具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的保护范围进行详细说明，但应当指出的是，本发明的保护范围并不限于以下实施例，同时保护藏药复方在制备治疗犊牛腹泻药物中的应用，包括不同剂型、剂量、联合用药等。凡本领域技术人员按照本发明的思路在现有技术上通过逻辑分析、推断和实验得出的技术方案，均属于本发明所请求保护的范围。

应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本文发明主题做任何限制。在本申请中，必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其他形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。

以下实施例所述的牛津杯(Oxford Cup)法是抗生素效价测定的一种方法，通常可以分为二剂量法和三剂量法。其具体操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml(下层)，待其凝固。此外，将融化的PDA培养基冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固(上层)。以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管)，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入待检样品(发酵液)，牛津杯一般可以装240微升,勿使其外溢。加满后置37℃培养16-18小时，观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。在培养中,一方面试验菌开始生长，另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大。

所述胃肠道疾病包括所有由胃和十二指肠的粘膜损伤引起的胃肠道疾病。胃肠道疾病可由诸如酒精、吸烟、压力、药物及其组合的多种因素引起，但不限与此。导致胃肠道疾病的药物的代表为非甾体抗炎药、类固醇等，但不限与此。非甾体抗炎药的代表为吲哚美辛、双氯芬酸、阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、美洛昔康、萘普生等。

实施例1-5：

本发明提供的用于治疗犊牛腹泻的藏药复方的制备：

藏药复方配方如表1所示，表1中数据为质量比。

表1不同配比的藏药复方

藏药复方口服液的制备方法：

(1)取三颗针、沙棘、诃子、甘青青兰、矮紫堇，按照比例称重，冷水清洗去浮尘；

(2)将步骤(1)取得的药材冷水浸泡24小时；

(3)在密闭煎药机中，加入步骤(2)浸泡好的药材，加入5-10倍体积水，115℃，水煎2小时；

(4)收集步骤(3)水煎好的药液，四层纱布过滤得滤液；

(5)药渣中再加入5-10倍水，重复步骤(3)，115℃，水煎2小时；

(6)收集步骤(5)水煎好的药液，四层纱布过滤得滤液；

(7)合并步骤(4)和步骤(6)的两次滤液，加入旋转蒸发仪，0.05Mpa，60℃，进行药液的浓缩，浓缩至1毫升药液等于1克原药材；

(8)加入0.2％山梨酸钾，装罐封口。

对比实施例：

处方组成：诃子5份、甘青青兰2份、矮紫堇2份，其余为水。

制备工艺：诃子、甘青青兰、矮紫堇按照比例称重，冷水清洗去浮尘，冷水浸泡24小时，在密闭煎药机中，加入5-10倍体积水，115℃，水煎2小时，四层纱布过滤的滤液，药渣中再加入5-10倍水，115℃，水煎2小时，四层纱布过滤得滤液，合并两次药液，加入旋转蒸发仪，0.05Mpa，60℃，进行药液的浓缩，浓缩至1毫升药液等于1克原药材，加入0.2％山梨酸钾，装罐封口。

