具体实施方式

实施例1 CCl₄所致急性肝损伤模型建立

1.实验动物

由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，实验动物质量合格证号：1107272011003888。

试剂

火炭母胶囊，广西壮瑶药重点实验室，1次4粒，1天3次，1粒胶囊含0.28g浸膏和0.1g 辅料，1g浸膏＝8.88g生药，内容物为棕褐色粉末；羧甲基纤维素钠，国药集团化学试剂有限公司，批号：20151215；白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、IV型胶原(COLN)、III型前胶原肽(PCIIINP)、一氧化氮 (NO)和羟脯氨酸(HYP)ELISA试剂盒，江苏酶免实业有限公司，批号均为202006；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、IL-1β、IL-6、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、一氧化氮(NO)、过氧化氢酶(CAT)和肿瘤坏死因子α(TNF-α) ELISA试剂盒，江苏酶免实业有限公司，批号均为202009；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20200923；BCA蛋白法含量试剂盒，上海北沪生物科技有限公司，批号：20200619；谷丙转氨酶(ALT)试剂盒，上海科华生物工程股份有限公司，批号：20200422；谷氨酰转移酶(GGT)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号：92638110；总胆红素(TBIL)试剂盒，北京利德曼生化股份有限公司，批号： 19112708；白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)和谷草转氨酶(AST)试剂盒，浙江伊利康生物技术有限公司，批号分别为200301、200401和200401；水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160225；四氯化碳(CCl4)，上海麦克林生化科技有限公司，批号： C11136534；橄榄油，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：E202108等。

仪器

MH-693型电子天平，东莞市明衡电子科技有限公司；ES 2220M型电子天平，瑞士普利赛斯公司；0104型生物安全型独立通风笼具(IVC笼)，深圳市泓腾生物科技有限公司；5810R型高速冷冻离心机，德国艾本德公司；Epoch2型酶标仪，美国Bio-Tek Instruments公司；TENLIN-C型匀浆仪，江苏天翎仪器有限公司；MDF-U74V型-80℃冰箱，日本 Panasonic公司；Direct-Q 5 UV-R型超纯水仪，美国默克密理博公司；DHG-9240A型鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；7180型全自动生化分析仪，日本HITACHI公司等。

4.饲养环境

饲养于广西中医药大学实验动物中心屏障环境，符合SPF级要求，实验动物使用许可证号为SYXK(桂)2019-0001。使用中央空调，室温控制在19.0℃～25.0℃，相对湿度控制在 40.0％～70.0％，照明明暗控制为12h/12h；大鼠饲养在无毒、耐高压、耐高温、耐腐蚀的IVC塑料笼盒中，不超过6只/笼，饲喂SPF级大鼠维持饲料，自由摄食、饮用纯净水。

方法

选取健康SD大鼠72只，按体重使用Excel软件区组分层随机分组法随机分为6组，每组 12只，分别为正常组、模型组、水飞蓟素组(120mg/kg)^[2]、火炭母胶囊低、中、高剂量组(240、479和958mg/kg)。除正常组大鼠，不做任何干预外，其余大鼠按3mL/kg(首次 5mL/kg)腹部皮下注射40％CCl4橄榄油液，每周2次，间隔2～3d，持续8w。造模开始同时药物干预，正常组和模型组大鼠，按10mL/kg灌胃给予0.5％CMC-Na，其余各组大鼠按10mL/kg灌胃给予火炭母胶囊药液或水飞蓟素药液，按每天1次，连续给药8w^[1-3]。记录给药前及药后每周体重1次。

一般临床观察 每天药后观察，记录大鼠的精神、活动、呼吸、体形、步态、被毛、皮肤、异常分泌物(口鼻、眼睛、耳廓、会阴部等)、粪便等是否异常及死亡情况。

采血

Day₅₆，禁食不禁水14h～16h，末次药后1h，采用眼眶后静脉丛采血3mL，静置1h～2h后，3000rpm，离心10min，收集上清液，用于肝功能指标检测；按3mL/kg剂量腹腔注射 10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉，腹主动脉采血，3000rpm，离心10min，收集上清液，用于氧化应激指标和炎症因子指标检测。

