肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片及其制作与检测方法
阅读说明：本技术 肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片及其制作与检测方法 (Tumor cell exosome and nucleic acid detection chip thereof, and manufacturing and detection methods thereof ) 是由 陈凯 郜晚蕾 赵雪飞 袁浩钧 金庆辉 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：提供一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片,包括相互贴合的玻璃基片(1)与PDMS片(2),PDMS片(2)开设第一通孔(3)、第二通孔(4)、第三通孔(5)、凹坑(6)、初始流槽(7)、第一流槽(8)、第二流槽(9)依次连接；凹坑(6)形成TEX捕获检测区,第三通孔(5)形成microRNA捕获检测区；玻璃基片(1)的对应区域分别溅射有用于将TEX与microRNA捕获检测的三电极体系；第一流道段、第二流道段上面设置可使此流道段关闭的第一阀门与第二阀门；将肿瘤细胞外泌体与其核酸检测功能集成于一体；本发明还提供此种芯片的制作方法与检测方法。(Providing a tumor cell exosome and a nucleic acid detection chip thereof, wherein the tumor cell exosome comprises a glass substrate (1) and a PDMS sheet (2) which are mutually attached, and the PDMS sheet (2) is provided with a first through hole (3), a second through hole (4), a third through hole (5), a pit (6), an initial flow groove (7), a first flow groove (8) and a second flow groove (9) which are sequentially connected; the pit (6) forms a TEX capture detection area, and the third through hole (5) forms a microRNA capture detection area; three electrode systems for capturing and detecting TEX and microRNA are respectively sputtered in corresponding areas of the glass substrate (1); a first valve and a second valve which can close the flow passage section are arranged on the first flow passage section and the second flow passage section; integrating tumor cell exosomes and nucleic acid detection functions thereof; the invention also provides a manufacturing method and a detection method of the chip.)
相关申请的引用结合：
本案申请人2020-07-06申请的ZL 202010639672.2，名称为“一种单细胞温度检测传感器及其制作方法与检测方法”的专利申请通过引用的方式结合，如同全部提出。
技术领域：