实施例6、藏药复方的止泻镇痛抑菌效果研究

1.抑菌效果研究

取实施例1按照三颗针200克、沙棘300克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例2按照三颗针300克、沙棘30克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例3按照三颗针200克、沙棘400克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例4按照三颗针100克、沙棘300克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例5按照三颗针300克、沙棘100克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，制备得到的藏药复方口服液，通过牛津杯法对从腹泻犊牛中分离出的高耐药大肠杆菌进行抑菌试验，将高压灭菌后冷却至50℃的MH琼脂培养基倒入直径9mm的一次性塑料培养基，待培养基在紫外灯照射下凝固后，封封口膜置4℃冰箱，备用。将大肠杆菌分离菌株接种于普通营养肉汤，37℃过夜孵育12-16h；使用细菌比浊仪调整营养肉汤培养物至0.5麦氏比浊度。使用灭菌棉签将稀释好的菌液均匀涂布在MH培养基上，保证菌液涂布均匀。在涂布菌液的MH琼脂培养基表面放入4个轻轻加热的灭菌牛津杯(内经6±0.1mm，外径8±0.1mm，高10±0.1mm)，使其与培养基无缝隙接触，将制备好的藏药复方口服液稀释成8个梯度浓度分别为2000mg/mL、1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、64mg/mL、32mg/mL、16mg/mL，浓度由高到低依次编号为1-8，用牛津杯法进行对大肠杆菌抑菌试验。浓度由高到低分别编号1-8，每个牛津杯中加300μL溶液，37℃培养18-24h。游标卡尺测定抑菌圈的大小，重复3次计算其平均值。抑菌直径＜10mm为不敏感；10mm≤抑菌圈直径＜15mm为轻度敏感，15≤抑菌直径＜20mm为中度敏感；抑菌直径＞20mm为高度敏感。实验结果如表2所示，藏药复方对大肠杆菌具有显著的抑菌作用，在浓度为1000mg/mL、500mg/mL、250mg/mL条件下，大肠杆菌对实施例1、实施例3敏感情况相同，分别为中度敏感、中度敏感、轻度敏感，大肠杆菌对实施例5敏感情况分别为中度敏感、轻度敏感、轻度敏感。实施例2、实施例4对大肠杆菌的抑菌浓度过大，因此在动物试验中淘汰。藏药复方实施例1、实施例3、实施例5可以不同程度的抑制大肠杆菌。

表2不同配方在不同浓度下对大肠杆菌的抑菌圈直径

2.镇痛效果研究

本实验采用藏兽药复方药效学试验——醋酸致小鼠扭体试验来研究藏药复方对小鼠的镇痛效果，取实施例1按照三颗针200克、沙棘300克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例3按照三颗针200克、沙棘400克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例5按照三颗针300克、沙棘100克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，制备得到的藏药。BALB/c小鼠50只，体重为(20±2)g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。第一组为模型组，第二组为吲哚美辛阳性对照组(3mg/kg·bw)，第三组为实施例1(2mL/kg·bw)、第四组为实施例3(2mL/kg·bw)、第五组为实施例5(2mL/kg·bw)。模型组小鼠，灌胃给予生理盐水，0.4m L/只；阳性对照组小鼠灌胃给予3mg/kg的吲哚美辛；各组小鼠灌胃给药1h后，每只小鼠腹腔注射0.6％冰醋酸溶液0.2m L，观察并记录在注射冰醋酸后小鼠的扭体的潜伏期及30min内的扭体次数并计算扭体反应抑制率。

抑制率＝(模型组扭体次数－试验组扭体次数)/模型组扭体次数×100％

由表3可知，实施例1、3、5试验组均能明显抑制因腹腔注射冰醋酸引起的扭体次数，且实施例1、3试验组与阳性对照组抑制率相当，说明实施例1、3具有明显的外周镇痛作用。

表3不同组别小鼠的扭体次数与抑制率比较

对不同时间点的小鼠痛阈值进行检测，具体结果见表4，阳性对照组、实施例1、3、5试验组小鼠在30、60、90min时间点的痛阈值同模型组小鼠的痛阈值比较，差异不显著(P>0.05)。在120min，阳性对照组、实施例1、3、5试验组小鼠的痛阈值同模型组小鼠的痛阈值比较，差异显著(P<0.05)。说明实施例1、3、5具有一定的中枢镇痛作用。

表4不同时间点的痛阈值比较

3.抗炎效果研究

取实施例1按照三颗针200克、沙棘300克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例3按照三颗针200克、沙棘400克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例5按照三颗针300克、沙棘100克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，制备得到的藏药口服液。BALB/c小鼠50只，体重为(20±2)g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。第一组为模型组，第二组为吲哚美辛阳性对照组(3mg/kg·bw)，第三组为实施例1(2mL/kg·bw)、第四组为实施例3(2mL/kg·bw)、第五组为实施例5(2mL/kg·bw)。模型组小鼠给予生理盐水，0.4m L/只；小鼠提前连续5天给药，每天灌胃1次，末次给药1h后，取0.03m L二甲苯均匀涂在小鼠右耳前后两面，左耳作对照。1h后将小鼠脱颈处死，用直径8mm打孔器沿耳廓基线两耳相同部位打下两圆耳片，称重，计算肿胀抑制率。

