低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法
阅读说明：本技术 低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法 (High-throughput screening method for low-acetaldehyde-yield beer industrial yeast ) 是由 董建军 赵鑫锐 尹花 李江华 陈坚 堵国成 孙可澄 陈璐 于 2021-01-08 设计创作，主要内容包括：本发明提出一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法,属于发酵工程和微生物育种的技术领域。本发明通过对啤酒工业酵母进行～(60)Coγ诱变育种,获得庞大的突变菌株库；随后通过高浓度乙醛及乙醇-双硫仑平板及其驯养液对突变菌株进行平板筛选和长期驯化,将驯养菌液涂布于筛选平板,获得初筛菌株；再通过低乙醛合成及强乙醛代谢的高通量复筛手段,获得低产乙醛啤酒工业酵母。经摇瓶水平啤酒模拟酿造体系的验证,突变菌株的乙醛产量降低了60％以上,且发酵液主体风味与出发菌株无异。本发明解决了目前对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。(The invention provides a high-throughput screening method of beer industrial yeast with low acetaldehyde yield, belonging to the technical field of fermentation engineering and microbial breeding. The invention is carried out by carrying out the steps on the yeast in the beer industry 60 Performing Co gamma mutation breeding to obtain a huge mutant strain library; then, carrying out plate screening and long-term domestication on the mutant strain through a high-concentration acetaldehyde and ethanol-disulfiram plate and a domestication solution thereof, and coating the domestication bacterial solution on a screening plate to obtain a primary screening strain; and then the beer industrial yeast with low acetaldehyde yield is obtained by a high-flux re-screening means of low acetaldehyde synthesis and strong acetaldehyde metabolism. Proved by a shake flask horizontal beer simulated brewing system, the acetaldehyde yield of the mutant strain is reduced by more than 60 percent, and the main body wind of the fermentation liquor isThe smell is the same as that of the original strain. The invention solves the problems of high screening difficulty and low efficiency of the beer industrial yeast with low acetaldehyde yield at present.)
技术领域
本发明属于发酵工程和微生物育种技术领域，尤其涉及一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法。