本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片及其制作与检测方法。
背景技术：
早期发现是控制癌症疾病的关键。我国的癌症治疗能力并不低，一些大型医院的设备和诊治水平已经接近发达国家，但对癌症防控的能力非常低。
液体活检成为了肿瘤诊断和预后监测较为理想的选择，血液中癌症标志物——外泌体是一类在细胞生长过程中释放出来的具有双分子层结构的微囊泡，一般直径在30～150nm之间。相比于正常细胞，肿瘤细胞由于所处的低氧环境刺激，会产生更多的外泌体。外泌体作为细胞间输送物质的媒介，参与调节多种生理病理反应。而肿瘤外泌体参与肿瘤的发生、血管生成等过程。此外，肿瘤外泌体(Tumor-derived exosomes,TEX)还可以释放相关信号分子，阻止免疫系统的肿瘤识别和抗肿瘤过程等。与循环肿瘤细胞相比，外泌体也携带有肿瘤细胞遗传特征分子，而且数量更多。因此在临床上，TEX可以作为一种稳定和敏感的肿瘤标志物，对其进行高灵敏检测可以用于癌症早期诊断、疗效实时监控和预后跟踪。
核酸是生物的遗传物质，包括了核糖核酸(RNA)，而microRNA被称为微小核糖核酸， microRNA参与人体的生理活动并在其中起到重要的作用。MicroRNA，也称miRNA，是一种短序列的非编码RNA，与多种癌症的形成和发展密切相关。miRNA在转录后水平调节肿瘤相关基因表达，发挥抑癌或者促癌功能。miRNA可以以外泌体内容物的形式稳定存在于血液中，受到外泌体双层膜结构的保护而免受酶类物质的降解作用。相比于血液中的游离miRNA，外泌体可以提供富集的和稳定的miRNA，所反映的基因信息也更加准确和可靠。肿瘤细胞来源外泌体miRNAs通过识别靶mRNA，指导、沉默、复合体降解mRNA，或者阻止mRNA翻译参与各种调节。研究表明，在相比于血清中microRNA总量，定量检测TEX中microRNA可以有效提高肿瘤检测的准确性，肿瘤外泌体microRNA是一种有价值的标志物。
想对TEX-miRNA进行准确检测，就要先得到高纯度的外泌体样本。目前存在的常规外泌体分离方法有超速离心法、超滤法、沉淀法和免疫磁珠法等。超速离心法处理时间长、昂贵的仪器设备和技术要求高，外泌体得率和纯度不高，如：专利文献CN211620485U。沉淀法可以快速简便的分离外泌体，但同样存在这费用高、波动性大，中等的得率和纯度，如专利文献：CN111117949A。免疫磁珠法是利用外泌体膜表面过量表达的抗原(CD63、CD9等)与磁珠标记抗体的相互作用，外泌体纯度高、得率较低，如：专利文献CN111575228A。总之，这些传统方法在一定程度上可以获得富集的外泌体样本，但是存在外泌体纯度不高、得率低，时间费用成本较大等问题。
目前公开的肿瘤外泌体microRNA分离技术和检测技术主要存在以下几点问题：1)检测步骤繁琐，成本高。2)无法对肿瘤细胞来源外泌体miRNA进行特异性检测。3)灵敏度低、可靠性低。
发明内容
：本发明所要解决的技术问题是提供一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片，将肿瘤细胞外泌体与其核酸检测功能集成于一体，解决现有技术存在的肿瘤细胞外泌体与其核酸检测装置结构复杂和步骤繁琐等问题。本发明还提供此种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测的制作方法，以及使用此种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测而实现的的肿瘤细胞外泌体与其核酸检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片所采用的技术方案为：