肿胀度＝右耳重-左耳重；肿胀率＝肿胀度/左耳重×100％

肿胀抑制率＝(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度×100％

二甲苯致小鼠耳肿胀试验结果表明(如表5)，实施例1、3、5对二甲苯所导致的小鼠耳肿胀均有一定的抑制效果。实施例1小鼠的肿胀率为54.90％，抑制率为30.66％，同模型组小鼠肿胀率比较，差异极显著(P<0.01)；实施例3鼠肿胀率为56.33％、抑制率为30.0％，同模型组比较，差异显著(P<0.05)。

表5不同组小鼠的耳肿胀率比较

4.肠推进实验

取实施例1按照三颗针200克、沙棘300克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例3按照三颗针200克、沙棘400克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例5按照三颗针300克、沙棘100克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，制备得到的藏药口服液。BALB/c小鼠50只，体重为(20±2)g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。第一组为模型组，第二组为复方地芬诺酯阳性对照组(3mg/kg·bw)，第三组为实施例1(2mL/kg·bw)、第四组为实施例3(2mL/kg·bw)、第五组为实施例5(2mL/kg·bw)。模型组小鼠灌胃给予生理盐水，0.4m L/只；阳性对照组、实施例1、3、5组小鼠按给药剂量每天灌胃一次，连续给药5天。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药1h后，将5.0％炭末混悬液按0.15m L/只给小鼠灌胃，灌胃给药30min后，颈部脱臼处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，置于托盘上。轻轻将肠管摆成直线，测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门至墨汁前沿的距离作为“墨汁在肠管内推进距离”。通过公式计算墨汁推进百分率，并注意观察各组小肠容积是否增大。

炭末推进百分率(％)＝炭末前段到幽门的距离/小肠全长×100％

碳墨推进试验结果表明(如表6)，实施例5小鼠的肠推进率为62.82％，同模型组小鼠肠推进率比较，肠推进率显著降低(P<0.05)；实施例1、3和阳性对照组小鼠的肠推进率与模型组比较，可以极显著降低小鼠的肠推进率(P<0.01)。结果表明，实施例1、3能够显著地降低碳墨推进，具有一定的止泻功能，效果与复方地芬诺酯相似。

表6不同组小鼠的肠推进效果比较

5.番泻叶致泻试验

取实施例1按照三颗针200克、沙棘300克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例3按照三颗针200克、沙棘400克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例5按照三颗针300克、沙棘100克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，制备得到的藏药口服液。BALB/c小鼠50只，体重为(20±2)g，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。第一组为模型组，第二组为复方地芬诺酯阳性对照组(3mg/kg·bw)，第三组为实施例1(2mL/kg·bw)、第四组为实施例3(2mL/kg·bw)、第五组为实施例5(2mL/kg·bw)。模型组小鼠灌胃给予生理盐水，0.4m L/只；阳性对照组、实施例1、3、5组小鼠按给药剂量每天灌胃一次，连续给药5天。末次给药前禁食不禁水12小时，末次给药0.5h后，灌胃浓度为1g/m L番泻叶，0.4mL/只。每只小鼠单笼观察，每笼下铺至吸水滤纸，每隔2小时换一次滤纸，分别计算小鼠在2、4、6h的腹泻指数。

腹泻指数＝稀便率×稀便级×100％

结果表明，给予番泻叶后模型组小鼠的腹泻现象明显增强，实施例1能够在2-4h内极显著地降低番泻叶造成的腹泻，复方地芬诺酯组小鼠腹泻指数1.83，同模型组比较差异显著(P<0.05)，实施例1小鼠的腹泻指数1.75，同模型组比较，差异极显著(P<0.01)。

