲伏安法。
更进一步地，在步骤(6)中，电化学信号放大技术是基于 Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs纳米粒子双重信号放大技术。
进一步地，在步骤(6)中，所述的工作电极为磁性金电极；所述的磁性金电极通过磁性富集实现电化学信号的增强。
有益效果：本发明实现对T4 PNK活性的高灵敏、快速和定量测定。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了一种电化学技术检测T4多聚核苷酸激酶活性；
(2)本发明利用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs纳米粒子双重信号放大技术提高测定T4 PNK活性的灵敏度；
(3)本发明利用磁性金电极通过磁性富集实现电化学信号增强；
(4)本发明设计了特定序列的DNA，提高了检测T4 PNK活性的选择性和特异性；
(5)本发明制备的电化学生物传感器可用于T4 PNK抑制剂 EDTA、Na2HPO4和(NH4)2SO4的检测。
附图说明
图1为使用本发明的磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的制备技术和检测原理示意图。
图2为使用本发明技术测定T4多聚核苷酸激酶活性的标准曲线图，横坐标是T4PNK的活度，单位是U/mL，纵坐标是DPV响应峰电流，单位是μA。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的一种基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学方法
本发明基于Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs双重信号放大技术检测T4 PNK活性的方法原理如图1所示。首先制备 Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子，ATP和T4PNK存在下，核酸链S1的5′端磷酸化，末端磷酸化的S1通过与TiO2特异性反应，修饰到 Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面。之后加入AuNPs-S2纳米粒子，由于核酸链S1和S2之间的杂交反应，AuNPs被修饰到Fe3O4@TiO2磁性纳米粒子表面，形成Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs复合物。最后以磁性金电极(GME)为工作电极，以六氨基合钌[Ru(NH3)6 3+]为电活性指示剂，形成的Fe3O4@TiO2-S1/S2-AuNPs/[Ru(NH3)6]3+复合物通过磁性富集在电极表面实现电化学响应信号的放大。根据电化学响应信号的大小实现对T4PNK活性的定量测定。
实施例2
寡核苷酸序列设计
本发明所设计的寡核苷酸序列由中国上海Sangon生物工程有限公司合成，并通过HPLC纯化检验，冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下：所述的核酸链S1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的核酸链S2具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
核酸链S1：5′-SH-CACTTGGTTGGTGTGGTTGG-3′；
核酸链S2：5′-ACACCAACCAAGTGATGAT-3′；将寡核苷酸溶解在超纯灭菌水中，-18℃保存备用。
实施例3
Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子制备
称取0.615g FeCl3·6H2O溶解于20mL乙二醇中，加入1.8g NaAc 和0.5g聚乙二醇，搅拌溶液后，转移至100mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压反应釜中，200℃下反应8小时，冷却至室温，用乙醇洗涤数次，磁力分离，室温下风干，得到Fe3O4磁性纳米粒子。取9.6mL 冰醋酸和6.8mL钛酸丁酯溶于60mL乙醇中，加入0.4g Fe3O4磁性纳米粒子，超声分散15min，加入2.4g聚乙二醇和3.6g尿素，电动搅拌1小时，然后将混合物转移至反应容器中在180℃结晶8小时。冷却至室温后，过滤沉淀物并用乙醇洗涤数次，并在80℃下干燥12 小时，得到Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子。
实施例4
AuNPs-S2纳米粒子的制备
将核酸链S2溶解于10mM PBS缓冲液(含500μM三(2-羧乙基) 膦盐酸盐)，转移至100mM pH 7.4PBS缓冲液(含0.1％Tween-20 和200mM NaCl)，加入AuNPs溶液，37℃培育4小时。加入0.3M NaCl盐化胶体溶液，静置4小时。用100mM pH 7.4PBS缓冲液(含 500mM NaCl)洗涤三次，10000rpm离心分离20分钟，得到AuNPs-S2 纳米粒子。
实施例5
电化学生物传感器的制备
磁性金电极(GME)用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉打磨抛光，先后用超纯水、无水乙醇、超纯水超声洗涤；将GME放入piranha 溶液中浸泡30min，超纯水洗涤；在0.5M H2SO4溶液中采用循环伏安扫描30圈活化电极，电位范围-0.2～1.6V，扫速50mV/s，N2气吹干备用。
在10μL10 OD/mL核酸链S1溶液中，加入5μL 1mM ATP和不同浓度T4 PNK，37℃培育4小时，加入5μL5 mg/mLFe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液，培育2小时；用10mM pH 7.4PBS缓冲液洗涤后，加入10μL15μM AuNPs-S2纳米粒子溶液，37℃培育2小时；取10μL上述反应混合液滴涂于处理好的磁性金电极表面，用10mM pH 7.4PBS缓冲液冲洗电极，滴加100μL50μM[Ru(NH3)6]3+电活性物质，用10mM pH 7.4PBS缓冲液冲洗电极，得到T4 PNK电化学生物传感器。
实施例6
实施例6与实施例5的区别在于：
电化学生物传感器的制备
将ATP和T4 PNK分别加入核酸链S1缓冲溶液，37℃培育4小时，加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液培育4小时；之后加入 AuNPs-S2纳米粒子溶液，37℃培育3小时；然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极GME表面，PBS缓冲液洗涤电极后，滴加 [Ru(NH3)6]3+电活性物质，测量电极的电化学响应信号。
实施例7
实施例7与实施例5的区别在于：
电化学生物传感器的制备
将ATP和T4 PNK分别加入核酸链S1缓冲溶液，37℃培育4小时，加入Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子溶液培育4小时；之后加入 AuNPs-S2纳米粒子溶液，37℃培育2.5小时；然后将上述混合液滴加在处理好的磁性金电极GME表面，PBS缓冲液洗涤电极后，滴加 [Ru(NH3)6]3+电活性物质，测量电极的电化学响应信号。
实施例8
T4 PNK活性的测定
使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，磁性金电极为工作电极。采用微分脉冲伏安法测定T4 PNK活性，以10mM Tris-HCl(pH 7.4,0.1M NaCl)为缓冲液，电位范围为-0.4～0V，电位增幅为50mV，脉冲周期为20ms。微分脉冲曲线响应峰电流大小与T4 PNK浓度的标准曲线如图2所示，峰电流与T4 PNK浓度在0.0001-10U/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.9951，线性方程为ipc(μA)＝0.24logc+1.67，检出限为0.00003U/mL。本发明提出的传感器相比较其他传感器，具有更宽的线性范围和更低的检出限，采用Fe3O4@TiO2磁性核壳纳米粒子和AuNPs双重信号放大技术可实现T4 PNK活性的定量和灵敏测定。
实施例9
T4 PNK活性抑制剂的测定
将不同浓度的抑制剂EDTA、Na2HPO4和(NH4)2SO4与T4 PNK 缓冲液混合，实验方法相同，随着抑制剂浓度加大，T4 PNK的相对活性明显降低。当加入三种抑制剂浓度分别为12.5mM、7mM和6 mM时，T4 PNK的相对活性降低了50％，表明该方法可用于T4 PNK 抑制剂的检测分析。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南民族大学
<120> 基于磁性纳米材料测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（核酸链S1）
<400> 1
shcacttggttggtgtggttgg 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（核酸链 S2）
<400> 2
acaccaacca agtgatgat 19
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