背景技术
啤酒是世界三大古酒之一，起源于九千多年前的中东和古埃及地区，于二十世纪初传入中国。目前，中国已成为全球啤酒产销大国。伴随着我国啤酒行业的发展日趋成熟、啤酒市场逐步扩张，风味及稳定性一直是啤酒行业的研究热点。
乙醛(CH3CHO)是啤酒中的一种高挥发性、高反应活性、低分子量的羰基化合物，直接影响了啤酒的风味和风味稳定性。常温常压下，沸点为21℃，易于与水混合，存在可逆平衡。此外，乙醛可以与大量亲核物质发生反应，易与啤酒中其他醛、酮和酯类化合物发生缩合反应。适量的乙醛会赋予啤酒独特的品质特征，若含量过高，易产生不愉快的青草、烂苹果等味道；若贮藏时间过长，甚至出现老化风味。
影响成品啤酒中乙醛含量高低的因素包括原辅料、啤酒工业酵母、酿造工艺、储存及物流条件等。长期工业实践中，学者们相继提出了啤酒中乙醛含量的控制措施。然而，控制生产工艺不具有普遍适用性，构建酵母工程菌不符合食品安全规范，难以彻底解决啤酒风味的问题。
啤酒工业酵母从根本上决定了啤酒产品中风味物质乙醛的形成和积累。发酵过程中，酵母将可发酵糖类通过EMP途径生成丙酮酸，在丙酮酸脱羧酶作用下，形成乙醛和CO2。其中大部分乙醛受到酵母乙醇脱氢酶1的作用还原成乙醇，乙醇也可以在乙醇脱氢酶2的作用下氧化成乙醛；少量乙醛被乙醛脱氢酶氧化成乙酸。因此，筛选优良的低产乙醛啤酒工业酵母菌株将成为有效解决啤酒风味稳定性和啤酒食品安全问题的途径之一。
突变菌株的筛选指标主要包括关键酶活性变化和游离态乙醛含量。而低乙醛啤酒工业酵母菌株的选育，归根结底是筛选代谢物乙醛产量降低的啤酒工业酵母菌株。因此，准确地测定出发和改良菌株的乙醛产量是成功选育菌种的必要手段。
现阶段啤酒生产企业一般多用筛选培养基在试管、摇瓶、EBC管中发酵培养，利用气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和核磁共振技术(NMR)进行游离态乙醛含量的检测。菌株培养工作量大、效率低；GC法和HPLC法需要对样品进行固相微萃取或衍生化处理；NMR技术所依托的核磁共振仪价格昂贵，直接导致了检测成本的上升。因此，需要建立一套属于低产乙醛啤酒工业酵母菌株的简便、低成本的高通量筛选模型。
发明内容
本发明提供了一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法，该方法解决了现有对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法，包括以下步骤：
对啤酒工业酵母进行60Coγ诱变处理，构建突变菌株库；
利用高浓度乙醛平板及乙醇-双硫仑平板对突变菌株进行平板筛选，并利用对应上述各平板的液体驯化培养基对其进行长期驯化，将驯养菌液分别涂布于上述平板，获得初筛菌株；
利用低乙醛合成能力及强乙醛代谢能力对初筛菌株进行高通量复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒工业酵母。
作为优选，获得初筛菌株具体包括以下步骤：
1)对突变菌株库中的啤酒工业酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；
2)对细胞悬浮液进行60Coγ照射，将照射后的菌液立即涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，恒温培养；
3)挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化，驯化过程中逐步提高各平板中乙醛及双硫仑的筛选浓度；
4)分别吸取适量驯化菌液涂布于上述平板，得到初筛菌株。
作为优选，所述步骤1)中，菌落的生长温度为25-35℃，培养时间为6-20h；
菌体离心后洗涤重悬于含有1-20％甘油的无菌生理盐水中，并将浓度稀释至1×104-1×108个/mL。
作为优选，所述步骤2)中，选取0-2.0kGy的辐照剂量，吸取5-200μL辐照菌液涂布于筛选平板；
所述高浓度乙醛平板为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基，所述乙醇-双硫仑平板为含有0-50g/L乙醇、0-5mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
恒温的培养温度为20-40℃，培养时间为12-120h。