取材及病理检查

采血结束，剪断腹主动脉急性失血法处死大鼠，迅速分离肝脏、脾脏和胸腺，称重，计算脏器系数(g/100g)。脏器系数＝100×(脏器重量/体重)。

分离肝脏左上叶，置于10％福尔马林溶液中固定，6h后更换新鲜10％福尔马林溶液 1次，固定24h以后，制备病理片，经苏木素-伊红染色(HE染色)，光镜下观察组织病理学改变。

观察肝组织颜色、质地、大小等变化，记录并拍照。分离肝脏左上叶，置于10％福尔马林溶液中固定，6h后更换新鲜10％福尔马林溶液1次，固定24h以后，制备病理片，经苏木素-伊红染色(HE染色)和Masson染色(胶原纤维染色法)，光镜下观察组织病理学改变和肝纤维化程度。

分离肝脏左下叶，同一部位取材肝组织约300mg，按肝重量∶体积＝1∶9加入冰生理盐水，剪碎，使用均质仪制成10％肝组织匀浆，3000rpm，离心10min，收集上清液。采用 BCA法检测肝组织匀浆上清液蛋白水平(ug/mL)，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

肝功能指标

使用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、GGT、ALB、TP和TBIL水平。

肝纤维化指标

使用ELISA法检测血清HA、LN、PCIIINP、COLIV、TGF-β、HYP水平和肝组织TGF-β水平。

氧化应激指标

取血清样品或肝组织匀浆上清液，检测其SOD、MDA、GSH、GSH-Px、CAT和NO水平。

炎症细胞因子指标

取血清样品或肝组织匀浆上清液，使用ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

数据统计

使用SPSS17.0统计，以(±s)形式表示，当P＜0.05则认为数据差异有统计学意义。

计量数据，符合正态分布和方差齐性，采用单因素方差检验分析，使用LSD Test进行两两比较分析；若数据非正态或方差不齐，采用Kruskal-Wallis H Test分析，使用Mann-Whitney U test进行两两比较分析。

实施例2火炭母胶囊抗急性肝损伤的药效试验

1.体重

与正常组比较，W₄～W₇及实验结束，模型组大鼠体重均显著降低(P＜0.01)，W₂～W₇及实验结束，体重增长及总增长均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；与模型组比较，W₃～W₇及实验结束，水飞蓟素组大鼠体重均增加，其中W₇大鼠体重和终末体重显著增加(P＜0.05或P＜0.01)，W₃～W₅和W₇，大鼠体重增长及总增长显著增加(P＜0.05)；W₃～W₇及实验结束，火炭母胶囊各剂量组大鼠体重增加，其中W₅、W₆低剂量组、W₄～W₇及实验结束中、高剂量组大鼠体重显著增加(P＜0.05或P＜0.01)，除W₇低剂量组大鼠体重增长减少外，W₂～W₇火炭母胶囊各剂量组大鼠体重增长均增加，其中W₂中剂量组、W₃～W₄各剂量组及中、高剂量组总增长显著增加(P＜0.05或P＜0.01)。故认为CCl₄可导致大鼠体重减轻，体重增长减慢，而火炭母胶囊对CCl₄所致大鼠体重减轻和体重增长减少，具有明显的改善作用，详见表1～表6。

表1火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠体重的影响(±s)

Table.1 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，括号内为存活动物数。

表2火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠体重的影响(±s)

Table.2 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，低剂量组W₄、W₅动物数n＝9。

表3火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠体重的影响(±s)

Table.3 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表4火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠体重增长的影响(±s)

Table.4 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，括号内为存活动物数。

表5火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠体重增长的影响(±s)

Table.5 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，括号内为存活动物数。

表6火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠体重增长的影响(±s)

