快速简易提取厌氧真菌dna的方法及应用
阅读说明：本技术 快速简易提取厌氧真菌dna的方法及应用 (Method for quickly and simply extracting DNA of anaerobic fungi and application ) 是由 魏亚琴 王霄霄 苟琦敏 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及菌株DNA的提取技术领域,具体涉及快速简易提取厌氧真菌DNA的方法及应用。所述的方法包括如下步骤：(1)菌株培养；(2)收集菌体；(3)破壁；(4)抽提DNA；(5)沉淀DNA；所述的厌氧真菌DNA提取方法,提取DNA的纯度和浓度高,且采用液氮研磨冷冻和钢珠振荡破碎厌氧真菌细胞壁,破碎过程中所需样本量较少,不易损失样本,破壁效果良好,简单易行。同时,本发明所述的抽提缓冲液配方简单,成本低廉,提取DNA的效果良好；采用本方法提取厌氧真菌的DNA操作简易,实验重复性好,能够获得高质量的DNA,对于促进厌氧真菌的研究具有重大意义。(The invention relates to the technical field of extraction of DNA of strains, in particular to a method for quickly and simply extracting DNA of anaerobic fungi and application thereof. The method comprises the following steps: (1) culturing the strain; (2) collecting thalli; (3) breaking cell wall; (4) extracting DNA; (5) precipitating DNA; the method for extracting the DNA of the anaerobic fungi has high purity and concentration of the extracted DNA, and adopts liquid nitrogen grinding and freezing and steel ball oscillation to break the cell wall of the anaerobic fungi, so that the required sample amount is less in the breaking process, the sample is not easy to lose, the wall breaking effect is good, and the method is simple and easy to implement. Meanwhile, the extraction buffer solution has the advantages of simple formula, low cost and good DNA extraction effect; the method for extracting the DNA of the anaerobic fungi has the advantages of simple operation, good experimental repeatability, capability of obtaining high-quality DNA and great significance for promoting the research of the anaerobic fungi.)
技术领域
本发明涉及菌株DNA的提取技术领域，具体涉及快速简易提取厌氧真菌DNA的方法及应用。
背景技术
厌氧真菌的DNA提取是厌氧真菌分子生物学研究中一项重要工作。目前，真菌基因组提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。上述提取方法的提取步骤大体相似，关键在于如何有效的破碎细胞壁。目前，常用的厌氧真菌细胞破壁的方法有(1)经典的液氮研磨法。(2)液氮冻融(和玻璃珠振荡)法。该方法使用液氮，增加了成本及设备要求；(3)酶解法。用于丝状真菌破壁的酶比较昂贵，在处理大量样品时很不经济；(4)化学试剂(氯化苄)法。化学试剂存在环保上的隐患。
上述提取厌氧真菌DNA的方法大多为液氮研磨破碎厌氧真菌的细胞壁，但是破壁效果差，或用专用细胞破碎仪破碎厌氧真菌的细胞壁，然而细胞破碎仪的成本高，破壁过程繁琐，普及率不高。本领域技术人员最常用的真菌基因组提取方法是CTAB法，但CTAB法提取过程繁琐，所需试剂种类繁多，提取效果一般。针对上述技术问题，本领域技术人员研究出来了用于提取厌氧真菌DNA的试剂盒，提取效果较好，但是试剂盒的价格昂贵，且提取的次数有限，不能满足研究人员在研究过程中进行大量的实验或者是重复多次验证实验效果，且部分试剂盒在提取的过程中还需要补充配制加入指定试剂来提高提取效果。