作为优选，所述高浓度乙醛驯化培养基为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基；
所述乙醇-双硫仑驯化培养基为含有0-50g/L乙醇、0-10mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
驯化的驯化温度为20-40℃，驯化时间为5-70d。
作为优选，低乙醛合成能力的高通量筛选方法具体为：
将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤重悬，稀释至OD600为5时，按1％的接种量接入含有5g/L乙醇的基础碳源培养基的96深孔细胞培养板，用6mm橡胶密封帽盖密封，以30℃、200rpm条件培养，每24h定期取样，检测乙醛生成情况。
作为优选，强乙醛代谢能力的高通量筛选方法具体为：
将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤，离心弃上清，加入100mg/L乙醛标准溶液，保证60μL溶液的OD600为0.15，每隔30min取样，检测乙醛余量。
作为优选，在得到复筛菌株后，还包括通过实验室摇瓶水平发酵对所得复筛菌株的风味物质进行测定的步骤。
作为优选，所得低产乙醛啤酒工业酵母的乙醛产量降低60％以上，且主体风味与最初进行筛选的啤酒工业酵母菌株无显著差异。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明通过对啤酒工业酵母进行60Coγ诱变育种，获得突变菌株库；随后通过高浓度乙醛及乙醇-双硫仑平板及其驯养液对突变菌株进行平板筛选和长期驯化，将驯养菌液涂布于筛选平板，获得初筛菌株；再通过低乙醛合成及强乙醛代谢的高通量复筛手段，获得低产乙醛啤酒工业酵母。经摇瓶水平啤酒模拟酿造体系的验证，突变菌株的乙醛产量降低了60％以上，且发酵液主体风味与出发菌株无异，具备较高的工业应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的乙醇-双硫仑驯养液优化过程示意图；
图2为本发明实施例提供的复筛实验密封性优化过程示意图；
图3为本发明实施例提供的不同培养基显色反应干扰示意图；
图4为本发明实施例提供的低乙醛合成法条件优化过程示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法，包括以下步骤：
对啤酒工业酵母进行60Coγ诱变处理，构建突变菌株库；
利用高浓度乙醛平板及乙醇-双硫仑平板对突变菌株进行平板筛选，并利用对应上述各平板的液体驯化培养基对其进行长期驯化，将驯养菌液分别涂布于上述平板，获得初筛菌株；
利用低乙醛合成能力及强乙醛代谢能力对初筛菌株进行高通量复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒工业酵母。
上述方案中，60Coγ诱变处理具体为：挑取啤酒工业酵母菌株单菌落，接种于YPD培养基中，30℃、220rpm培养至对数中期。离心，弃去上清，用无菌生理盐水洗涤2次并重悬，稀释菌液浓度为1×106个/mL。取2mL菌悬液置于细胞培养皿中，封口膜密封，辐照剂量为0.8kGy，进行γ射线处理。
在一优选实施例中，获得初筛菌株具体包括以下步骤：
1)对突变菌株库中的啤酒工业酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；
2)对细胞悬浮液进行60Coγ照射，将照射后的菌液立即涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，恒温培养；
3)挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化，驯化过程中逐步提高各平板中乙醛及双硫仑的筛选浓度；
4)分别吸取适量驯化菌液涂布于上述平板，得到初筛菌株。
在一优选实施例中，所述步骤1)中，菌落的生长温度为25-35℃，培养时间为6-20h；菌体离心后洗涤重悬于无菌生理盐水中，并将浓度稀释至1×104-1×108个/mL。
在一优选实施例中，所述步骤2)中，选取0-2.0kGy的辐照剂量，吸取5-200μL辐照菌液涂布于筛选平板；
所述高浓度乙醛平板为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基，所述乙醇-双硫仑平板为含有0-50g/L乙醇、0-5mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