Table.6 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

脏器重量和脏器系数

所有组别大鼠胸腺重及系数、脾重及系数差异均不具显著性(P＞0.05)。与正常组比较，模型组大鼠肝重量及系数均显著增加(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝重量及系数均显著增加(P＜0.01)；火炭母胶囊各剂量组大鼠肝重量均显著增加(P＜0.01)，火炭母胶囊低、高剂量组大鼠肝系数显著增加(P＜0.01)，故认为CCl₄可导致大鼠肝重量及系数增加，但随着肝纤维化加重，肝重量及系数又会减少，火炭母胶囊各剂量组大鼠肝重量及系数高于模型组，是否属于肝损伤改善，应结合病理检查综合分析，详见表7、表8。

表7火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠脏器重量的影响(±s)

Table.7 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson organ weight ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表8火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠脏器系数的影响(±s)

Table.8 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson organ indexes ofliver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

肝功能指标

与正常组比较，模型组大鼠肝功能指标ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平均显著升高(P＜0.01)，而ALB、TP和A/G水平均显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而ALB、TP 和A/G水平均升高，其中TP和A/G水平显著升高(P＜0.05或P＜0.01)；除低剂量组大鼠 ALT和GLOB水平差异不具显著性外(P＞0.05)，火炭母各剂量组大鼠ALT、AST、TBIL、 GLOB和GGT水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，除低剂量组大鼠ALB水平差异不具显著性外(P＞0.05)，火炭母各剂量组大鼠ALB、TP和A/G水平均显著升高(P＜0.05或 P＜0.01)，故认为CCl₄可导致大鼠肝功能指标异常改变，而火炭母胶囊对CCl₄所致大鼠肝功能指标异常改变具有明显的改善作用，详见表9～表11。

表9火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝功能指标的影响(±s)

Table.9 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver functionindicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表10火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝功能指标的影响(±s)

Table.10 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver functionindicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表11火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝功能指标的影响(±s)

Table.11 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver functionindicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

4.肝纤维化指标

与正常组比较，模型组大鼠血清HA、LN、PIIINP、COLIV、HYP、TGF-β和肝TGF-β水平均显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠血清HA、LN、PIIINP、COL IV、HYP、TGF-β和肝TGF-β水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠血清HA、LN、PIIINP、COLIV、HYP、TGF-β和肝TGF-β水平均降低，其中各剂量组大鼠血清HA、PIIINP、COLIV、HYP，高剂量组LN，中高剂量组TGF-β和肝TGF-β水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，故认为CCl₄可导致大鼠肝纤维化指标表达增强，而火炭母胶囊对CCl₄所致大鼠肝纤维化指标表达增强具有明显的抑制作用，详见表12～表14。

表12火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标水平的影响(±s)

Table.12 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum liverfibrosis indicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表13火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标水平的影响(±s)

Table.13 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum liverfibrosis indicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表14火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝纤维化指标水平的影响(±s)

Table.14 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver fibrosisindicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

5.氧化应激指标

与正常组比较，模型组大鼠血清及肝SOD、CAT、GSH和GSH-PX水平均显著降低 (P＜0.01)，MDA和NO水平均显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠血清及肝SOD、CAT、GSH和GSH-PX水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，MDA和NO水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠血清及肝SOD、CAT、GSH和GSH- PX水平均升高，MDA和NO水平均降低，低剂量组血清MDA水平显著降低(P＜0.01)，肝GSH-PX水平显著升高(P＜0.05)，中高剂量组血清及肝SOD、CAT和GSH-PX水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，肝GSH水平显著升高(P＜0.05)，MDA和NO水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，高剂量组血清GSH水平显著升高(P＜0.05)，故认为CCl₄可导致大鼠血液和肝组织氧化应激指标异常，而火炭母胶囊对CCl₄所致大鼠血液和肝组织氧化应激指标异常具有明显的改善作用，详见表15～表18。

表15火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清氧化应激指标水平的影响(±s)

Table.15 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表16火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清氧化应激指标水平的影响(±s)

Table.16 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表17火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝氧化应激指标水平的影响(±s)