发明人在研究过程中发现，厌氧真菌由于其细胞壁含有几丁质，又称壳多糖，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖。其不溶于一般的弱无机酸或有机溶剂，且不溶于碱液中，只溶于强无机酸。使得真菌的细胞壁破壁困难，本领域技术人员在提取厌氧真菌DNA的时候因无法破壁而导致提取效果不好。
针对上述技术问题，发明人为了更好地研究厌氧真菌的遗传信息，提取厌氧真菌基因组DNA。发现了一种适用于厌氧真菌基因组DNA提取的方法，所述的方法具有成本低、样本量少、提取快速、操作简便的特点，解决使用常规方法所获得的DNA样品提取时间长的问题。
发明内容
本发明的目的是针对目前提取厌氧真菌DNA技术的不足，提出的一种低成本的、所需样本量少、快速的、简便易行的、高效提取厌氧真菌DNA的新方法。
快速简易提取厌氧真菌DNA的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)菌株培养：将厌氧真菌接种在厌氧培养基里，加入复合抗生素，静置培养；
(2)收集菌体：将步骤(1)得到的菌液离心，取菌丝体；
(3)破壁：将步骤(2)得到的菌丝体被液氮快速研磨后取少量加入到离心管中，再加入钢珠，迅速冷却，振荡离心管，使厌氧真菌细胞壁破碎；
(4)抽提DNA溶液：向步骤(3)得到的溶液中加入抽提缓冲液，振荡，恒温水浴，加入乙酸铵，混匀，冷却，离心，取上清液，弃沉淀物和钢珠；上清液用等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液抽提2次，混匀，离心，去除杂蛋白；
(5)沉淀DNA：取步骤(4)得到的上层水相至另一离心管中，加入异丙醇，混匀，低温放置以沉淀DNA；离心，弃上清，用乙醇洗涤沉淀，用无菌双蒸水溶解沉淀，即得厌氧真菌DNA。
优选地，步骤(1)所述的厌氧培养基的配制步骤如下：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaHCO3 7.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液I的配制步骤如下：NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL；盐溶液II配制步骤如下：K2HPO4 4g，蒸馏水定容至1000mL。
优选地，步骤(1)厌氧真菌的接种量为10％v/v，复合抗生素的接种量为1％v/v，所述的复合抗生素具体为青霉素钠和硫酸链霉素，终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL。
优选地，步骤(2)所述的菌液离心的转速为5000g/min，离心时间为5min。
优选地，步骤(3)所述的冷却是液氮快速研磨菌丝体后将少量被研磨的菌丝体(约0.1g)置于离心管中，再加入钢珠2颗，将离心管放在液氮中冷却，振荡离心管，振荡过程中离心管保持冷冻状态，振荡时间为3-5min。
优选地，步骤(4)所述的抽提缓冲液的配制步骤如下：Tris(pH 8.5)2.4228g，NaCl1.461g，乙二胺四乙酸二钠0.9306g，十二烷基硫酸钠2g，蒸馏水定容100mL。并用HCl调pH值至8.5。
优选地，步骤(4)所述的乙酸铵加入量为浓度10M的乙酸铵200μL，Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液的加入量是与上清液等体积。(Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液的配制方法和体积比例是25mL Tris饱和酚：24mL氯仿：1mL异丙醇)。
优选地，步骤(5)所述的异丙醇加入量为上层水相的0.5-0.6倍体积，且所述的异丙醇于-20℃预冷。
优选地，步骤(5)所述的无菌双蒸水的加入量为50μL。
优选地，步骤(5)所述的乙醇加入量为1mL 75％。
本发明的有益效果是：本发明所述的厌氧真菌DNA提取方法，提取DNA的纯度和浓度高，且采用液氮研磨冷冻和钢珠振荡破碎厌氧真菌细胞壁，破碎的过程中所需样本量较少，不易损失样本，破壁效果良好，简单易行。同时，本发明所述的抽提缓冲液配方简单，成本低廉，提取DNA的效果良好。采用本方法提取厌氧真菌的DNA操作简易，实验重复性好，能够获得高质量的DNA，对于促进厌氧真菌的研究具有重大意义。
说明书附图
图1不同方法提取厌氧真菌总DNA的电泳图
1.常用CTAB法；2.植物基因组试剂盒提取法；3.本发明的方法；4.Fast DNA土壤试剂盒提取法