一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片，包括相互贴合的玻璃基片与PDMS片，其特征在于，所述PDMS片间隔开设打穿PDMS片的第一通孔、第二通孔、第三通孔，所述PDMS片的贴合面在第一通孔与第二通孔之间开设凹坑，所述PDMS片的贴合面在在第一通孔与凹坑之间开设初始流槽，凹坑与第二通孔之间开设第一流槽，第二通孔与第三通孔之间开设第二流槽，并依次连接；所述PDMS片与所述玻璃基片贴合后，在玻璃基片上面，第一通孔形成进样口，凹坑形成TEX捕获检测区，所述初始流槽、第一流槽、第二流槽依次形成检测时供试样溶液流经的初始流道段、第一流道段、第二流道段，第二通孔形成出样口，第三通孔形成microRNA 捕获检测区；所述玻璃基片的贴合面上，在所述TEX捕获检测区贴合对应区域溅射有用于将 TEX捕获检测的TEX三电极体系，在所述microRNA捕获检测区贴合对应区域调溅射有用于将 microRNA捕获检测的microRNA三电极体系，TEX三电极体系包括TEX工作电极、TEX参比电极、TEX对电极，microRNA三电极体系包括microRNA工作电极、microRNA参比电极、microRNA 对电极；所述第一流道段上面设置可使此流道段关闭的第一阀门，所述第二流道段上面设置可使此流道段关闭的第二阀门。
以下为本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片进一步的方案：
所述初始流道段上设置有三角柱阵列，所述凹坑出口呈V形收缩，所述TEX捕获检测区设置有十字柱阵列。
所述TEX对电极与microRNA对电极为1个共享对电极，共享对电极位于出样口下面。
所述TEX工作电极包括在TEX捕获检测区反复迂回布置的迂回段与向外延伸至其接线块的长直条以及其接线块，所述TEX参比电极包括长方形主块与向外延伸至其接线块的长直条以及其接线块；所述共享对电极包括圆形主块与向外延伸至其接线块的长直条以及其接线块；所述microRNA工作电极包括圆形主块与向外延伸至其接线块的长直条以及其接线块，所述 microRNA参比电极向外延伸至其接线块的长直条以及其接线块。
所述第一阀门、第二阀门如此设置：所述PDMS片在第一流槽、第二流槽所在处为遇到压力变形至使其能堵塞第一流道段或第二流道段的薄膜层，在第一流槽、第二流槽上面设置可通入压力气体的封闭空腔。
所述PDMS片是厚度为140μm至160μm的薄片，上面贴合覆盖有PDMS加强片，所述PDMS 加强片上，与所述第一通孔与第二通孔相对应，开设第一延伸通孔与第二延伸通孔，分别形成进样口与出样口；所述第一阀门、第二阀门如此设置：所述PDMS加强片上面分别开设第一通气孔、第二通气孔，所述PDMS加强片的贴合底面在第一流槽、第二流槽所在处分别开设与第一通气孔相通的第一通气槽、与第二通气孔相通的第二通气槽作为封闭空腔，所述第一通气槽、第二通气槽隔着所述PDMS片的第一流槽、第二流槽的槽底厚度与第一流槽、第二流槽形成立体交叉。
所述PDMS加强片上，与所述第三通孔相对应，开设第三延伸通孔，作为microRNA捕获检测区的加液口。
所述封闭空腔如此设置形成：在第一流槽、第二流槽上面分别设置PDMS槽块，PDMS槽块下面开设一端堵住另一端开口的通气槽，开口端用作通入压力气体，PDMS槽块贴合PDMS 片的第一流槽、第二流槽所在处上面，其通气槽在PDMS片上面形成可通入压力气体的封闭空腔。
为了解决上述技术问题，本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片的制作方法所采用的技术方案为：
一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片的制作方法，包括可不分先后各自进行的PDMS片的制作与玻璃基片的制作，及其二者的键合，PDMS片的制作首先包括作为其模具的硅基片的制作与PDMS片的制作，其特征在于，硅基片的制作具体包括以下步骤：采用四寸单晶硅作为衬底，进行热氧化，生长一层2μm厚二氧化硅氧化层；按照设计的版图旋涂光刻胶，厚度为2.5μm，进行一次光刻，采用湿法刻蚀工艺去除二氧化硅层；使用硫酸和双氧水清洗硅基片，去除光刻胶；再次旋涂光刻胶，厚度为1.4μm，进行二次光刻，剩余的微结构体形成具有不同高度微结构的硅基片模具；