恒温的培养温度为20-40℃，培养时间为12-120h。
在一优选实施例中，选择高浓度乙醛平板的初始筛选浓度为2.8g/L，选择乙醇-双硫仑平板的初始筛选条件为含有10g/L乙醇、0.3mg/L双硫仑的基础碳源培养。
在一优选实施例中，所述步骤3)中，生长优势菌株为生长速度快、单菌落形状规则、体积较大的突变菌株。
在一优选实施例中，所述步骤3)中，所述高浓度乙醛驯化培养基为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基；
所述乙醇-双硫仑驯化培养基为含有0-50g/L乙醇、0-10mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
驯化的驯化温度为20-40℃，驯化时间为5-70d。
在一优选实施例中，选择乙醇浓度为10g/L、双硫仑浓度为2.5mg/L的基础碳源液体培养基作为乙醇-双硫仑驯养液的初始驯养条件，选择乙醛浓度为3.7g/L的YPD液体培养基作为高浓度乙醛驯养液的初始条件。
在一优选实施例中，低乙醛合成能力的高通量筛选方法具体为：
将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤重悬，稀释至OD600为5时，按1％的接种量接入含有5g/L乙醇的基础碳源培养基的96深孔细胞培养板，用6mm橡胶密封帽盖密封，以30℃、200rpm条件培养，每24h定期取样，检测乙醛生成情况。
在一优选实施例中，强乙醛代谢能力的高通量筛选方法具体为：
将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤，离心弃上清，加入100mg/L乙醛标准溶液，保证60μL溶液的OD600为0.15，每隔30min取样，检测乙醛余量。
在一优选实施例中，在得到复筛菌株后，还包括通过实验室摇瓶水平发酵对所得复筛菌株的风味物质进行测定的步骤。具体方法如下：
p)菌株变温扩培，静置取酵泥；接种于麦汁，密封；
q)静置培养一段时间，待糖度降低，前酵结束；
r)静置发酵一段时间，后酵结束；
s)利用顶空气相色谱法，检测发酵液中的乙醛等主体风味物质含量，内标为3-庚酮。
在一优选实施例中，在步骤p)中，接种量为1×104-1×108CFU/mL；
所述密封方式为发酵栓密封，加水液封。
在一优选实施例中，在步骤q)中，所述静置培养条件为5-20℃静置培养5-15d；
所述前酵结束的标志为糖度降低至3-8°Bx。
在一优选实施例中，在步骤r)中，所述静置培养条件为0-8℃，静置培养5-15d。
在一优选实施例中，在步骤s)中，所述主体风味物质包括乙醛、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇；
所述3-庚酮的浓度为10-50mg/L。
在一优选实施例中，所得低产乙醛啤酒工业酵母的乙醛产量降低60％以上，且主体风味与最初进行筛选的啤酒工业酵母菌株无显著差异。
实施例1筛选平板的建立及优化
选择高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板作为突变菌株的初筛平板。
乙醇-双硫仑平板：选用乙醇作为唯一的碳源，在YNB和基础碳源培养基中分别添加5、10、20、40g/L乙醇和0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0mg/L双硫仑。菌液洗涤后，涂布于乙醇-双硫仑筛选平板(20mL)，30℃恒温培养60h。观察平板表面有无生长优势菌株。
高浓度乙醛平板：设置平板中乙醛浓度分别为2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0g/L。洗涤菌液后，吸取50μL涂布于相应平板，封口膜密封。30℃静置培养60h，观察菌落生长情况。选择高浓度乙醛平板的初始筛选浓度为2.8g/L。
表1 YNB-乙醇-双硫仑平板中的菌落数
注：菌落数以如下符号表示：++++(≥50个)、+++(15-50个)、++(5-15个)、+(0-5个)、-(无)
表2基础碳源-乙醇-双硫仑平板中的菌落数
注：菌落数以如下符号表示：++++(≥50个)、+++(15-50个)、++(5-15个)、+(0-5个)、-(无)
表3高浓度乙醛平板中的菌落数