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下述实施例中所使用的培养基如下：
厌氧培养基配制步骤如下：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaHCO3 7.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液II配制步骤如下：K2HPO4 4g，蒸馏水定容至1000mL。
除氧。高温高压灭菌。
实施例一、厌氧真菌DNA的提取
(1)菌株培养：将提取DNA的厌氧真菌菌液5mL以10％v/v接种量接种到含有45mL厌氧培养基的厌氧瓶中，同时加入1％v/v复合抗生素(青霉素钠1600IU/mL和硫酸链霉素2000IU/mL)，静置，39℃厌氧培养72h，即得到提取基因的厌氧真菌菌液。
(2)收集菌体：将步骤(1)培养得到的厌氧真菌的菌液5000g/min离心5min，取菌丝体；(3)破壁：取步骤(2)得到的菌丝体快速液氮研磨后取少量(约0.1g)置于1.5mL离心管中，加入钢珠2个(d＝5mm)，用液氮迅速冷冻离心管，并在振荡器上振荡3-5min，振荡期间离心管保持冷冻状态，使厌氧真菌细胞壁破碎。
(4)抽提DNA溶液：在已破壁的样本中加入0.5mL抽提缓冲液，并在振荡器上振荡15min后，于65℃水浴锅中恒温水浴10min。然后加入200μL 10M乙酸铵，颠倒混匀，冰中放置8min，经13000rpm离心10min后取上清液，弃沉淀物和钢珠。
上清液用等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇溶液(25mL Tris饱和酚：24mL氯仿：1mL异丙醇混匀)抽提2次，混匀，离心5min，去除杂蛋白，得上层水相。
抽提缓冲液的配制：Tris(Tris-Hcl pH 8.5)2.4228g，NaCl 1.461g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)0.9306g，十二烷基硫酸钠(SDS)2g，蒸馏水定容100mL。并用HCl调pH值至8.5。
表1抽提缓冲液的各成分浓度
相对分子质量
浓度
单位
Tris
121.14
200
mM
NaCl
58.44
250
mM
EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)
372.24
25
mM
SDS(十二烷基硫酸钠)
288.38
2％
g/mL
(5)沉淀DNA：取步骤(4)得到得上层水相至另一离心管中，加入0.5-0.6倍体积于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min以沉淀DNA；经13000rpm离心15min，弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀2次，用50μL无菌双蒸水溶解沉淀。提取的厌氧真菌DNA经凝胶电泳检测后保存于-20℃备用。
实施例二、本发明所述提取方法的提取效果研究
通过采用不同的常用的3种方法所提取厌氧真菌的总DNA的纯度和浓度，以及扩增厌氧真菌的ITS1全序列的效果来进一步检测和综合评价不同方法所提取的厌氧真菌的总DNA的质量，进一步证明本专利方法提取厌氧真菌总DNA的优势。
每份DNA样品取3μL，用相应缓冲液作为空白对照，采用核酸蛋白仪测定DNA的浓度(ng·μL－1)和纯度A260/A280值，以及采用厌氧真菌的ITS1专用引物Neo18S For(5’-AAT CCTTCG GAT TGG CT-3’)和Neo5.8S Rev(5’-CGA GAA CCA AGA GAT CCA-3’)扩增厌氧真菌的ITS1全序列。每份样品重复测定3次，每次3个平行。结果如表2和图1所示。
表2不同方法提取厌氧真菌总DNA的优缺点对比
注：a，b，c，d表示统计学差异性(p<0.05)。
由表2和图1可以看出，通过和常用的3种提取厌氧真菌总DNA的方法作对比，比较所提取的厌氧真菌总DNA的纯度和浓度，以及扩增厌氧真菌的ITS1全序列的效果，还有所消耗时间、成本等方面综合考虑，可以证明：本发明的方法提取厌氧真菌的总DNA具有纯度高、浓度高、所需样本量少，扩增真菌ITS1效果较好，成本低等特点，可以用于提取厌氧真菌DNA。
综上所述，本发明所述的厌氧真菌DNA提取方法，提取DNA的纯度和浓度高，且采用液氮研磨冷冻和钢珠振荡破碎厌氧真菌细胞壁，破碎的过程中所需样本量较少，不易损失样本，破壁效果良好，简单易行。同时，本发明所述的抽提缓冲液配方简单，成本低廉，提取DNA的效果良好。采用本方法提取厌氧真菌的DNA操作简易，实验重复性好，能够获得高质量的DNA，对于促进厌氧真菌降解木质纤维素的研究具有重要意义。