所述PDMS片的制作过程如下：(1)、PDMS混合物调制：称量PDMS预聚物和固化剂(重量比15：1)，将二者混匀，置于真空干燥器中静置30min除去大部分气泡；(2)、倒模：PDMS 混合物调制完成后，将倒模版置于水平台上，浇筑调制好的PDMS混合物，静置30min使得倒模版结构中充满了PDMS；(3)、固化：静置完成后，放在80℃的烘箱中加热1h，待固化完成后将其从倒模版上剥离下来；需要打孔的位置，采用打孔器进行打孔；(4)、PDMS层保存：使用PCR沾粘性膜粘贴PDMS层上下两面，封装完成后进行保存；(5)、亲水性处理：将封装好的芯片至于等离子清洗机的真空状态下2h，照射辉光2min；拿出芯片，在进样口滴加 PEG(6-9)-硅氧烷与丙酮混合溶液(v:v＝1:1)，利用PDMS片内负压作用使混合溶液充满整个芯片管道，室温孵育1h；处理完成后使用超纯水冲洗整个芯片，使PDMS片微流道层表面呈现亲水性，以减少对蛋白、核酸等物质的吸附。
所述玻璃基片的制作过程如下：在玻璃基底上，通过光刻、溅射工艺制作各电极金属层，并按照对准标记贴合图形化的PDMS片。
所述PDMS片与玻璃基片二者的键合过程包括，将PDMS片与玻璃基片二者贴合面朝上一起放入等离子清洗机中清洗90s，取出后迅速贴合在一起，在90℃热板上加热30min，以加强两者的结合程度。
所述键合后还包括，在所述TEX捕获检测区与microRNA捕获检测区中加入配置好的纳米金颗粒试剂，45摄氏度放置5小时，待液体蒸发后，电极会形成一层特定超晶格结构的金纳米薄膜；然后分别向TEX捕获检测区和microRNA捕获检测区加入修饰抗体和修饰核酸探针所需试剂固定120min；将溶液吸出后，使用PBS溶液冲洗掉未结合的捕获探针；修饰完毕后，将多余的PDMS层去除掉。
为了解决上述技术问题，本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸的检测方法所采用的技术方案为：
一种肿瘤细胞外泌体与其核酸检测方法，其特征在于，使用如权利要求1至7任一项所述的肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片，先模拟如下所述具体测试过程，将所述的肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片进行测试标定，通过加入一系列已知外泌体浓度值与其microRNA浓度值的不同浓度的肿瘤细胞外泌体试样溶液，测得一系列不同数值的TEX工作电极的氧化电流值与microRNA工作电极的氧化电流值，进行一系列的浓度梯度实验，得到一系列外泌体浓度与其对应TEX工作电极的氧化电流值与一系列microRNA浓度其对应microRNA工作电极的氧化电流值，建立对应的线性关系式，获得TEX工作电极的氧化电流值与外泌体浓度值之间的线性关系式，以及microRNA工作电极的氧化电流值与microRNA工作电极的氧化电流值之间的线性关系式。
检测前使用PBS溶液对整个芯片内腔进行冲洗；具体测试过程如下：
先进行外泌体检测，具体步骤如下：
(1)、关闭第二阀门，使得芯片前半部分形成独立的外泌体检测区。
(2)、在进样口加入待检测试样溶液。
(3)、电极上修饰的生物分子通过生物特异性反应，将试样溶液中的外泌体捕获，使其全部被被吸附在所述TEX工作电极表面上。
(4)、随后，加入PBS冲洗液冲洗芯片通道。
(5)、冲洗完成后，加入带有酶标记的抗体，这些抗体与外泌体特异性结合，形成了典型的抗体-抗原-抗体三明治结构。
(6)、加入电化学指示剂溶液，采用差分脉冲伏安法测得电流值，经测试标定所获得的测得电流值与外泌体浓度值之间的线性关系式换算获得外泌体浓度值；
后进行MicroRNA检测检测，具体步骤如下：
(7)、在外泌体捕获电极上施加低压循环方波电流，使得外泌体裂解，从而得到其内容物中的microRNA。
(8)、打开第二阀门，在第一通孔和第二通孔处同时施加压力，使得裂解液流入microRNA 捕获检测区。
(9)、当包含有microRNA的裂解液流入microRNA捕获检测区后，在该区的microRNA工作电极上修饰的适配体，与microRNA进行生物特异性反应，将裂解液中的microRNA捕获，使其全部被吸附在所述microRNA工作电极表面上。