注：菌落数以如下符号表示：++++(≥50)、+++(15-50个)、++(5-15个)、+(0-5个)、-(无)。
最终确定含有10g/L乙醇、0.3mg/L双硫仑的基础碳源培养基作为初筛平板的初始筛选条件，选择高浓度乙醛平板的初始筛选浓度为2.8g/L。
实施例2驯养条件的优化
乙醇-双硫仑驯养液：选用乙醇作为唯一的碳源，在YNB和基础碳源液体培养基中分别添加5、10、20、40g/L乙醇和0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L双硫仑。菌液经生理盐水洗涤后稀释至OD600＝5，按1％的接种量接入3mL乙醇-双硫仑驯养液观察菌体生长情况。
如图1所示，菌体在基础碳源液体培养基中的生长情况优于YNB液体培养基。为了保证足够的碳源供给、同时防止过量乙醇对菌体的生长抑制，选择乙醇浓度为10g/L、双硫仑浓度为2.5mg/L的基础碳源液体培养基作为乙醇-双硫仑驯养液的初始驯养条件。
高浓度乙醛驯养液：为得到精确的乙醛培养液临界浓度，设置乙醛标准溶液浓度分别为3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6g/L，接入活化菌液至初始OD600为0.2左右。30℃，220rpm，培养20h后，记录不同浓度下的菌株生长情况。
表4高浓度乙醛驯养液的确立
结果表明，乙醛标准溶液浓度介于3.6-3.8g/L区间时，菌体生长开始出现较大抑制。选择乙醛浓度为3.7g/L的YPD液体培养基作为高浓度乙醛驯养液的初始条件。
最终：取50μL辐照菌液分别涂布于乙醛含量为2.8g/L的高浓度乙醛平板和含有10g/L乙醇、0.3mg/L双硫仑的基础碳源平板，30℃恒温培养60h。挑取生长优势菌株，分别接入乙醛含量为3.7g/L的高浓度乙醛驯养液和含有10g/L乙醇、2.5mg/L双硫仑的基础碳源驯养液，30℃恒温连续驯养15d，期间不断提高驯养液中乙醛及双硫仑的浓度(乙醇-双硫仑驯化液中保持乙醇浓度不变，以0.1mg/L为梯度，将双硫仑浓度由2.5mg/L增加至2.7mg/L；高浓度乙醛驯化液中以0.1g/L为梯度，将乙醛浓度由3.7g/L增加至3.9g/L)。
实施例3复筛实验密封性的优化
为最大限度的减少实验中乙醛的挥发，对实验过程中密封方式、孔板规格和枪头数目进行优化。结果表明，如图2所示，相同的培养条件下，密封性：6mm橡胶密封帽盖＞BioTss无菌透明密封膜＞96浅孔板配套密封盖；深孔板相较浅孔板的乙醛余量更大，密封性更佳；枪头对乙醛标准溶液中乙醛的挥发无明显影响，但有效阻碍了菌体的沉降。
实施例4显色试剂的选择
配制不同浓度的乙醛标准溶液，分别与希夫试剂、亚硝基铁氰化钾、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙反应显色。
希夫试剂法：配制浓度为0-2000mg/L的乙醛标准溶液，吸取5mL溶液于洁净干燥的离心管中，加入1mL希夫试剂，加塞摇匀，置于20℃水浴中避光保温20min，测定吸光度OD520。
亚硝基铁氰化钠：配制浓度为0-2000mg/L的乙醛标准溶液，吸取5mL溶液于洁净干燥的比色管中，加入0.5mL，1％亚硝基铁氰化钠溶液及0.5mL，1mol/L氢氧化钠溶液，20℃水浴中避光保温20min，520nm时测定吸光值。
3-甲基-2-苯并噻唑酮腙法：配制浓度为0-1000mg/L的乙醛标准溶液，吸取0.5mL溶液于洁净干燥的比色管中，加入1mL，0.04g/L MBTR溶液，混合并静置20min；加入1mL，0.1g/L氯化铁溶液，混合并静置10min；加入2.5mL去离子水，混合均匀，610nm时测定吸光值。
3-甲基-2-苯并噻唑酮腙与乙醛反应显色的高通量检测方法：吸取25μL样品于96孔细胞培养板中，加入50μL，0.04g/L MBTR溶液，混合并静置20min；加入50μL，0.1g/L氯化铁溶液，混合并静置10min；加入125μL去离子水，混合均匀，610nm时测定吸光值。
表5显色试剂的确立
结果表明，三种分光光度法中，3-甲基-2-苯并噻唑酮腙法的精密度相对较好，在检测限条件下颜色变化较为明显，检测限相对最低。发酵结束时，啤酒中乙醛含量基本维持在2-20mg/L，3-甲基-2-苯并噻唑酮腙法线性范围广，可精确测定出啤酒中的乙醛含量。因此，最终确定3-甲基-2-苯并噻唑酮腙作为显色试剂。
实施例5低乙醛合成法-高通量筛选方法的优化
1)培养基的优化：