Table.17 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表18火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝氧化应激指标水平的影响(±s)

Table.18 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

炎症细胞因子指标

与正常组比较，模型组大鼠血清及肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著升高 (P＜0.01)，IL-10水平均显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠血清及肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，其中血清IL-1β和IL-6水平显著降低(P＜0.01)，IL-10水平显著升高(P＜0.01)，肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，其中各剂量组IL-1β，中高剂量组IL-6及高剂量组TNF-α水平显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，中高剂量组IL-10水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，故认为CCl₄可导致大鼠血液和肝组织炎症细胞因子指标异常，而火炭母胶囊对CCl₄所致大鼠血液和肝组织炎症细胞因子指标异常具有明显的改善作用，详见表19～表22。

表19火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清炎症因子水平的影响(±s)

Table.19 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表20火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清炎症因子水平的影响(±s)

Table.20 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表21火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝组织炎症因子水平的影响(±s)

Table.21 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表17火炭母胶囊对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝组织炎症因子水平的影响(±s)

Table.17 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl₄(±s)

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

病理学检查

7.1大体剖检肉眼观察

正常组大鼠肝脏红润，质地柔软，表面平滑色泽光亮均匀，无杂色；模型组大鼠肝脏色泽偏浅无光泽，表面粗糙，有明显小颗粒样凸起，萎缩，体积明显缩小，质地变硬；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝脏病理性改变明显减轻，虽较正常组肝脏体积偏大，但颜色较红润，表面光滑有光泽，无小颗粒样凸起，质地柔软；火炭母胶囊低剂量组大鼠病理性改变明显减轻，虽较正常组肝脏体积偏大，色泽偏浅无光泽，但表面光滑，无明显萎缩，无小颗粒样凸起，质地柔软；中、高剂量组大鼠肝脏病理性改变明显减轻，虽较正常组肝脏体积偏大，但颜色较红润，表面光滑有光泽，无小颗粒样凸起，质地柔软。故认为CCl₄干预56d可导致大鼠肝组织发生病理学改变，主要肉眼观察可见色泽偏浅无光泽，表面粗糙，有明显小颗粒样凸起，萎缩，体积明显缩小，质地变硬；而火炭母胶囊可不同程度减轻CCl₄所致的病理性改变，其中以中、高剂量作用最佳。

病理学镜下观察结果

正常组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，细胞结构清晰，核仁居中，大而圆，呈索状排列，无坏死及脂肪变性；模型组大鼠肝细胞损伤严重，镜下观察不到正常的肝小叶，肝小叶结构消失，或出现假肝小叶，大面积肝细胞水肿、坏死、空泡形成、气球样变或挤压，细胞排列紊乱，细胞核皱缩、核仁破裂或核膜消失；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝细胞损伤明显改善，细胞水肿程度明显减轻，坏死、空泡形成和气球样变的肝细胞明显减少，镜下可观察到多个未发生病变的正常肝小叶，细胞核皱缩、破裂的数目明显减少；火炭母胶囊各剂量组大鼠大鼠肝细胞损伤明显改善，血管周围病变面积明显缩小，坏死、空泡形成和气球样变的肝细胞面积明显缩小，中剂量组镜下可观察到多个未发生病变的正常肝小叶。说明火炭母胶囊可不同程度减轻CCl₄所致的病理性改变，其中以中剂量作用最佳。

病理学Masson染色镜下观察结果

正常组大鼠汇管区周围可见少量蓝染的胶原纤维，肝组织内未见明显胶原沉积；模型组大鼠肝组织可见广泛纤维化，汇管区周围有大量蓝染的胶原纤维，胶原增生明显，形成纤维隔，假小叶结构清晰可见；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠汇管区蓝染的胶原纤维明显减少，肝组织胶原增生明显减少，观察不到假小叶结构；火炭母胶囊各剂量组大鼠肝组织胶原增生明显减少，汇管区蓝染的胶原纤维明显减少，肝组织纤维化病理改变明显改善，其中以中、高剂量改善最为明显。