(10)、吸附完成后，关闭第一阀门，使得芯片后半部分形成独立的microRNA捕获检测区；在microRNA捕获检测区加入甲苯胺蓝指示剂，使该指示剂与microRNA结合，采用差分脉冲伏安法测得电流值，经测试标定所获得的测得电流值与microRNA浓度值之间的线性关系式换算获得microRNA浓度值。
本发明是基于微电极和流体控制微结构，构建肿瘤细胞外泌体特异性捕获、裂解和 microRNA片上检测一体化的生物传感检测方法。其优点在于以下几个方面：(1)将微电极和流体控制微结构相结合，利用修饰特异性捕获探针修饰微电极，可以对TEX高效、高特异性富集和TEX-microRNA高灵敏度检测，提高了检测效率和灵敏度。(2)通过对电极的修饰工作，对microRNA进行检测。生物传感和电化学有机的结合能出色的完成检测任务。(3)简化两套三电极体系，形成“五电极体系”，降低了尺寸、成本。(4)芯片级三孔单腔结构可以分别通过双阀门的控制分别表征外泌体捕获率和microRNA含量，取得了一芯多用的效果，减小成本，提高了实用性和商用性。此外，本发明，并且可批量化制造，成本低，检测灵敏度高等特点，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片基本件组装状态立体示意图。
图2为本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片PDMS片与玻璃基片分离状态立体示意图。
图3为玻璃基片立体示意图。
图4为PDMS片外露面立体示意图。
图5为PDMS片贴合面立体示意图。
图6为三角柱阵列、十字柱阵列示意图。
图7为本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片实施例一整体立体示意图。
图8为实施例一PDMS加强片外露面立体示意图。
图9为实施例一PDMS加强片贴合面立体示意图。
图10为本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片实施例二整体立体示意图。
图11为实施例二各组成件分离状态立体示意图。
图12为PDMS片制作过程中各工序截面形状变化示意图。
图13为玻璃基片制作过程中各工序截面形状变化示意图。
图14为PDMS片与玻璃基片键合示意图。
图12、图13、图14是示意性的，并不与PDMS片或玻璃基片的实际剖面形状相对应。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片，如图1、图2所示，包括相互贴合的玻璃基片1与PDMS片2。如图4、图5所示，PDMS片2间隔开设打穿PDMS片2的第一通孔3、第二通孔4、第三通孔5。如图2或图5所示，PDMS片2的贴合面在第一通孔3与第二通孔4之间开设凹坑6，PDMS片2的贴合面在在第一通孔3与凹坑6之间开设初始流槽7，凹坑6与第二通孔4之间开设第一流槽8，第二通孔4与第三通孔5之间开设第二流槽9，并依次连接。如图1、图2所示，PDMS片2与玻璃基片1贴合后，在玻璃基片1上面，第一通孔3形成进样口，凹坑6形成TEX捕获检测区，初始流槽7、第一流槽8、第二流槽9依次形成检测时供试样溶液流经的初始流道段、第一流道段、第二流道段，第二通孔4形成出样口，第三通孔5形成microRNA捕获检测区。
如图2或图3所示，玻璃基片1的贴合面上，在TEX捕获检测区贴合对应区域溅射有用于将TEX捕获检测的TEX三电极体系，在microRNA捕获检测区贴合对应区域调溅射有用于将 microRNA捕获检测的microRNA三电极体系，TEX三电极体系包括TEX工作电极10、TEX参比电极11、TEX对电极，microRNA三电极体系包括microRNA工作电极12、microRNA参比电极13、microRNA对电极。为了为了简化芯片结构，节约资源，如图2或图3所示，TEX对电极与microRNA对电极为1个共享对电极14，共享对电极14位于出样口下面。
如图2或图5所示，第一流道段上面设置可使此流道段关闭的第一阀门，第二流道段上面设置可使此流道段关闭的第二阀门。
如图2所示，初始流道段上设置有三角柱阵列25，凹坑6出口呈V形收缩，TEX捕获检测区设置有十字柱阵列26。