表7不同组小鼠的腹泻指数比较

6.藏药复方对溃疡性结肠炎的治疗效果

取实施例1按照三颗针200克、沙棘300克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例3按照三颗针200克、沙棘400克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，实施例5按照三颗针300克、沙棘100克、诃子500克、甘青青兰200克、矮紫堇200克，制备得到的藏药口服液。取SPF级BALB/c小鼠50只，随机分为5组，每组10只，适应性喂养一周用于试验。分别为正常对照组、模型组、柳氮磺胺吡啶阳性对照组、复方1、2、3组。用药组小鼠提前给药3d，每天按照柳氮磺胺吡啶阳性对照组(2mg/kg·bw)、实施例1(2mL/kg·bw)、实施例3(2mL/kg·bw)、实施例5(2mL/kg·bw)；模型组和对照组小鼠每天给予相同体积的蒸馏水。除正常对照组外，每组小鼠均自由饮用浓度为3.5％的DSS水，连续饮用6d。每天观察小鼠的粪便性状，进行便潜血检测，对小鼠进行称重。试验结束，分离结肠，冻于-80℃。

藏药复方对小鼠溃疡性结肠炎模型的治疗结果表明，DSS诱发的模型组小鼠在试验的第2d，体重开始减轻，精神萎靡；在试验的第3d开始出现软便、腹泻的现象，便潜血检测为蓝色；试验第4d小鼠活动减少，蜷缩在鼠笼，嗜睡，开始出现血便，体重下降明显，疾病活动指数显著升高(P<0.01)；第3d，小鼠全部出现血便，体重同正常对照组小鼠差异极显著(P<0.01)，疾病活动指数升高极显著(P<0.01)。实施例3干预组小鼠，小鼠精神活动良好，个别小鼠出现软便、腹泻现象，均无血便出现，体重略有增加，从试验第4d小鼠DAI评分极显著低于模型组(P<0.01)。实施例1干预组小鼠，小鼠体重略有下降，试验第4d小鼠体重下降同正常对照组小鼠差异极显著(P<0.01)，精神活动不佳，出现腹泻，试验第5d DAI评分与模型组相比差异极显著(P<0.01)，第6d差异显著(P<0.05)。而采用实施例5干预小鼠，小鼠体重下降明显，与模型组相比稍有好转，但差异不显著(P＞0.05)。由此可见，实施例3对小鼠结肠炎的治疗效果最佳(如图1，2)。

结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)检测结果表明(见图3)，同正常对照组比较，模型组小鼠的结肠组织中MPO活力显著升高(P<0.01)；给药组小鼠结肠组织中MPO活力同模型组比较明显降低，实施例1、3的MPO活性下降同模型组比较，差异极显著(P<0.01)；实施例5与模型组比较，差异显著(P<0.05)；说明实施例1、3、5具有降低结肠炎组织中MPO活力的作用。

丙二醛(MDA)含量、超氧化物岐化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定结果表明，同正常对照组相比，模型组小鼠结肠组织中MDA的含量极显著升高(P<0.01)。与模型组比较，实施例1、5可显著的降低结肠组织中MDA的含量(P<0.01)(见图4)；说明实施例1、5具有降低结肠炎组织中MDA含量至正常水平的作用。DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，结肠组织中SOD、GSH的活力降低。与模型组相比，实施例3小鼠结肠组织中SOD、GSH的活力升高，差异极显著(P<0.01)，阳性对照组、实施例5组差异显著(P<0.05)(见图5,6)，说明实施例1、3具有升高结肠炎组织中SOD、GSH活力的作用。

通过以上大量实验验证得出，本发明的治疗犊牛腹泻的藏药复方具有如下优点：

(1)具有止泻、涩肠的功效。本发明的藏药复方主要由三颗针、沙棘、诃子、甘青青兰和矮紫堇组成。三颗针具有清热燥湿，泻火解毒功效；沙棘具有消食化滞，活血散瘀功效；诃子具有涩肠止泻、敛肺止咳功效；甘青青兰具有和胃疏肝，清热利水功效；矮紫堇具有清热消炎功效。藏药复方极显著降低小鼠的肠推进率，并且显著降低腹泻指数，不影响动物生产性能。

(2)能够抗菌消炎。本发明的藏药复方水煎剂对腹泻犊牛高耐药大肠杆菌分离株有很强的抑菌和杀菌作用，不易产生细菌耐药性。

(3)促进腹泻快速愈合，抑制肠上皮细胞脱落，降低粘膜水肿、减少炎症细胞浸润，降低机体过氧化酶的含量，升高超氧化歧化酶的含量，缓解肠道黏膜损伤，保护肠粘膜。

(4)具有明显的外周镇痛和中枢镇痛作用。