为了防止探究培养基中各成分对终反应显色度的影响，分别对8种溶液进行3-甲基-2-苯并噻唑酮腙法显色反应。如图3所示，选取基底干扰小的含有5％乙醇的基础碳源培养基作为3-甲基-2-苯并噻唑酮腙-低乙醛合成法的培养基。
2)取样时间及接种量的优化：吸取含有5g/L乙醇的基础碳源培养基加入96深孔板。将菌液洗涤重悬、稀释至OD600＝5，分别按1、2、3％的接种量接入96深孔板。定期取样，检测乙醛生成情况。如图4所示，最终采用30℃，200rpm的培养条件，接入1％的OD600＝5的菌液，取样时间点确定为24、36、48、72、96、120h。
低乙醛合成能力啤酒工业酵母的高通量筛选：
将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤重悬，稀释至OD600为5时，按1％的接种量接入含有5g/L乙醇的基础碳源培养基的96深孔细胞培养板，加入枪头，并用6mm橡胶密封帽盖密封。每24h定期取样，检测乙醛生成情况。
检测方法：吸取25μL样品于96孔细胞培养板中，加入50μL，0.04g/L3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液，混合并静置20min；加入50μL，0.1g/L氯化铁溶液，混合并静置10min；加入125μL去离子水，混合均匀，610nm时测定吸光值。
最终实验结果可知，突变菌株的乙醛合成量均出现一定程度的下降，其中降幅最大的突变菌株已达54.17％，后续将对降幅效果最明显的突变菌株进行摇瓶验证。
实施例6强乙醛代谢-高通量筛选方法的优化
为有效防止乙醛的弥散，对乙醛标准溶液浓度进行优化。分别添加20、40、60、80、100、120、140、160、180、200mg/L的乙醛标准溶液。定期取样，观察乙醛的挥发情况，最终确定乙醛溶液的初始浓度为100mg/L。
表6强乙醛代谢法条件优化
强乙醛代谢能力啤酒工业酵母的高通量筛选：
将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤，离心弃上清。加入100mg/L乙醛标准溶液，保证60μL溶液的OD600为0.15。每隔30min取样检测乙醛余量。
检测方法：吸取25μL样品于96孔细胞培养板中，加入50μL，0.04g/L3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液，混合并静置20min；加入50μL，0.1g/L氯化铁溶液，混合并静置10min；加入125μL去离子水，混合均匀，610nm时测定吸光值。
最终实验结果可知，突变菌株的乙醛代谢量均出现一定程度的增加，其中增幅最大的突变菌株已达24.42％，后续将对增幅效果最明显的突变菌株进行摇瓶验证。
实施例7麦汁培养基的制备
45℃时，料水比为1：4加水投料。升温至48℃，保温30min；升温至65℃，保温40min；升温至72℃，保温10min；升温至78℃，保温10min，糖化结束。趁热过滤，煮沸1h，添加酒花(0.25‰)。调节浓度至12°P，得到澄清麦汁。
实施例8实验室摇瓶水平发酵验证
从平板上分别挑取上述2株复筛菌株的单菌落接入1mL麦汁培养基中，进行种子培养，25℃，220rpm培养12h。将上述1mL菌液转接入对应的9mL麦汁培养基中，20℃，220rpm培养12h。再将10mL菌液转接入对应的90mL麦汁培养基中，15℃，220rpm培养12h。静置取酵泥，接种于麦汁(1×106CFU/mL)。扣上发酵栓，液封。12℃静置培养8d，糖度为4°Bx左右时，前酵结束。4℃静置发酵7d，发酵成熟，后酵结束。
实施例9乙醛等主体风味物质的测定
取4.5mL啤酒发酵液，加入0.5mL 300mg/L 3-庚酮，采用顶空气相色谱仪进行测定。顶空进样器平衡温度：70℃，平衡时间：30min。传输线温度：130℃，进样时间：0.04min，进样口温度：200℃，检测器温度：250℃。色谱柱初始温度：40℃，以10℃/min程序升温至180℃。柱流量：1.2mL/min，N2流量：30mL/min，H2流量：47mL/min，空气流量：400mL/min。
表7发酵结束时酒样中的主要风味指标/(mg/L)
发酵结束时酒样中的主体风味物质(mg/L)
结果表明：突变菌株发酵液中乙醛含量均降低60％以上，且主体风味与出发菌株无显著差异。
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