如图2或图3所示，TEX工作电极10包括在TEX捕获检测区反复迂回布置的迂回段15与向外延伸至其接线块17的长直条16以及其接线块17，TEX参比电极11包括长方形主块18与向外延伸至其接线块17的长直条16以及其接线块17；共享对电极14包括圆形主块19 与向外延伸至其接线块17的长直条16以及其接线块17；microRNA工作电极12包括圆形主块19与向外延伸至其接线块17的长直条16以及其接线块17，microRNA参比电极13向外延伸至其接线块17的长直条16以及其接线块17。
第一阀门、第二阀门如此设置：PDMS片2在第一流槽8、第二流槽9所在处为遇到压力变形至使其能堵塞第一流道段或第二流道段的薄膜层，在第一流槽8、第二流槽9上面设置可通入压力气体的封闭空腔。这种阀门也称作为膜阀。第一阀门、第二阀门具体可按以下2 个实施例的方式选择设置。
实施例一
如图7所示，PDMS片2是厚度为140μm至160μm的薄片，上面贴合覆盖有PDMS加强片20。如图8、图9所示，PDMS加强片20上，与第一通孔3与第二通孔4相对应，开设第一延伸通孔21与第二延伸通孔22，分别形成进样口与出样口。第一阀门、第二阀门如此设置：如图8、图9所示，PDMS加强片20上面分别开设第一通气孔30、第二通气孔31，PDMS加强片20的贴合底面在第一流槽8、第二流槽9所在处分别开设与第一通气孔30相通的第一通气槽23、与第二通气孔31相通的第二通气槽24作为封闭空腔，第一通气槽23、第二通气槽 24隔着PDMS片2的第一流槽8、第二流槽9的槽底厚度与第一流槽8、第二流槽9形成立体交叉。如图8、图9所示，PDMS加强片20上，与第三通孔5相对应，开设第三延伸通孔27，作为microRNA捕获检测区的加液口。
实施例二
如图10、图11所示，封闭空腔如此设置形成：在第一流槽8、第二流槽9上面分别设置 PDMS槽块28，PDMS槽块28下面开设一端堵住另一端开口的通气槽29，开口端用作通入压力气体，PDMS槽块28贴合PDMS片2的第一流槽8、第二流槽9所在处上面，其通气槽29在 PDMS片2上面形成可通入压力气体的封闭空腔。PDMS片2在第一流槽8、第二流槽9所在处削薄至遇到压力变形至使其能堵塞第一流道段或第二流道段的薄膜层，薄膜层厚度为140μm 至160μm。
本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片的制作方法，包括可不分先后各自进行的PDMS 片2的制作与玻璃基片1的制作，及其二者的键合。具体制作过程也可参照本案申请人 2020-07-06申请的ZL 202010639672.2，名称为“一种单细胞温度检测传感器及其制作方法与检测方法”的专利申请的关于PDMS片与玻璃基片制作过程的相关描述。
如图12所示，PDMS片2的制作首先包括作为其模具的硅基片32的制作与PDMS片2的制作，硅基片32的制作具体包括以下步骤：采用四寸单晶硅作为衬底，如图12-1所示，进行热氧化，生长一层2μm厚二氧化硅33氧化层，如图12-2所示；按照设计的版图旋涂光刻胶34，厚度为2.5μm，如图12-3所示，进行一次光刻，如图12-4所示；采用湿法刻蚀工艺去除二氧化硅33层，如图12-5所示；使用硫酸和双氧水清洗硅基片32，去除光刻胶34，如图12-6所示；再次旋涂光刻胶34，厚度为1.4μm，如图12-7所示；进行二次光刻，剩余的微结构体形成具有不同高度微结构的硅基片模具，如图12-8所示。
PDMS片2的制作过程如下：(1)、PDMS混合物调制：称量PDMS预聚物和固化剂(重量比15：1)，将二者混匀，置于真空干燥器中静置30min除去大部分气泡；(2)、倒模：PDMS 混合物调制完成后，将倒模版置于水平台上，浇筑调制好的PDMS混合物，静置30min使得倒模版结构中充满了PDMS，如图12-9所示；(3)、固化：静置完成后，放在80℃的烘箱中加热 1h，待固化完成后将其从倒模版上剥离下来，如图12-10所示；需要打孔的位置，采用打孔器进行打孔；(4)、PDMS层保存：使用PCR沾粘性膜粘贴PDMS层上下两面，封装完成后进行保存；(5)、亲水性处理：将封装好的芯片至于等离子清洗机的真空状态下2h，照射辉光2min；拿出芯片，在进样口滴加PEG6-9-硅氧烷与丙酮混合溶液(v:v＝1:1)，利用PDMS片2内负压作用使混合溶液充满整个芯片管道，室温孵育1h；处理完成后使用超纯水冲洗整个芯片，使 PDMS片2微流道层表面呈现亲水性，以减少对蛋白、核酸等物质的吸附。
玻璃基片1的制作过程如图13所示，在玻璃基底上，通过光刻、溅射工艺制作各电极金属35层。玻璃基片1的具体制作过程也可参照本案申请人2020-07-06申请的ZL202010639672.2，名称为“一种单细胞温度检测传感器及其制作方法与检测方法”的专利申请的关于玻璃基片制作过程的相关描述。
PDMS片2与玻璃基片1二者的键合过程包括，将PDMS片2与玻璃基片1二者贴合面朝上一起放入等离子清洗机中清洗90s，取出后迅速贴合在一起，如图14所示。在90℃热板上加热30min，以加强两者的结合程度。
键合后还包括，在TEX捕获检测区与microRNA捕获检测区中加入配置好的纳米金颗粒试剂，45摄氏度放置5小时，待液体蒸发后，电极会形成一层特定超晶格结构的金纳米薄膜；然后分别向TEX捕获检测区和microRNA捕获检测区加入修饰抗体和修饰核酸探针所需试剂固定120min；将溶液吸出后，使用PBS溶液冲洗掉未结合的捕获探针；修饰完毕后，将多余的 PDMS层去除掉。
本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测方法，使用本发明肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片，先模拟如下具体测试过程，将的肿瘤细胞外泌体与其核酸检测芯片进行测试标定，通过加入一系列已知外泌体浓度值与其microRNA浓度值的不同浓度的肿瘤细胞外泌体试样溶液，测得一系列不同数值的TEX工作电极10的氧化电流值与microRNA工作电极12的氧化电流值，进行一系列的浓度梯度实验，得到一系列外泌体浓度与其对应TEX工作电极10的氧化电流值与一系列microRNA浓度其对应microRNA工作电极12的氧化电流值，建立对应的线性关系式，获得TEX工作电极10的氧化电流值与外泌体浓度值之间的线性关系式，以及microRNA工作电极12的氧化电流值与microRNA工作电极12的氧化电流值之间的线性关系式。
检测前使用PBS溶液对整个芯片内腔进行冲洗；具体测试过程如下：
先进行外泌体检测，具体步骤如下：
(1)、关闭第二阀门，使得芯片前半部分形成独立的外泌体检测区。
(2)、在进样口加入待检测试样溶液。
(3)、电极上修饰的生物分子通过生物特异性反应，将试样溶液中的外泌体捕获，使其全部被被吸附在TEX工作电极10表面上。
(4)、随后，加入PBS冲洗液冲洗芯片通道。
(5)、冲洗完成后，加入带有酶标记的抗体，这些抗体与外泌体特异性结合，形成了典型的抗体-抗原-抗体三明治结构。
(6)、加入电化学指示剂溶液，采用差分脉冲伏安法测得电流值，经测试标定所获得的测得电流值与外泌体浓度值之间的线性关系式换算获得外泌体浓度值；
后进行MicroRNA检测检测，具体步骤如下：
(7)、在外泌体捕获电极上施加低压循环方波电流，使得外泌体裂解，从而得到其内容物中的microRNA。
(8)、打开第二阀门，在第一通孔和第二通孔处同时施加压力，使得裂解液流入microRNA 捕获检测区。
(9)、当包含有microRNA的裂解液流入microRNA捕获检测区后，在该区的microRNA工作电极12上修饰的适配体，与microRNA进行生物特异性反应，将裂解液中的microRNA捕获，使其全部被吸附在microRNA工作电极12表面上。(10)、吸附完成后，关闭第一阀门，使得芯片后半部分形成独立的microRNA捕获检测区；在microRNA捕获检测区加入甲苯胺蓝指示剂，使该指示剂与microRNA结合，采用差分脉冲伏安法测得电流值，经测试标定所获得的测得电流值与microRNA浓度值之间的线性关系式换算获得microRNA浓度值。
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